Name: 実験的自己免疫性ブドウ膜炎:眼内炎症性マウスモデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: 学ぶ実験的自己免疫性ブドウ膜炎のマウスモデル構築法。眼内炎症の病態解明と新薬効果評価に有用な非侵襲的エンドスコピー技術を用いた疾患進行モニタリング手法を解説します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

JGは、CBを支援するためにUCLインパクトスチューデントシップとローズツリートラストの資金を授与されました。VCは、Akari Therapeutics Inc.から研究協力助成金を受けていました。UCL眼科研究所の生物学的サービスユニット、特にアリソンオハラさんと彼女のチームの技術サポートに感謝します。

すべての実験は、1986年の英国動物(科学的手順)法、および制度的動物福祉および倫理審査機関(AWERB)のガイドラインに従って実施されました。
1. C57BL/6Jマウスの収容
<ol><li>ハウスマウスを特定の病原体のない環境下で、12時間の明暗サイクルで、食物および水を 自由摂取で利用可能とする。</li>
	<li>成人女性C57BL / 6Jですべての実験を実行します(ブドウ膜炎患者では女性から男性の発生率が1.4対1であるため、女性が優先的に選択されます)。6〜8週齢の雌C57BL / 6Jマウスを体重と年齢でランダム化します。ケージあたり5〜6匹のマウスのグループで、個別に換気されたケージ(IVC)にマウスを収容します。</li>
</ol>2. C57BL/6マウスの免疫
<ol><li>IRBP1-20 - CFAエマルジョン調製 注:エマルジョン調製は、疾患の再現性と発生率に不可欠です。そのため、準備プロセス全体および実験全体で一貫性を維持するためにあらゆる努力を払う必要があります。エマルジョンを調製するとき、損失は事前にすべての試薬の計算で考慮されるべきです。この損失は、免疫化が計画されているマウスの数に基づいて、約1.5倍(または準備された量の50%追加)になる可能性があります。以下の例を参照してください。10匹のマウスを免疫するには、15匹のマウスを準備し、400 μg(マウス20 gあたりのペプチド)x 15 マウス= 6 mgを使用します。各マウスは、免疫のために200 μL(合計3 mL)を受け取る必要があります。最終容量は、ペプチド溶液とCFAの1:1の比率で構成されているため、1.5 mLのペプチド溶液と1.5 mLのCFAが含まれます。<ol><li>無菌技術を使用して、層流キャビネット内のすべての滅菌溶液を調製します。</li>
		<li>ヒトIRBP1-20 (LAQGAYRTAVDLESLASQLT)凍結乾燥ペプチドの所望の量(マウス20gあたり400μg)を秤量する。ペプチドを100%DMSOに溶解します。ストックは凍結乾燥の形で-20°Cで保存してください。 注意: 粉末が完全に溶解していることを確認するには、各フレークが最初にDMSOと接触し、残留固体の兆候を示さないようにする必要があります。PBSを少しずつ追加して、最終的なボリュームに到達します。渦と混ぜないで、代わりにピペットで穏やかに攪拌してください。DMSOの最終濃度は、全ペプチド調製量の1%を超えてはなりません。底がテーパー状の20 mLプラスチックチューブでエマルジョンを調製すると、凍結乾燥粉末へのDMSOのアクセス性が向上します。</li>
		<li>すでに1.5 mg/mLの死滅した 結核菌 を添加したCFAにDMSO-PBSペプチド溶液を1:1 v/vで添加し、最終濃度2.5 mg/mLにします。滴下し、穏やかかつ頻繁にピペッティングして、粘性のある均一に分布したエマルジョンを形成します。</li>
		<li>1000 μLのピペット(さらなる損失を防ぐために700 μLに設定)とピペットを使用してペプチド溶液とCFAを通気し、クリーミーで濃厚な粘稠度を生成します。この技術では、ピペットを使用して、目的の厚さに達するまで上下に繰り返し吸引します。最適な結果を得るには、注射前に抗原溶液とアジュバントが完全に混合されていることを確認してください。</li>
	</ol></li>
	<li>百日咳毒素の腹腔内注射<ol><li>1.5 μgの 百日咳 菌毒素を、1%マウス血清を添加した100 μLのRPMI 1640培地に懸濁します11。</li>
		<li>滅菌注射器と23G針でi.p.注射を行います。 注:注射部位への障害を避けるために、百日咳毒素は抗原を注射する前に投与する必要があります。</li>
		<li>各マウスを一時的に別々のケージに移し、 百日咳菌 毒素の100 μL i.p.注射を1回受けます。</li>
	</ol></li>
	<li>IRBPエマルジョンの皮下注射<ol><li>次に、IRBPエマルジョンを皮下注射する。このプロセスでは、健康と安全の規制に従って適切に保護された2人の動物取扱者が必要です。</li>
		<li>訓練を受けた1人に、ケージの上部にあるマウスを首筋のような姿勢で軽く拘束し、胃を下に向けてもらい、もう1人の訓練を受けた人に皮膚をつまんで首の後ろにテントのような構造を形成し、針を挿入して指と親指の間に挿入できるようにします。 注意: 針刺しによる怪我の危険があります。</li>
		<li>針を配置したら、200 μLのIRBPエマルジョンを注入します。針を抜くときは、針頭を回転させて皮膚を閉じてから引き抜き、その後注射部位に圧力を加えて乳液の逆流を防ぎます。 注意:エマルジョンは、刺激を引き起こし、より重篤な場合には病変が発生する可能性があるため、マウスの皮膚や毛皮と接触してはなりません。これが発生した場合は、70%エタノールを使用してその領域を直ちに完全に拭いてから乾燥させる必要があります。 注:研究の最後に検査のために排液リンパ節が必要な場合、注射部位は異なります。この場合、脇腹の両側に100μLを皮下注射します。これにより、排出中の鼠径リンパ節でより強い反応が得られ、収穫時に切除することができます。ただし、意図した結果がEAUの発症のみである場合は、複数の注射部位からの不快感を避けるために、首の後ろに200μLの単回注射が好ましい。</li>
	</ol></li>
</ol>3.臨床評価-マウス眼底検査
注:臨床疾患は、眼底検査、眼底鏡を使用した明視野ライブイメージング、および視覚化に使用されるDiscoverソフトウェアを使用してスコアリングされます。
<ol><li>疾患発症時(12〜14日目)に、ケタミン(50 mg / mL)とドミトール(メデトミジン;1 mg / mL)の両方を組み合わせて全身麻酔下でマウスを鎮静させます。.1部ドミターを希釈する。ケタミン1.5部と滅菌注射水2.5部を、次に腹腔内に30gあたり100μLを注入します。上記の麻酔の組み合わせには、1mLの滅菌注射器と23Gの針を使用してください。</li>
	<li>これに続いて、マウスを監視して、すべての反射が失われ、刺激に反応しなくなることを確認します。</li>
	<li>i.p.注射を受けた直後、マウスがまだ首筋に保持されている間に、瞳孔拡張のために1%トロピカミドと2.5%フェニレフリンを各眼に局所的に塗布します。.両方の拡張液で角膜を完全に覆うことを目指します。瞳孔が完全に拡張するまでに数分かかる場合があります。</li>
	<li>その後、目の粘性軟膏をたっぷりと塗り、目を完全に潤滑して水分補給するために、イメージングプロセス全体を通して維持します。</li>
	<li>それまでの間、ソフトウェア(ディスカバーなど)を開き、明視野下で画像をキャプチャするようにファンドスコープ(マイクロンなど)を設定します。個々のマウスにフォルダを割り当て、撮影した各目に応じてRまたはLで画像にラベルを付けます。</li>
	<li>ライブビジュアライゼーション用の専用ステージにマウスを取り付け、網膜に完全にアクセスできるように顕微鏡を配置します。</li>
	<li>疾患を正確に表現するには、視神経乳頭に加えて末梢のすべてのコーナーをカバーする網膜領域全体の画像を撮ります。これを実現するには、接眼レンズ全体を調整します。イメージングプロセス全体を通して、目が常に完全に潤滑されたままであることが重要です。一定の割合で目の軟膏を補充することによってこれを確実にしてください。</li>
	<li>この段階でセクション4(下記)を参照して、フルオレセイン血管造影を実行してください。</li>
	<li>すべてのイメージングが完了したら、麻酔薬逆転鎮静剤(5 mg / mL抗セダン)を注射可能な水で希釈し、0.1 mg / kgのi.p.で投与します。マウスをケージに戻し、回復するまで湿らせた食事にアクセスできる予熱したマットの上に置きます。完全な回復は、全身の動きと安定した歩行でケージの周りを歩くことを特徴としていますが、通常は数時間かかります。</li>
	<li>指定された実験エンドポイント(例:.、21〜23日目)で、手順4.1〜4.5を繰り返し、網膜領域全体の写真を再度撮り、視神経乳頭と周辺のすべてのコーナーを覆い、疾患の正確な表現をキャプチャします。</li>
</ol>4.フルオレセイン血管造影
<ol><li>これらの動物の血管漏れを測定するには、麻酔下で、各マウスに2%フルオレセインを首の後ろに皮下注射し、網膜がライブ画像の中央に集中するように配置します。</li>
	<li>眼底鏡を465〜490nmの青色光励起フィルターに設定します。励起フルオレセインから捕捉される光は、520〜530nmの間である。</li>
	<li>フルオレセイン注射後1.5分後、各網膜の写真を撮り、7分後に再度繰り返します。 注:これらのイベントではタイミングが重要であり、両方をキャプチャできない場合は、片方の目を画像化するだけです。</li>
</ol>5.臨床疾患スコアリング
<ol><li>視神経乳頭の炎症、網膜血管カフ、網膜組織の浸潤および構造的損傷の重症度に基づいて臨床評価を行います。</li>
	<li>これらのパラメータのそれぞれに0から5までのスケールでスコアを授与し、集合的な合計は眼全体の臨床疾患を表しており、眼あたり最大スコアは20です。 表1 は、スコアリング基準のガイドとして使用できます。</li>
</ol>6.組織学および組織学的スコアリング
<ol><li>頸部脱臼によってマウスを安楽死させた後、眼全体に簡単にアクセスできるようにまぶたを離して目を除核します。</li>
	<li>次に、眼窩結合組織と視神経をつかむことを目的として、湾曲した鉗子を地球の後ろに置きます。地球を圧迫しないように注意してください。</li>
	<li>固定するには、網膜剥離を最小限に抑えるために最低15分間眼を4%グルタルアルデヒドに入れ、次に少なくとも24時間10%ホルムアルデヒドに移します。</li>
	<li>パラフィンへの包埋、ミクロトームでの切片作成、および標準プロトコルに従って染色を行います。3〜4μmの断面厚さは、あらゆるタイプの染色に推奨されます。</li>
	<li>ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色の標準プロトコルを使用して眼の組織学的検査を実施します。</li>
	<li>0〜4のスケールでスコアを割り当て、EAUスコアリングの基準に従って、網膜および脈絡膜内の免疫細胞浸潤の程度、網膜層の破壊、肉芽腫形成の程度、および網膜剥離の程度に基づいて、網膜損傷を示し、前述のように(Agarwal 2013)および表2に要約した11。</li>
</ol>

<ol><li>Lyu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TMP778%2C+a+selective+inhibitor+of+RORgammat%2C+suppresses+experimental+autoimmune+uveitis+development%2C+but+affects+both+Th17+and+Th1+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">TMP778, a selective inhibitor of RORgammat, suppresses experimental autoimmune uveitis development, but affects both Th17 and Th1 cell populations.</a> The European Journal of Immunology. 48, 1810-1816 (2018).</li>
<li>Klaska, I. P., Forrester, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+autoimmune+uveitis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Design%22%5BJournal%5D)">Mouse models of autoimmune uveitis.</a> Current Pharmaceutical Design. 21, 2453-2467 (2015).</li>
<li>Eskandarpour, M., Alexander, R., Adamson, P., Calder, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+Inhibition+of+Bromodomain+Proteins+Suppresses+Retinal+Inflammatory+Disease+and+Downregulates+Retinal+Th17+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Pharmacological Inhibition of Bromodomain Proteins Suppresses Retinal Inflammatory Disease and Downregulates Retinal Th17 Cells.</a> The Journal of Immunology. 198, 1093-1103 (2017).</li>
<li>Mochizuki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+and+clinical+study+of+FK506+in+uveitis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Preclinical and clinical study of FK506 in uveitis.</a> Current Eye Research. 11, Suppl 87-95 (1992).</li>
<li>Nguyen, Q. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravitreal+Sirolimus+for+the+Treatment+of+Noninfectious+Uveitis%3A+Evolution+through+Preclinical+and+Clinical+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Intravitreal Sirolimus for the Treatment of Noninfectious Uveitis: Evolution through Preclinical and Clinical Studies.</a> Ophthalmology. 125, 1984-1993 (2018).</li>
<li>Leal, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-TNF+Drugs+for+Chronic+Uveitis+in+Adults-A+Systematic+Review+and+Meta-Analysis+of+Randomized+Controlled+Trials%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Medicine+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">Anti-TNF Drugs for Chronic Uveitis in Adults-A Systematic Review and Meta-Analysis of Randomized Controlled Trials.</a> Frontiers in Medicine (Lausanne). 6, 104(2019).</li>
<li>Chen, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+distinct+IFN-%3F%2B+IL-17A%2B+Th+cells+in+experimental+autoimmune+uveitis%3A+T-cell+heterogeneity%2C+migration%2C+and+steroid+response%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Functionally distinct IFN-?+ IL-17A+ Th cells in experimental autoimmune uveitis: T-cell heterogeneity, migration, and steroid response.</a> European Journal of Immunology. 50 (12), 1941-1951 (2020).</li>
<li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clinical+grading+system+for+retinal+inflammation+in+the+chronic+model+of+experimental+autoimmune+uveoretinitis+using+digital+fundus+images%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">A clinical grading system for retinal inflammation in the chronic model of experimental autoimmune uveoretinitis using digital fundus images.</a> Experimental Eye Research. 87, 319-326 (2008).</li>
<li>Copland, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+time-course+of+experimental+autoimmune+uveoretinitis+using+topical+endoscopic+fundal+imaging+with+histologic+and+cellular+infiltrate+correlation%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">The clinical time-course of experimental autoimmune uveoretinitis using topical endoscopic fundal imaging with histologic and cellular infiltrate correlation.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49, 5458-5465 (2008).</li>
<li>Dick, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Doyne+lecture+2016%3A+intraocular+health+and+the+many+faces+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Eye+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Doyne lecture 2016: intraocular health and the many faces of inflammation.</a> Eye (Lond). 31, 87-96 (2017).</li>
<li>Agarwal, R. K., Silver, P. B., Caspi, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+models+of+experimental+autoimmune+uveitis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Rodent models of experimental autoimmune uveitis.</a> Methods in Molecular Biology. 900, 443-469 (2012).</li>
<li>Caspi, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+look+at+autoimmunity+and+inflammation+in+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clininical+Investigation%22%5BJournal%5D)">A look at autoimmunity and inflammation in the eye.</a> Journal of Clininical Investigation. 120, 3073-3083 (2010).</li>
<li>Caspi, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+experimental+autoimmune+uveitis%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Research%22%5BJournal%5D)">Mouse models of experimental autoimmune uveitis.</a> Ophthalmic Research. 40, 169-174 (2008).</li>
<li>Shao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+chronic+experimental+autoimmune+uveitis+%28EAU%29+of+the+C57BL%2F6+mouse+induced+by+adoptive+transfer+of+IRBP1-20-specific+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Severe chronic experimental autoimmune uveitis (EAU) of the C57BL/6 mouse induced by adoptive transfer of IRBP1-20-specific T cells.</a> Experimental Eye Research. 82, 323-331 (2006).</li>
<li>Horai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbiota-Dependent+Activation+of+an+Autoreactive+T+Cell+Receptor+Provokes+Autoimmunity+in+an+Immunologically+Privileged+Site%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Microbiota-Dependent Activation of an Autoreactive T Cell Receptor Provokes Autoimmunity in an Immunologically Privileged Site.</a> Immunity. 43, 343-353 (2015).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+induced+vs.+spontaneous+models+of+autoimmune+uveitis+targeting+the+interphotoreceptor+retinoid+binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of induced vs. spontaneous models of autoimmune uveitis targeting the interphotoreceptor retinoid binding protein.</a> PLoS One. 8, 72161(2013).</li>
<li>Chen, J., Qian, H., Horai, R., Chan, C. C., Caspi, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+optical+coherence+tomography+and+electroretinography+to+evaluate+retinal+pathology+in+a+mouse+model+of+autoimmune+uveitis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Use of optical coherence tomography and electroretinography to evaluate retinal pathology in a mouse model of autoimmune uveitis.</a> PLoS One. 8, 63904(2013).</li>
<li>Harry, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+autoimmune+retinal+disease+by+lovastatin+does+not+require+Th2+cytokine+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Suppression of autoimmune retinal disease by lovastatin does not require Th2 cytokine induction.</a> Journal of Immunology. 174, 2327-2335 (2005).</li>
</ol>

著者は、この作品で宣言する利益相反はありません。

実験動物モデルは、疾患の病因の研究や新しい治療パラダイムの前臨床試験に必要なツールです。現在のプロトコルでは、眼内炎症性ブドウ膜炎の実験モデルであるEAUを誘導、モニタリング、およびスコアリングするための方法論について説明しました。このEAUモデルは、全ての手順が本明細書に概説されたプロトコールに従って実施された場合に95%を超える疾患発生率を有し、慢性の単相性EAUの発症をもたらす。この発生率レベルを達成するために、抗原調製とエマルジョンの注射の重要性を強調します。動物におけるEAUの主な特徴は、網膜および/または脈絡膜炎症、網膜血管炎、光受容体破壊および視力喪失であり、これらはすべてヒト後部ブドウ膜炎の多くの本質的な臨床病理学的特徴を表しています12。ブドウ膜炎に関与する基本的な細胞および分子メカニズムの理解の多くは、本明細書に記載される誘導EAUモデルに由来する。EAUは、リンパ球によって認識される網膜抗原による能動免疫によってマウス13 およびラット11 において誘導され得る。これらの網...

このプロトコルは、C57BL / 6Jマウスで実験的自己免疫性ブドウ膜炎(EAU)を誘発する方法を実証します 乳化アジュバント中の網膜抗原の単回皮下注射による。疾患の進行を監視および評価する方法は、眼底鏡画像と組織学的検査を通じて詳細に説明され、測定パラメーターが概説されています。さらに、フルオレセイン血管造影、網膜血管構造および透過性を調べるための技術についても議論する。
このEAUモデルは、臨床病理学的特徴と疾患を引き起こす基本的な細胞および分子メカニズムに関して、ヒトにおける非感染性後部ブドウ膜炎の中心的な特徴を要約します。EAUは、養子導入実験およびIFNγ枯渇マウスで示されているように、自己反応性CD4+Tリンパ球のTh1および/またはTh17サブセットによって媒介されます1。ブドウ膜炎におけるこれらの細胞の潜在的な役割に関する私たちの理解の多くは、網膜組織内でTh1細胞とTh17細胞の両方が検出されるEAU2の研究から来ています3。多くの場合、EAUは、弱毒化疾患における新規治療法の有用性を評価するための前臨床モデルとして使用されます。EAU疾患の調節に成功した治療アプローチは、臨床である程度の有効性を示し、FDA承認のステータスに達しました。これらの例は、T細胞標的療法などの免疫調節薬のグループである:シクロスポリン、FK-506、およびラパマイシン4,5,6。最近、疾患の転帰に対するメカニズムと影響の両方を調査するために、このモデルで新しい経路を標的とする介入も検討されています。これらには、クロマチンリーダーブロモドメイン末端外(BET)タンパク質およびP-TEFb阻害剤を介した転写調節の標的化が含まれます3。さらに、VLA-4阻害剤などのより従来のアプローチは、最近、エフェクターCD4+ T細胞の調節を介したEAUにおける抑制を実証しました7。また、Th17細胞をRORγtインバースアゴニストであるTMP778で標的にすると、EAU8を有意に抑制することも見出されている。さらに、このモデルは、網膜の慢性自己免疫性炎症と、リンパ球プライミングなどの付随する根本的なメカニズムを研究する機会を提供します。
EAU前臨床試験の主な読み出しは、網膜眼底鏡検査イメージングを実行することによる臨床評価であり、光干渉断層撮影(OCT)による網膜の完全性を評価することによる頻度は低くなります。次に、フローサイトメトリーによる網膜細胞の網膜組織病理学的評価と免疫表現型検査が終了時に行われます。眼底鏡検査は、網膜全体の迅速かつ再現性のある臨床評価を可能にする使いやすいライブイメージングシステムです。免疫組織化学的評価のために、技術は網膜切片の準備に基づいており、炎症と構造的損傷の程度について組織構造を研究することができます9。使用されるすべての技術の評価基準と従来のスコアリングシステムは、このプロトコル内で概説されます。眼底鏡イメージングを使用して記録された損傷の程度は、しばしば組織学的変化と密接に相関しています。疾患の重症度を監視および評価するためのこの二重のアプローチにより、より高い感度と信頼性の高い測定結果が得られます。
EAUは、免疫介在性眼疾患の前臨床試験および調査に広く使用されている、確立されたモデルです。このモデルは、>95%の疾患発生率で信頼性が高く再現性があり、世界中の労働年齢失明の主な原因である眼内炎症性疾患の治療のための新しい治療法を検証または否定するために使用できる包括的なデータを生成します10。

<table><tbody><tr><td>antisedan</td><td>ZOETIS、完全な</td>フロイントを<td>目覚めさせた</td>アメリカ<td></td></tr><tr><td>のアジュバント;予防接種用CFA</td><td>シグマ、英国</td><td>F5881</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ドミトール</td><td>・オリオン・ファーマ、フィンランド</td><td></td>、<td>麻酔</td></tr><tr><td>Flourescein</td><td>Sigma、英国</td><td>F2456</td><td>血管造影</td></tr><tr><td>用 IRBP1-20</sub</td><td>>Chamberidge ペプチド、英国</td><td></td><td>ペプチド;抗原&nbsp;</td></tr><tr><td>ケタミン</td><td>オリオン ファーマ、フィンランド</td><td></td>、<td>麻酔</td></tr><tr><td>Micron III</td><td>Phoenix Research、米国</td><td></td><td>、眼底検査、</td></tr><tr><td>マウス血清</td><td>シグマ、英国</td><td>M5905</td>、<td>免疫&nbsp;</td></tr><tr><td>Mycobacterium terberculosis</td><td>Sigma、英国</td>の<td>予防接種用344289&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>百日咳毒素</td><td>シグマ、予防接種のための英国</td><td>P2980</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>塩酸フェニレフリン2.5%&nbsp;</td><td>ボッシュ&ロムUK&nbsp;</td><td>PHEN25</td><td>拡張用&nbsp;</td></tr><tr><td>拡張用トロピカミド1%</td><td>SANDOZ</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Viscotears</td><td>WELDRICKS Pharmacy、英国</td>の<td>眼の潤滑のための</td><td>2082642</td></tr></tbody></table>

実験的自己免疫性ブドウ膜炎:眼内炎症性マウスモデル

Experimental Autoimmune Uveitis: An Intraocular Inflammatory Mouse Model

実験的自己免疫性ブドウ膜炎(EAU)は、自己抗原に反応する免疫細胞によって引き起こされます。この非感染性の眼内炎症性疾患モデルの多くの特徴は、ヒトに影響を与える後部ブドウ膜炎の臨床表現型を再現しています。EAUは、新規炎症治療薬の有効性とその作用機序を研究し、眼内疾患の疾患進行を支えるメカニズムをさらに調査するために確実に使用されています。ここでは、C57BL/6Jマウス(この病気にかかりやすい最も広く使用されているモデル生物)におけるEAU誘導に関する詳細なプロトコルを提供します。疾患の重症度と進行の臨床評価は、眼底鏡検査、組織学的検査、フルオレセイン血管造影を使用して実証されます。誘導手順には、眼タンパク質光受容体レチノイド結合タンパク質(レチノール結合タンパク質3としても知られている)、完全フロイントアジュバント(CFA)からのペプチド(IRBP1-20)を含むエマルジョンの皮下注射が含まれ、死滅した結核菌が補充されます 。 首の後ろにこの粘性エマルジョンを注射した後、 百日咳菌 毒素を腹腔内注射します。症状の発症時(12〜14日目)および全身麻酔下で、臨床検査を通じて疾患の進行を評価するために眼底鏡画像を撮影します。これらのデータは、後の時点およびピーク疾患(20〜22日目)のデータと直接比較でき、違いを分析します。同時に、このプロトコルにより、研究者はフルオレセイン血管造影を使用して血管透過性と損傷の潜在的な違いを評価することができます。EAUは、野生型または遺伝子組み換えの両方の他のマウス系統で誘導することができ、薬効および/または疾患メカニズムを研究するための柔軟性を提供する新しい治療法と組み合わせることができます。

このプロトコルでは、IRBPに由来するブドウ膜生成網膜ペプチドをマウスに免疫することにより、実験的自己免疫性ブドウ膜炎(EAU)のモデルを段階的に誘導する方法を記載します。広く使用され、容易にアクセス可能なアプローチを採用した疾患の評価がカバーされていますが、これらは排他的ではなく、他の画像技術に追加されるか、部分的に置き換えられる可能性があります。C57BL/6JマウスにおけるEAUの最初の徴候は、 図1に示すように、免疫後2週間で検出され、疾患のピークは3週間以内に達することができます。眼底鏡下変化は、免疫細胞の浸潤や構造的損傷に基づく組織学的変化に加えて、網膜組織、血管および視神経乳頭の炎症、網膜構造損傷(図2)などの炎症性変化として疾患進行時に分類されます。これらの臨床的および組織病理学的変化は、免疫後最大85日間検出することができ、評価のために等級付けおよびスコアリングされ、疾患の進行を研究することを提案する。定性的視覚スコアリングにおける意図しないバイアスを避けるために、画像は複数の専門家によって評価される...

このレポートでは、研究者がマウスモデルを生成できるようにするプロトコルを提示します 眼内ブドウ膜炎の。より一般的には実験的自己免疫性ブドウ膜炎(EAU)と呼ばれるこの確立されたモデルは、人間の病気の多くの側面を捉えています。ここでは、いくつかの読み出しを用いて疾患進行を誘導およびモニタリングする方法について説明します。

Experimental Autoimmune Uveitis (EAU) is driven by immune cells responding to self-antigens. Many features of this non-infectious, intraocular ...

このモデルは、免疫介在性ヒト後部ブドウ膜炎の病因を含む細胞メカニズムを研究するために使用できます。この技術の意味は、新規薬物の有効性を監視し、化学的疾患の進行に関する機構的な洞察を提供する際のヒトブドウ膜炎のトランスレーショナル研究にまで及びます。このモデルを使用する主な利点は、疾患誘発の信頼性と、疾患の進行を監視できる非侵襲的内視鏡技術の使用です。ここでは、いくつかの読み出しを使用して疾患を誘発し、病理を評価する方法について説明します IRBP 1-20完全なフロイントアジュバントまたはCFAを調製するには、計算された量のペプチドを最小容量の100%DMSOで再懸濁します。粉末が完全に溶解したら、穏やかな攪拌を使用して注射するマウスの数に応じて最終的に計算されたPBSの量に達するまで少量のPBSをチューブに加え、溶液を混合します。完全なフロイントアジュバントを調製した後、DMSO PBSペプチド溶液を懸濁液に1対1の比率で滴下しながら、溶液を穏やかかつ頻繁にピペットでピペットで粘り気のある均一に分布したエマルジョンを形成します。溶液を曝気するには、700マイクロリットルに設定された1000マイクロリットルのピペットを使用して、濃厚でクリーミーなエマルジョンが得られるまで溶液を繰り返しピペットします。ペプチド懸濁液を注入する前に、注射する各マウスを別々のケージに入れ、23ゲージ針を備えた1ミリリットルのシリンジを使用して、1%マウス血清を添加した100マイクロリットルのRPMI 1640培地中に1.5マイクログラムの百日咳菌毒素を各動物に送達する。百日咳毒素溶液を注入したら、マウスを首筋のような位置に保持し、皮膚をつまんで首の後ろにテントのような構造を形成する必要があります。針を指と親指の間のスペースに通し、200マイクロリットルのIRBPエマルジョンをテントを張った皮膚に注入し、注射後の圧力を維持し、針の頭を回転させて皮膚を閉じてから引っ込めます。臨床疾患をスコアリングするために、注射後21日目に、麻酔ペプチド注射マウスにおける花弁反射に対する応答の欠如を確認し、動物を首筋で拘束する。注射直後に1%トロピカミドと2%フェニレフリンを各眼の角膜に局所的に塗布します。.瞳孔が完全に拡張したら、マウスを専用の顕微鏡ステージに置きます。網膜に完全にアクセスできるように顕微鏡を配置します。必要に応じて、画像プロセス全体を通して接眼レンズを調整して、視神経乳頭と網膜を確認し、網膜領域全体の画像を取得し、周囲のすべてのコーナーを調整してカバーします。血管漏出を測定するには、100マイクロリットルの2%フルオレセインを首の後ろに皮下投与し、網膜がライブ画像の中央の中心になるようにマウスの位置を変えます。蛍光注入後1.5分と7分でそれぞれの画像を取得する前に、眼底鏡を465〜490ナノメートルの青色光励起フィルターに設定します。すべての画像が取得されたら、腹腔内に回復のための鎮静剤注射剤を投与し、マウスを予熱したマットの上のケージに入れ、マウスが意識を取り戻すまで監視しながら湿潤に浸した食事にアクセスします。画像の臨床疾患スコアリングでは、視神経乳頭の炎症、網膜血管カフ、網膜組織の浸潤、および構造的損傷の重症度に基づいて臨床評価を行います。これらの各パラメーターを 1 から 5 のスケールでスコアリングします。総計は、眼全体の臨床疾患を表しており、眼あたり最大スコアは20です。研究の最終臨床エンドポイントのための眼底イメージング後、マウスを安楽死させます。組織学的分析のために、眼瞼全体を離して評価し、次に湾曲した鉗子を地球の後ろに配置して、眼窩結合組織と視神経をつかみ、眼を摘出します。除核した眼を1〜5ミリリットルの4%グルタルアルデヒドに最低15分間入れてから、臓器を1〜5ミリリットルの10%ホルムアルデヒドに少なくとも24時間移します。組織学的組織染色後、標準プロトコールに従って、免疫細胞浸潤のレベルおよび網膜損傷の程度に基づいて0〜3のスケールでスコアを割り当てた。眼底鏡下変化は、疾患進行時の炎症性変化として分類され、免疫細胞の浸潤や構造障害に基づく組織学的変化に加えて、網膜組織や血管・視神経乳頭の炎症や網膜の構造的損傷などが挙げられます。これらの臨床的および組織病理学的変化は、疾患の進行を評価し、治療介入の有効性を評価するために等級付けおよびスコアリングすることができる。血管漏出は、モデルおよびヒトブドウ膜炎の病理学的特徴でもある。この分析で示されているように、フルオレセインを使用して、このモデルの別の読み出しとして血管漏れを視覚化できます。研究者は、溶液間の分離の兆候なしにエマルジョンが正しく調製されていることを確認することが不可欠です。それらは完全に混合されるべきであり、そして最終製品は質感が滑らかであるべきである。この手順は、他の薬物投与方法および網膜免疫細胞集団に浸潤する表現型のためのサイトメトリーと組み合わせることができる。

experimental-autoimmune-uveitis-an-intraocular-inflammatory-mouse

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

このビデオでは、細菌性眼内炎(眼の硝子体腔への細菌の侵入に起因する眼内感染)を模倣するマウスモデルを、細菌懸濁液を眼に注入することで生成する方法を説明しています。このマウスモデルは、疾患のメカニズムを研究し、その治療法を評価するのに役立ちます。...

細菌性眼内膜炎マウスモデル:マウスの眼への細菌懸濁液の硝子体内注入による細菌性眼内炎の作製法

このビデオは、マウスモデルで眼表面の炎症とマイボーム腺の機能障害を誘発する方法を示しています。免疫原を用いてマウスの免疫系を刺激し、その後、同じ免疫原で再刺激すると、眼表面の炎症が促進され、好中球が産生するaggNETを介してマイボーム腺分泌が詰まり、ドライアイ疾患を引き起こします。...

マウスモデルにおける眼表面炎症の誘導法

このビデオは、麻酔をかけたマウスの全身性炎症の誘発を示しています。マイコバクテリア抗原アジュバントデポの注射は、サイトカイン放出と限局性炎症を引き起こします。リンパ管が開くと、免疫細胞がリンパ節に侵入し、炎症誘発性サイトカインを放出するT細胞が活性化され、広範囲にわたる炎症を引き起こします。...

マウスモデルにおける全身性炎症を誘発するための細菌抗原の皮下注射

このビデオでは、感染後のブドウ膜炎を研究するためのプライムされたマイコバクテリアブドウ膜炎(PMU)のマウスモデルを生成する方法を示します。以前に同じ免疫原で免疫されたマウスに熱死結核菌の硝子体内注射によるPMUの誘導に際し、眼の慢性炎症の進行を画像診断および病理組織学的検査を用いて解析する...

感染後ブドウ膜炎を研究するためのプライムマイコバクテリアブドウ膜炎のマウスモデル

このビデオは、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質と不活性化結核菌の組み合わせを注入することにより、マウスモデルで実験的な自己免疫性脳脊髄炎を誘発する方法を示しています。このモデルにより、研究者は疾患のメカニズムを研究し、治療的介入をテストすることができます。...

マウスモデルにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎の誘導

このビデオは、感染後ブドウ膜炎のマウスモデルにおける眼の炎症を検出および定量化するためのin...

マウスモデルにおけるブドウ膜炎の評価のための光干渉断層撮影イメージング

このビデオでは、実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)を使用して多発性硬化症のマウスモデルを確立しています。マウスにニューロンペプチドとアジュバントを含むエマルジョンを注入すると、自己反応性T細胞を活性化する免疫応答が引き起こされます。これに続いて、百日咳毒素(PTX)を注射して血液脳関門の透過性を高め、自己反応性T細胞が脳に浸潤できるようにします。この浸潤は、最終的にミエリン損傷をもたらすシグナル伝達カスケードを開始し、多発性硬化症の脱髄状態を模倣しています。...

慢性高眼圧症は、マウスの目に小柱網のレーザー光凝固を使用して誘導される。眼圧（IOP）は、レーザー治療後数ヶ月上昇する。視力と実験動物のコントラスト感度の低下は微細運動テストを使用して監視している。...

ビジュアル欠陥を特徴づけるために慢性高眼圧症のレーザー誘起マウスモデル

この報告では、ラット涙腺抽出物、オボアルブミン、完全フロインドアジュバントのエマルジョンで免疫化した後、涙腺下涙腺および涙腺に涙腺抽出物およびオボアルブミンを注入することにより、Lewisラットにおいて慢性的な実験的自己免疫ドライアイを誘導する方法が記載されている6週間後。...

眼球組織におけるエフェクター記憶T細胞の増加を伴う慢性自己免疫ドライアイラットモデル

ここでは細菌性内膜炎のマウスモデルにおけるビトリアル内注射とその後の細菌定量の方法について説明する。このプロトコルは、宿主の免疫応答および細菌および宿主遺伝子発現を測定するために拡張することができる。...

細菌性内眼炎マウスモデルにおけるウイルス感染の注入と感染量の定量

このプロトコルは、マウスにプライミングマイコバクテリアブドウ膜炎(PMU)を誘発するための手順を概説しています。この方法は、マウスモデルシステムで信頼性が高く堅牢な眼の炎症を引き起こすのに役立つ手順を概説します。このプロトコルを使用して、免疫学的、トランスクリプトミクス、およびプロテオミクスアッセイでさらに評価するために、単一の動物からブドウ眼と炎症を起こしていない仲間の目を生成しました。...

感染後ブドウ膜炎のモデルとしてのプライミングマイコバクテリアブドウ膜炎(PMU)

学ぶ実験的自己免疫性ブドウ膜炎のマウスモデル構築法。眼内炎症の病態解明と新薬効果評価に有用な非侵襲的エンドスコピー技術を用いた疾患進行モニタリング手法を解説します。

実験的自己免疫性ブドウ膜炎:眼内炎症性マウスモデル

さらに動画を探す