Name: 環境DNA応用に関する種特異的定量PCRアッセイの開発と試験 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: 学ぶ環境DNA解析のための種特異的qPCRアッセイ設計法。プライマーとプローブの設計、in silicoおよびin vitroでの効率と特異性の検証、検出限界の決定、現場サンプルでの適用評価を含む完全プロトコルです。

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私たちは、プライマーの開発とテストを支援したアルヴィ・ワドゥドとトルディ・フロストに感謝します。本研究で報告されたアッセイ設計のための資金は、国防総省戦略環境研究開発プログラム(RC19-1156)によって提供されました。貿易、製品、または会社名の使用は記述目的のものであり、米国政府による承認を意味するものではありません。この調査中に生成されたデータは、USGS データ・リリース https://doi.org/10.5066/P9BIGOS5 として入手できます。

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著者らは利益相反を宣言しない。資金提供者は、研究の設計に何の役割も持っていなかった。データの収集、分析、または解釈に含まれる。原稿の執筆に。または結果を公開する決定に含まれます。

他の研究と同様に、対処する質問を定義することは最初のステップであり、eDNAアッセイの設計は研究の範囲に依存する26.例えば、研究または調査の目的が1種または数種を検出することである場合、標的プローブベースのアッセイが最善である。しかし、より大きな組み合えまたは種の集合体を評価することが目標である場合、高スループットシーケンシングメタバーコーディングアッセイの方が適しています。どのアプローチを取る必要が決定されたら、検定の設計、テスト、最適化を含むパイロットスタディを推奨します。24.アッセイの設計は、次の説明に従って種のリストから始まります。 図 1.このリストは、アッセイが特異性と適用される可能性のある地理的範囲の観点から、アッセイがどの程度優れたパフォーマンスを発揮するかを理解するための基礎となります。6,10.特定の地理的領域に対するアッセイを設計し、設計者がその地域の他の種に対する交差反応性のアッセイをより良くテストすることを可能にし、標的種が発生する可能性のある他の地域にアッセイを拡張することに関する限界を認識することが奨励される24.リストが完成すると、パブリック遺伝データベースからシーケンスをダウンロードできます。これらのデータベースは不完全であるため27、アッセイ設計で使用される配列のローカル参照データベースを完了するために、一つは、家の中でリスト上のできるだけ多くの種をシーケンスする必要があります。これらは増幅する最も可能性の高い非標的であるとして、密接に関連する種の共生を優先する。ターゲット種と同じ属または家族内のすべての種に焦点を当てることは、開始する良い場所です。密接に関連する種との比較は、標的種に特有の配列領域を同定するのに役立つ。これは、アッセイが他のシステムまたは場所でどのように実行されるかを知らせるのに役立ちます。ミトコンドリア領域は、より多様な種からのより多くの配列情報が、バーコード・オブ・ライフ・プロジェクトで使用されてきたミトコンドリア遺伝子で入手可能であり、ミトコンドリアDNAが核DNAよりもコピー/細胞にはるかに高い濃度で存在するため、アッセイ開発のための通常の選択である24,28,29.配列カバレッジは、遺伝的リポジトリデータベース内の分類によって異なるため、複数の遺伝子領域をさらなるアッセイ開発について評価する必要があります。この参照シーケンスのローカルデータベースが作成された後、配列配列データとコンピュータソフトウェアプログラムの手動可視化を組み合わせてプライマー/プローブアッセイを設計します。どのアッセイをテストするかを決定するために、ソフトウェアに厳密に依存すべきではありません。プライマーとプローブがターゲットと非ターゲットに座っている位置合わせを視覚的に検証して、PCRでどのように作用するかをよりよく理解することが重要です。最後にアッセイスクリーニングと最適化は、3つのレベル(インシリコ、インビトロおよびinitu)を含む6,7,24,25.シリコの設計とテストは、成功の可能性が高いアッセイの短いリストを生成するために重要ですが、経験的な(インビトロ)テストは、最高の実際のパフォーマンスでアッセイを選択するために重要です。インビトロでの最適化とアッセイのテストには、反応効率の測定とアッセイの感度と特異性の定義が含まれます。検出と定量の限界は、アッセイの開発において見落とされがちであるが、データ解釈にとって重要な2つのパラメータである。アッセイ用の標準曲線の複数の反復を実行することにより、LODとLOQを簡単に測定することができます1,5,30.アッセイのLODまたはLOQに関する結果について議論する研究はほとんどありませんが、Senguptaら(2019)は、アッセイのLODとLOQをデータ解釈とグラフィックスに組み込み、結果を明確に理解します。31.内部の肯定的な制御は、同様に設計されたアッセイに多重化されるべきである。サンプル内の PCR 阻害をテストしないと、偽陰性が発生する可能性があります。24,32.PCR阻害試験の最も簡単な方法として、標的アッセイによる多重化IPCアッセイの使用を提案する23.最後に、現場および実験室から採取したサンプルからのアッセイの現場試験では、環境試料中でターゲット増幅が確実に起こる必要がある24.
eDNAサンプルを用いた種特異的なプローブベースのqPCRアッセイの使用には制限があります。例えば、テスト用の複数のアッセイの設計は、配列の可用性によって制限され、アッセイ性能の面で妥協が必要な場合があります。これらの選択は、研究の目標によって導かれ、結果26と報告されなければならない。例えば、希少種の検出が目標であり、陽性が少ない場合、すべての検出がシーケンシングによって検証されるならば、不完全な特異性(すなわち、非標的種の増幅)を伴うアッセイを使用することができる。目標が種の地理的範囲を監視する場合、eDNA濃度データが不要な場合、不完全な効率を持つアッセイを使用し、データはパーセント検出としてのみ報告されます。さらに、可能な限り不可能な実験室ですべての潜在的な特異性がテストされない限り、アッセイの真の特異性を絶対的な確実性をもって知ることはできません。例えば、アッセイはクリンチ川のいくつかの淡水ムール貝種に対して設計され、テストされました。このアッセイを別の河川システムで使用するには、新しい場所の種のスイートに対してテストする必要があります。アッセイの発生中に試験されない種または集団内の遺伝的変異も特異性に影響を及ぼす可能性がある。最後に、アッセイが高い技術的性能を有することが確認された場合でも。フィールドで作業すると、条件が変化します。水流、pH、動物の挙動などの非アッセイ関連条件は、異なるeDNA採取および抽出プロトコルを使用できるようにeDNA検出可能性を変化させる可能性があります。最適化され、よく説明されたアッセイを使用すると、そのようなパラメータがeDNA検出に及ぼす影響を理解しやすくなります。
eDNAの分野は、探索的分析の段階を超えて、方法や技術の標準化を高める段階で成熟しています。これらの開発により、eDNAの技術、能力、および制限に関する理解が深まりつつあります。上記の最適化プロセスにより、アッセイの感度、特異性、再現性が向上します。eDNA法の改良と標準化の最終目標は、eDNAデータに基づいて推論を行う研究者の能力を向上させるとともに、結果に対するエンドユーザーとステークホルダーの信頼を高めることです。

研究者や管理者は、種検出のための環境DNAアッセイの使用にますます関心を持つようになっています。30年にわたり、核酸1,2の配列特異的検出および定量化のために、定量的またはリアルタイムPCR(qPCR/rtPCR)が多数の分野で使用されてきました。eDNA研究の比較的新しい分野では、eDNAサンプルの体積または重量当たりの標的DNAのコピーを定量化するための標準曲線を用いたアッセイの使用が、今や日常的な実践となっている。ミトコンドリアのDNA配列は、ミトコンドリアゲノムが細胞当たり数千部に存在するため、一般にeDNAアッセイで標的とされているが、核DNAまたはRNA配列のアッセイも可能である。eDNAサンプルに対して公開されたアッセイは、必ずしも性能が等しいとは限らないということを理解することが重要です。標的種のDNA(特異性)と低量の標的DNA(すなわち、感度)の検出におけるアッセイの信頼性は、アッセイの設計、選択、最適化、試験方法の違いにより大きく異なる可能性があります。アッセイ性能の定量的尺度報告は以前はほとんど見落とされてきたが、最近ではアッセイ開発の透明性を向上させる基準が3、4、5、6、7、8に浮上している。
eDNA調査結果の設計と解釈の研究に役立つアッセイ性能の最適化と報告。非標的種DNAとの交差反応は偽陽性検出につながる可能性があるが、感度の低いアッセイは、サンプル中に存在する場合でも標的種DNAを検出できない可能性がある(偽陰性)。アッセイ感度と選択性を理解することは、希少種の検出に必要なサンプリング作業を知らせるのに役立ちます。eDNAには多くの自然な変動源があるため、eDNAアッセイ3を完全に最適化し、特性を付け込むなど、制御可能な変動源を可能な限り制限する必要があります。
アッセイの特異性や感度に直接影響する条件は、アッセイの性能を変えます。これは、異なる実験室の条件下で発生する可能性があります (すなわち、異なる試薬、ユーザー、機械など)。したがって、このプロトコルは、新しい条件下でアッセイを適用する際に再検討する必要があります。文献に良く特徴付けられるアッセイでさえ、新しい実験室で採用されたとき、または異なる試薬(例えば、マスターミックス溶液)5,9を使用する場合に、試験および最適化されるべきである。アッセイ特異性は、異なる地理的領域に適用されると変化する可能性があり、アッセイが検査されていない非標的種を含む新しい生物学的コミュニティからのサンプルにアッセイが適用されているため、標的種の遺伝的変異が生じる可能性がある。再び、アッセイは新しい場所で使用する場合に再評価されるべきである。フィールド PCR 阻害剤はサンプルに存在する可能性が高いため、フィールド条件は実験室の条件とは異なります。PCR阻害剤は、増幅反応に直接影響を与え、アッセイ性能に影響を与えます。このため、eDNAアッセイを開発する際には、内部の正のコントロールが必要です。
最後に、現場の環境条件は、標的種のDNA分子に影響を与え、DNA分解、輸送および保持を通じて捕捉する可能性があります。さらに、DNAの収集と抽出のための異なるプロトコルは、その効率とDNAを保持する能力が異なります。しかし、これらのプロセスはeDNAの検出可能性に影響を与えますが、分子アッセイの性能には影響しないことに注意することが重要です。したがって、フィールドサンプル中の標的種からのDNAの検出可能性は、qPCRアッセイの技術的性能と、フィールド条件および収集、保存、抽出プロトコルの両方の機能である。よく特徴付け、高度に実行アッセイを使用する場合、ユーザーはアッセイの能力に自信を持つことができます。研究者は、eDNA検出に影響を与える外部アッセイ因子(すなわち、環境変数、捕獲または抽出プロトコルの違い)の理解に集中できるようになりました。
ここでは、厳密な設計と最適化によるアッセイ技術性能に特に焦点を当てています。米国クリンチ川でサンプリングした水から淡水ムール貝(アクチナガイアス・靭帯)を検出するために開発されたプローブベースのアッセイを用いてプロトコルを実証します。最近、Thalingerら(2020)は、標的eDNAアッセイの検証のためのガイドラインを提示した。私たちのプロトコルに従ったアッセイ設計は、Thalingerらのレベル4にアッセイに加えて、レベル5 6に向けた追加のステップをもたらすでしょう。この時点で、アッセイの技術的性能が最適化され、実験室および現場でのアプリケーションでの定期的な使用に備える。実験室でのアッセイのさらなる使用、メソコスム、およびフィールド実験は、次に、eDNA検出および検出性に影響を与える因子に関する質問に対処することができる、レベル5検証6のための最終ステップ。

<table><tbody><tr><td>96カバー付きリバーシブルラックを配置する</td><td>Globe Scientific</td><td>456355AST</td><td></td></tr><tr><td>クリーングローブ(ラテックス、ニトリルなど)</td><td>Kimberly-Clark</td><td>43431, 55090</td><td></td></tr><tr><td>CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System</td><td>Bio-Rad</td><td>1855196</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand プレミアムマイクロ遠心チューブ: 1.5mL</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>5408129</td><td></td></tr><tr><td>フィッシャーブランド プレミアムマイクロ遠心チューブ: 2.0mL</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>2681332</td><td></td></tr><tr><td>ハードシェル 96 ウェル PCR プレート、ロープロファイル、薄壁、スカート、ホワイト/clear</td><td>Bio-Rad</td> <td>#HSP9601</td><td></td></tr><tr><td>IPC フォワードおよびリバースプライマー</td><td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td><td>none</td><td>カスタム製品</td></tr><tr><td>IPC PrimeTime qPCR Probes</td><td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td><td>none</td><td>カスタム製品</td></tr><tr><td>IPC Ultramer DNA オリゴ合成テンプレート</td><td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td><td>なし</td><td>カスタム製品</td></tr><tr><td>Labnet MPS 1000 PCRプレート用コンパクトミニプレートスピナー遠心分離機</td><td>Labnet</td><td>C1000</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ遠心分離機</td><td>各種</td><td></td> <td>1.5mL と 2.0mL のチューブを保持するマイクロ遠心分離機は、通常は問題ありません。</td></tr><tr><td>Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical</td><td>Bio-Rad</td><td>MSB1001</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-Free Water (not DEPC Treated)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Tips GP LTS 1000 &micro;L F 768A/8</td><td>レイニン</td><td>30389272</td><td></td></tr><tr><td>ピペットチップ GP LTS 20 &micro;L F 960A/10</td><td>レイニン</td><td>30389274</td><td></td></tr><tr><td>ピペットチップ GP LTS 200 &micro;L F 960A/10</td><td>レイニン</td><td>30389276</td><td></td></tr><tr><td>ピペット</td><td>レイニン</td><td>各種</td><td>ラボの好みに応じて、手動または電動ピペットを様々な最大容量で使用することができます。</td></tr><tr><td>TaqMan Environmental Master Mix 2.0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4396838</td><td></td></tr><tr><td>ターゲットフォワードおよびリバースプライマー</td><td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td><td>none</td><td>カスタム製品</td></tr><tr><td>Target PrimeTime qPCR Probes</td><td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td><td>none</td><td>カスタム商品</td></tr><tr><td>Target synthetic gBlock gene fragment</td><td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td><td>qPCR</td><td>標準希釈シリーズに使用</td></tr><tr><td>TEバッファー</td><td>Invitrogen</td><td>AM9849</td><td></td></tr><tr><td>VORTEX-GENIE 2 VORTEX MIXER</td><td>Fisher Scientific</td><td>50728002</td><td></td></tr></tbody></table>

環境dna応用に関する種特異的定量pcrアッセイの開発と試験

Development and Testing of Species-specific Quantitative PCR Assays for Environmental DNA Applications

漁業や野生動物保護管理を支援するために、種の存在を検出し、監視するための新しい非侵襲的な方法が開発されています。マクロビオタを検出するための環境DNA(eDNA)サンプルの使用は、急速に普及し、国家管理プログラムで実施されている方法の一つです。ここでは、プローブベースの定量PCR(qPCR)アプリケーションに対する種特異的標的アッセイの開発に焦点を当てています。プローブベースのqPCRを使用すると、プライマー単独で可能な限り特異性が高くなります。さらに、サンプル中のDNAの量を定量化する能力は、eDNAの生態と、現場におけるeDNA検出パターンの解釈を理解するのに役立ちます。環境試料から標的種を検出する感度と特異性を確保するために、これらのアッセイの開発と試験には慎重に検討が必要です。このプロトコルでは、標的種の検出のためのプローブベースのアッセイを設計およびテストするために必要な手順を説明します。シーケンスデータベースの作成、アッセイ設計、アッセイの選択と最適化、テストアッセイ性能、フィールド検証など。これらの手順に従うと、効率的で、敏感で、かつ、信頼できる特定のアッセイを実現するのに役立ちます。このプロセスは、米国クリンチ川で見られる淡水ムール貝種であるマケット(アクチナガイアス・シネラシナ)の集団のために設計されたアッセイで実証しています。

環境DNAアッセイでは、現場データの収集を開始する前に、厳格な設計、テスト、最適化、検証が必要です。ここでは、環境試料から標的種DNAの検出と定量を行うための、種特異的なプローブベースのqPCRアッセイを設計する各ステップを通じてユーザーを取るプロトコルを提示する。

環境DNA応用に関する種特異的定量PCRアッセイの開発と試験

New, non-invasive methods for detecting and monitoring species presence are being developed to aid in fisheries and wildlife conservation management. The ...

環境DNAデータを適切に解釈するためには、十分に最適化されたアッセイが不可欠です。このプロトコルでは、このようなアッセイを開発するために必要な設計および試験手順について説明します。一般に、環境DNAは、特定の種または種のスイートを検出するための非侵襲的な方法です。従来の調査方法に比べてコストを削減し、感度も高くなる可能性があります。この方法は、関心のある種からのDNAの検出を通じて保全と野生生物の管理を支援することができ、サンプリングされた領域にその種が存在する可能性を推測することができます。定量PCRは感度が高いため、コンタミネーションが発生しやすく、コンタミネーションが発生したステップを特定するためにネガティブコントロールが必要です。eDNAは、専門用語や略語が散りばめられた分野です。分子生物学やqPCRを学んでいない方でも、視覚的なデモンストレーションは、概念化からデータ生成までの実験デザインの計画に役立ちます。この手順を実演するのは、私たちの研究室の生物学者であるDannise Ruiz Ramosと、学生の実験室補助者であるTrudi Frostです。まず、NCBIのヌクレオチドデータベースを使用して、複数の遺伝子領域から目的の種の配列を検索し、ダウンロードします。仕様に一致するすべてのシーケンスを選択し、[Send To]を選択します。[Complete Record]、[File]、[Download Format]をGenBankまたはFASTAとして選択し、[Create File]を選択します。これらのシーケンスがコンピューターに保存されました。対象のすべての種について、これらの手順を繰り返します。各遺伝子領域の配列は、別々に解析されるため、別々のファイルに保存してください。各遺伝子領域の配列を個別にアラインメントするには、ダウンロードした配列ファイルをGeneious Primeソフトウェアなどの配列アラインメントプログラムにインポートします。遺伝子領域ごとに個別のフォルダを作成し、1つの遺伝子領域の配列を含むフォルダ内のすべての配列を選択します。Multiple Alignment(マルチプルアラインメント)ツールを使用して、選択したシーケンスのGeneiousやMUSCLEなどのヌクレオチドアラインメントを作成します。アラインメントされた配列データの可視化により、アッセイ設計に有望な領域を選択します。対象種について利用可能な配列データが多く、種間の分岐性が高く、種バリエーションが少ない領域を選択します。次に、アッセイプライマーとプローブを設計します。qPCRアッセイ設計ソフトウェアを使用して、5セットのqPCRアッセイを設計します。選択したシーケンスを「シーケンス入力」ボックスに貼り付けます。線形によってスペースが作成された場合は、シーケンスからそれらを削除します。「Choose Your Design」オプションでqPCR 2プライマープローブを選択し、推奨アッセイをダウンロードしてください。最初のアッセイのフォワードプライマーから配列をコピーし、以前に作成したアラインメントでこのプライマー配列を検索します。Geneious Primeを使用している場合は、Annotate Predictツールを使用して、プライマー領域をアラインメントに追加します。これは、すべてのプライマーとプローブの組み合わせに対して行います。これらのアライメント領域を検査し、対象種内および共起種内でのばらつきがないか調べます。NCBIのPrimer-BLASTを使用して、プライマーをin silicoでテストします。プライマーパラメータの下の私自身のプライマーボックスを使用してプライマーを貼り付けます。「Primer Pair Specificity Checking Parameters」オプションで、「Database」として「NR」を選択し、「Iolite」ボックスに目的の生物の分類順序またはファミリーを入力します。選択したプライマーが非標的分子種を増幅する可能性が低いことを確認してください。in vitroでアッセイ効率を試験するには、標準曲線を作成し、その曲線の効率と線形範囲を決定します。標的配列を含む合成DNA標準試料の少なくとも6回の10倍希釈を、1反応あたり約1〜100万コピーで試験します。qPCR ソフトウェアを使用して、各標準の CQ 値を Y 軸にプロットし、初期標準濃度の log base 10 を反応ごとのコピー数で X 軸にプロットします。qPCRソフトウェアは自動的に線形回帰を実行します。回帰の傾きから効率を計算します。標準曲線にバイアスや性能の低下がないか、効率とR二乗値で測定して目視で検査します。内部ポジティブコントロールを使用して、感度の低下や偽陰性につながる可能性のある実際のフィールドサンプルのPCR阻害をテストします。各アッセイの検出と定量の限界を決定します。非標的分子種でアッセイを試験して特異性を検証し、IPCマルチプレックスでアッセイが良好に機能することを確認します。感度、特異性、効率が優れたアッセイは、次のステップに進むことができます。アッセイのin situ試験を行うには、複数の水サンプルを採取し、それらをqPCR用に処理します。定量PCRアッセイを実行し、eDNA濃度と検出頻度を、発生量と存在量の既知の部位の違いと比較します。シーケンシングにより、すべての検出を確認します。クリンチ川に生息するすべてのUnionidae種の利用可能な配列をダウンロードし、アラインメントしました。複数のアッセイを設計した後、5セットのプライマーとプローブをアラインメントに追加して、視覚的評価を行いました。プライマーセットとプローブセットは、in silicoおよびin vitroで試験しました。ラボでは、特異性を検証するために、利用可能な27種のDNA抽出物を使用してすべてのアッセイを試験しました。1つのアッセイで、標的種のみを増幅することに成功しました。ここでは、良好な効率とR二乗値で成功したアッセイを示しています。選択したアッセイのLODとLOQは、どちらも反応あたり5コピーでした。対照的に、効率の悪い標準曲線を生成したアッセイは破棄されました。質の高いqPCRでは、標準希釈液は、濃度の10倍の差ごとに約3.3サイクルの等間隔のサイクル定量値で増幅されます。qPCRが不十分な場合、標準試料は希釈間のサイクル定量値に不均一な変動を示すことがあります。未知サンプルの IPC 増幅は、ネガティブテンプレート制御 IPC の結果と比較する必要があります。サンプルにインヒビターが存在しない場合、すべての IPC 増幅はプロット内で緊密にグループ化され、サイクル定量値はテンプレートなしコントロールとほぼ同じになります。アッセイのin situ試験では、位置特定サイトには、淡水産貝の床の底、海岸近くの筋肉床の底、川のベッドの下流100メートル、ストリームのベッドの下流500メートル、および海岸近くのベッドの下流500メートルが含まれていました。環境DNAの定量的PCRアッセイは、侵入種と絶滅危惧種の両方のモニタリングに役立つだけでなく、個々の生物を物理的に捕捉することなく、種検出の空間的および時間的変化の理解を深めることができます。

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前のDNA精製せずに植物や動物のサンプルの遺伝子型

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遺伝子組み換えアノフェリン蚊集団におけるインデル変異を検出するデジタル液滴PCR

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抗菌薬耐性の包括的評価のための廃水からの低分子量DNAの抽出の強化 

信頼性が高く正確な現場展開可能なDNA分析は、多くの産業にとって非常に重要です。本論文では、現場での環境微生物分析のための2つの方法を提案します。1) 生物学的抽出フィールドキットを用いた環境サンプルから微生物DNAを分離する方法、2) フィールドqPCRユニットを用いたDNA解析です。...

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鯨類モニタリングのためのホエールウォッチング船からの環境DNAサンプリング

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別の雑草種の堅牢な除草剤抵抗性試験のためのプロトコル

学ぶ環境DNA解析のための種特異的qPCRアッセイ設計法。プライマーとプローブの設計、in silicoおよびin vitroでの効率と特異性の検証、検出限界の決定、現場サンプルでの適用評価を含む完全プロトコルです。

環境DNA応用に関する種特異的定量PCRアッセイの開発と試験

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