ワクチン接種マウスにおける抗原特異的CD8 T細胞の細胞周期解析のためのDNA/Ki67ベースのフローサイトメトリーアッセイ

我々のプロトコルは、マウス脾臓およびリンパ節を使用して、定常型の表向きのスナップショットを提供するよりも大きいT細胞応答の動的を反映することができる実用的なアプローチを提供する。我々の技術は、応答を継続している抗原特異的CD8 T細胞を敏感に検出する。増殖CD8 T細胞は、インビボ薬物治療または細胞転移の交和作用を伴わずに測定される。

我々の技術は、いくつかの設定で免疫力学のウィンドウを提供することができます。例えば、ワクチン接種および感染症への応答に関連して、自己免疫疾患、および癌免疫療法が挙げられる。蒸留水で10倍の透過バッファーを希釈して新鮮な1倍の透過性洗浄バッファーを準備し、0.45マイクロメートルのフィルターを通してろ過し、凝集体を排除します。

サンプルあたり100マイクロリットルの最終体積の滴定実験で決定された1x透過性洗浄バッファーの希薄モノクローナル抗体Ki67 FITC。細胞と遠心分離器を400 Gで各チューブに1x透過洗浄バッファーの3ミリリットルを室温で5分間加えます。上清を捨てます。

再度、細胞をペレットに1倍の透過性洗浄バッファーと遠心分離機を加えます。その後、上清を捨てます。希釈モノクローナル抗体Ki67 FITCを100マイクロリットルペレットに加え、次に渦を加え、暗闇の中で30分間インキュベートします。

インキュベーション後、細胞を4ミリリットルの1倍の透過バッファーで2回洗浄し、各洗浄後に遠心分離し、上清を捨てます。細胞ペレットに350マイクロリットルのPBSを加えて、フローサイトメーターで直接取得するサンプルを細胞ペレットに250マイクロリットル、細胞ペレットに250マイクロリットルを加え、DNA染色のためにHoechstと共にインキュベートするサンプルを細胞ペレットに追加します。HoechstとPBS溶液を調製し、最終的な濃度が1ミリリットルあたり2マイクログラムになるように各サンプルに加えます。

渦を起たし、暗闇の中で15分間サンプルをインキュベートします。次いで、サンプルを5分間遠心分離し、350マイクロリットルのPBSを細胞ペレットに加える。ソフトウェアを開き、ワークスペースリボンセクションで[グループを作成]をクリックして、分析するさまざまな臓器に対応する異なるグループを作成します。

変更したグループウィンドウを開くには、グループ名をダブルクリックし、同期された関数にチェックマークを挿入して、新しく作成したグループを同期します。各 FCS ファイルを対応するグループにドラッグし、A-LN グループから開始するギャティングストラテジーを作成します。完全に染色されたサンプルをダブルクリックしてグラフウィンドウを開き、サンプルに対して取得したイベントをドットプロットで表示します。

X軸およびy軸は、この原稿のフローサイトメーター設定ファイルの表2に示すように、FCSファイルのようにラベル付けされることに注意してください。適切な視覚化のために十分な数のイベントが表示されていることを確認します。必要に応じて、ワークスペースリボンのハートアイコンをクリックして環境設定を開き、グラフを選択し、次に「ドットプロット」をグラフタイプとして選択し、対応するボックスに描画されるドットの数が正しいか、それを変更することを確認します。

x 軸に DNA-A、y 軸に DNA-W を使用して、グラフ ウィンドウに有数のイベントをドット プロットで表示します。両方の軸に線形スケールを使用します。必要に応じて、グラフウィンドウの各軸にT近く表示されたボックスをクリックして、スケールを対数から線形に変更します。

ゲーティングツールセクションで長方形をクリックして単一のセルの母集団を選択し、長方形ゲートの中央をダブルクリックして、X軸にFSC-Aパラメータを持つドットプロットの単一セルを表示し、死んだセルがy軸に死んで表示します。ポリゴンをクリックして、死細胞死に負の生細胞集団を選択します。ポリゴン ゲートの中央をダブルクリックすると、X 軸に FSC-A パラメータ、Y 軸に SSC-A パラメータを使用して、ドット プロットのセルが表示されます。

長方形をクリックし、リラックスしたゲートを作成して、そのグラフ内のすべての単一のライブセルを含めます。リラックスしたゲートの中央をダブルクリックすると、X 軸に CD3、Y 軸に CD8 を使用したドット プロットのセルが表示されます。グラフ ウィンドウでの視覚化に適切なアクセス スケールを使用します。

必要に応じて、各軸に近い T で示されているボックスをクリックして x および y のスケールを変更し、[アクセス関数のカスタマイズ] を選択し、必要に応じてベースと肯定的な数十年で余分なネグ数十年を変更します。多角形をクリックして、CD3+CD8+セルを選択します。CD3+CD8+ゲートの中央をダブルクリックすると、X軸にTetr-gag、Y軸に「ペントガグ」を使用して、ドットプロットのセルが表示されます。

多角形をクリックして抗原特異的CD8 T細胞を選択します。gag 固有のゲートの中央をダブルクリックすると、X 軸に DNA-A、Y 軸に Ki67 を持つドットプロットのセルが表示されます。グラフウィンドウのギャティングツールセクションでQuad"をクリックして、異なるセル周期フェーズのセルを選択します。

1 つのサンプルで作成したゲーティングストラテジーを対応するグループにコピーして、グループのすべてのサンプルにゲートを適用します。次に、テキスト原稿に記述されているように、b-脾臓およびCBMグループの格言戦略をコピーします。すべてのゲートが 3 つのグループの各サンプルに適していることを確認します。

必要に応じて、原稿に記載されているとおりにグループを同期解除し、ゲートを修正します。リラックスしたゲートのBM細胞を、x軸にDNA-A、Y軸にKi67を用いたドットプロットで表示する。ワークスペース リボン セクションの [レイアウト エディター] をクリックして結果を視覚化します。

サンプルペインのゲーティングストラテジーの各ゲートをレイアウトエディタにドラッグし、ゲーティングの順序に従ってプロットを配置します。必要に応じて、レイアウト内の対応するプロットをダブルクリックし、グラフ定義ウィンドウで適切なタイプを選択して、グラフタイプを変更します。グループをクリックし、レイアウトリボン上の機能によって反復して、各器官から抗原特異的CD8 T細胞で得られた結果を視覚化し、異なるサンプルを比較します。

陽性のコントロールを表す骨髄細胞の結果を視覚化します。骨髄細胞の細胞周期解析の典型的な例をここに示す。このプロトコルは、G0からG1、G2の変動係数が低く、MDNAピークに対して、DNA染色の優れた品質を示した。

抗原特異的CD8細胞を同定するために5段階の格言戦略を採用した。2つのマルチマーは、未治療マウスの染色背景を増加させることなく、ワクチン接種マウスにおけるギャグ特異的CD8 T細胞検出の感受性を改善するために使用された。排出リンパ節および脾臓におけるギャグ特異的CD8 T細胞は、3日目のポストブーストでS-G2/M相中の細胞の高い割合を含む。

さらに、S-G2/M相におけるギャグ特異的CD8 T細胞は、同じ器官から全CD8T細胞に重ね合った場合に高いFSC-AおよびSSC-Aを持っていた。オフセットヒストグラムは、G0リンパ節の数個の細胞を除いて、活性化T細胞に対して予想されるように、ギャグ特異的CD8 T細胞によるCD62L発現が低いことを示した。この方法は、膜およびKi67染色と一緒にDNA染色の優れた品質を達成するためにT細胞のために設計されています。

フローサイトメトリーデータ解析は重要なポイントです。ゲートの位置決めには適切な制御を使用してください。この方法を用いて、マウスおよびヒト末梢血における細胞周期のS-G2/M相のT細胞を発見した。

この技術は、1型糖尿病、感染性単核球症、およびCOVID-19における免疫モニタリング研究において有用であった。