CRISPR/Cas9を用いた初等ヒトB細胞のゲノム工学

このプロトコルにより、研究者はB細胞内の遺伝子を正確に排除して、その遺伝子の機能喪失効果を研究したり、研究や治療目的に使用できる安定したトランス遺伝子発現のためのトランス遺伝子を挿入したりできます。この方法の主な利点は、B細胞を高効率で簡単かつ正確に操作できるユニバーサルプラットフォームを提供することです。この方法は、B細胞を操作して組換え抗体または酵素を発現させ、それらのB細胞を感染症の治療や酵素腫発に移植するために使用できます。

まず、B細胞を摂氏37度の水浴で解凍します。待っている間に、2ミリリットルの予熱したFBSを滅菌済みの15ミリリットルの円錐管に移します。B細胞が完全に解凍されたら、すぐに1ミリリットルの予熱したFBSをサンプルに滴下します。

室温で1分間インキュベートします。静かにピペットでサンプルを再懸濁し、全量を滴下して、2ミリリットルの予熱FBSを含む円錐形のチューブに移します。滅菌PBSで容量を15ミリリットルにしてから、チューブにキャップをして2〜3回静かに反転させます。

サンプルをGの400倍で5分間遠心分離し、細胞ペレットを乱さずに上清を廃棄します。ペレットを1ミリリットルの平衡化済みB細胞増殖培地で再懸濁し、細胞をカウントします。合計セル番号は、約 10 から 7 番目のセルまでである必要があります。

細胞を20ミリリットルの予め平衡化したB細胞増殖培地を含むフラスコに移します。細胞の最終濃度は、ミリリットル当たりの約5×10〜第5細胞であるべきである。フラスコを組織培養インキュベーターで垂直にインキュベートします。

トランスフェクション反応ごとに1マイクログラムの化学修飾sgRNAと1.5マイクログラムの化学修飾化膿連鎖球菌Cas9核mRNAを混合することにより、CRISPR/Cas9トランスフェクション基質を調製します。制御のために、sgRNAの代わりに1マイクロリットルのTEバッファーを8チューブストリップの0.2ミリリットルチューブに追加します。エレクトロポレーターの電源を入れ、核感染試薬を調製します。

トランスフェクション反応ごとに100万個のB細胞をカウントし、滅菌コニカルチューブに移します。滅菌PBSで容量を15ミリリットルにし、Gの400倍で5分間遠心分離します。遠心分離後、上清を捨てます。

10ミリリットルの滅菌PBSで細胞を再懸濁し、Gの400倍で5分間遠心分離した後、細胞ペレットを乱さずに上清を完全に廃棄します。B細胞100万個あたり0.5マイクログラムの化学修飾GFP mRNAを細胞ペレットに加えます。B細胞100万個あたり20マイクロリットルの初代細胞トランスフェクション試薬でペレットを再懸濁し、5〜6回ピペッティングして穏やかに混合します。

トランスフェクション反応ごとに20.5マイクロリットルをCRISPR/Cas9試薬を含む0.2ミリリットルのチューブに移します。ピペットを一度上下に動かして、全量を混合し、トランスフェクションキュベットに移します。ベンチのキュベットにキャップをして軽くたたいて、液体がキュベットの底を覆うようにします。

トランスフェクションには、エレクトロポレーターでヒト初代B細胞プロトコルを使用します。エレクトロポレーションされたセルをキュベット内で室温で15分間休ませます。次に、80マイクロリットルの予め平衡化したB細胞増殖培地をキュベット内のトランスフェクション反応に移します。

キュベットを組織培養インキュベーターに30分間置きます。ヘッドを数回静かにパイプでつなぎ、キュベットからサンプルの全量を混合し、1ミリリットルのB細胞増殖培地を含む48ウェル組織培養プレートの適切なウェルに移します。細胞の最終濃度は、ミリリットルあたり100万個の細胞である必要があります。

遺伝子ノックイン実験を行い、500, 000の感染多重度で組換えアデノ関連6型ウイルスベクターをエレクトロポレーション細胞を含む適切なウェルに移します。プレートを摂氏37度、二酸化炭素5%の湿度にある組織培養インキュベーターに置きます。ノックアウト実験では、B細胞数は80%を超える生存細胞を示し、エレクトロポレーションの24時間後にコントロールサンプルとCD19ノックアウトサンプルの両方で細胞回収率がわずかに減少しました。

トランスフェクション後5日目にB細胞を採取し、フローサイトメトリーおよび潮汐解析を行いました。対照サンプルとノックアウトサンプルの代表的な散布図では、それぞれ14個および95%のCD19陰性細胞が示され、ノックアウトサンプルにおけるCD19発現の有意な減少が示されました。ゲノムシーケンシングのクロマトグラムでは、CD19ノックアウトB細胞にダブルピークが示され、CRISPR/Cas9を介した二本鎖切断後のヌクレオチドの挿入または欠失が示されました。

ノックアウトサンプルのクロマトグラフのインデル分析では、CD19遺伝子座でのインデル形成の割合が高いことが示され、これはフローサイトメトリーによって検出されるCD19タンパク質の損失の割合と一致しています。ノックイン実験のB細胞は、エンジニアリング後の12日目に収集されました。散布図では、組換えアデノ関連6型ウイルスベクターをRNPとともに投与されたサンプル中のEGFP陽性細胞の64%が示されましたが、対照サンプルとベクターのみのサンプルでは、それぞれEGFP陽性が観察されなかったか、最小限でした。

ジャンクションPCR増幅では、ノックインサンプル中に1.5 kgbaseペアのアンプリコンが示され、コントロールサンプルまたはベクターのみのサンプルいずれにもPCR産物は観察されませんでした。細胞数から、エンジニアリングプロセスは、コントロールサンプルやベクターのみのサンプルよりもノックインサンプルの細胞回収率に大きく影響することが示されました。しかし、すべてのサンプルはエンジニアリング後3日以内にすぐに回復しました。

この手順は、B細胞ゲノムの単一点突然変異を誘導または修正するために、単一塩基対を変更するための塩基エディタエージェントを導入するためにも使用できます。また、早期の終止コドンの導入やスプライス部位の変更にも使用でき、染色体転座のリスクなしに複数の遺伝子ノックアウトが可能になります。この技術が開発される前は、ヒトB細胞のエンジニアリングには、他のより困難な遺伝子エンジニアリングアプローチの使用が求められていました。

この手法は、より簡単で、より安価で、より迅速な代替手段です。また、臨床使用のための細胞治療製品の合成にも使用できる可能性があります。