Name: 微生物分子シグネチャを用いた河川における水圧破砕の影響評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: 学ぶ 水圧破砕が河川の微生物群集に与える影響を評価する手法。沈殿物と水のサンプル採取から核酸抽出、16S rRNA遺伝子シーケンスによる細菌叢プロファイリングまで、環境モニタリングのための包括的プロトコルを解説します。

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著者らは、これらの方法の開発につながったプロジェクトの資金源を認めたいと考えています: ハワード・ヒューズ医学研究所 (http://www.hhmi.org) 先進学と学部科学教育プログラムを通じて, ならびに国立科学財団 (http://www.nsf.gov) による NSF賞 DBI-1248096 および CBET-1805549.

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<li>Rausch, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+amplicon+and+metagenomic+sequencing+methods+reveals+key+features+in+the+evolution+of+animal+metaorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of amplicon and metagenomic sequencing methods reveals key features in the evolution of animal metaorganisms.</a> Microbiome. 7 (1), 133(2019).</li>
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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

この論文に記載されている方法は、2014年から2018年の間に私たちのグループが発表したいくつかの研究の過程で開発され、洗練されており、まもなく出版のための論文を提出する3年間のプロジェクトで水生コミュニティにフラッキングが及ぼす影響を調査する共同プロジェクトに成功しました。これらの方法は、プロジェクトの残りの部分で引き続き使用されます。さらに、河川や生態系に対するフラッキングの影響を調査している他の現在の文献では、サンプルの収集、処理、および分析に関する同様の方法が7、8、10、11に関する記述されています。しかし、これらの論文はいずれもメタトランスクリプト分析を利用し、この論文は、これらの分析が近くの河川に対するフラッキングの影響を解明するためにどのように使用できるかを最初に説明した。さらに、サンプル収集のためにここに示す方法は、汚染を避けるために取られたステップと同様に、より詳細です。
プロトコルの最も重要なステップの 1 つは、初期サンプルの収集と保存です。フィールドサンプリングとコレクションには、収集中に無菌または無菌環境を維持することが困難な場合があります。このステップの間、サンプルを汚染することを避けることは重要である。これを行うには、手袋を着用し、滅菌容器と工具のみがサンプルに接触するようにする必要があります。サンプルは、核酸の分解を緩和するために、採取後すぐに氷の上に置く必要があります。また、収集時に市販の核酸保存剤を添加すると、核酸収率を増加させ、採取後のサンプルの保存期間を長くすることができます。核酸抽出が行われるたびに、適切な量のサンプルを使用することが重要であり、抽出に使用されるスピンフィルターを詰まらせ過ぎる可能性がありますが(それらを使用するプロトコルの場合)、あまりにも少なすぎると低収率になる可能性があります。使用するキットの説明に従ってください。
フィールドコレクションと同様に、特に最適でない沈着サンプル(大量の砂利や岩石を含むサンプル)や水サンプルなどの低核酸収率サンプルを使用する場合は、核酸抽出やサンプル調製中に汚染を回避または最小限に抑えることも重要です。したがって、サンプル収集と同様に、汚染を減らすために、これらすべてのステップで手袋を着用する必要があります。さらに、ラボの手順で使用されるすべての作業面は、10%の漂白剤溶液で拭くことによって事前に滅菌し、その後に70%のエタノール溶液を使用する必要があります。ピペット化ステップ(3-6)では、ピペット自体による汚染を避けるためにフィルターチップを使用し、チップは非滅菌表面に触れるたびに変更される必要があります。ピペットを含むラボ作業に使用されるすべてのツールは、漂白剤とエタノール溶液で前後に拭き取る必要があります。汚染を評価するには、核酸抽出およびPCR反応の各セットに抽出ブランクおよびネガ(滅菌液)を含める必要があります。抽出後の定量化により陰性のDNA/RNAの検出可能量が明らかになった場合、十分なサンプルが残っていれば抽出を繰り返すことができます。PCR の陰性サンプルが増幅を示す場合は、ソースを特定するためにトラブルシューティングを実行し、サンプルを再実行する必要があります。低レベルの汚染を考慮して、抽出ブランクとPCRネガを配列決定して、必要に応じて計算解析中に汚染物質を特定して除去することをお勧めします。逆に、PCR 増幅もさまざまな原因で失敗する可能性があります。環境試料の場合、PCR反応の阻害が原因であることが多く、これはTaqポリメラーゼ23に干渉する様々な物質によるものとなり得る。阻害が疑われる場合、PCR等グレードの水( 材料表を参照)を使用してDNA抽出物を希釈することができます。
このプロトコルには、いくつかの顕著な制限と潜在的な困難があります。サンプル収集は、水と堆積物の両方のサンプルに挑戦することができます。十分なバイオマスを得るためには、理想的には1Lの流水をフィルターに押し込む必要があります。フィルターの細孔は、微生物を捕獲するために小さくする必要がありますが、堆積物をトラップすることもできます。最近の降雨により多くの土砂が水中にある場合、フィルターが詰まってフィルターを通してボリューム全体を押し込むのが困難になる可能性があります。堆積物の収集では、収集中の堆積物の深さを推定するのは難しい場合があります。さらに、小石や岩石は核酸収量の低下につながり、微生物群集の正確な表現ではない可能性があるため、収集された堆積物が主に土壌であることを確認することが重要です。最後に、特に防腐剤を使用しない場合は、採取後にサンプルを氷の上に保管することが重要です。
このプロトコルはメタトランスクリプトと 16S の両方のラボ プロトコルを対象としていますが、これらの 2 つの方法は、プロセスとデータの種類の両方で非常に異なっていることを強調する必要があります。16S rRNA遺伝子は、一般的に標的領域であり、細菌および古細菌で高度に保存されており、サンプル中の細菌群集を特徴付けるための有用なものである。標的化された具体的なアプローチではあるが、種レベルの分解能は達成不可能であることが多く、新たに発散した種や株の特徴付けは困難である。それどころか、メタトランスクリプトミクスは、サンプル内に存在するすべての活性遺伝子および微生物を捕捉する、より広範なアプローチである。16Sは同定のためのデータのみを提供するのに対し、メタトランスクリプトミクスは発現した遺伝子および代謝経路のような機能的なデータを提供することができる。どちらも貴重であり、組み合わせると、どの細菌が存在し、どの遺伝子が発現しているかが明らかにできます。
本論文では、フラッキングの研究における16S rRNAおよびメタトランスクリプト分析の両方に対するフィールド収集およびサンプル処理の方法について説明する。さらに、低バイオマスサンプルからの高品質DNA/RNAの収集方法や長期保存方法を詳しく説明しています。ここで説明する方法は、微生物群集の構造と機能を調べることによって、フラッキングが近くの小川にどのような影響を与えるかを学ぶ取り組みの中で、サンプルの収集と処理に関する私たちの経験の集大成です。微生物は障害に迅速に対応し、その結果、どの微生物が存在し、それらが発現する遺伝子は、生態系に対するフラッキングの影響に関する情報を提供することができます。全体として、これらの方法は、フラッキングがこれらの重要な生態系にどのような影響を与えるかについての理解において非常に貴重である可能性があります。

水圧破砕(HF)、または「フラッキング」は、化石燃料の需要が増加し続けるにつれてますます普及している天然ガス抽出の方法です。この技術は、高出力の掘削装置を使用して、メタンが豊富なシェール鉱床に水、砂、および化学物質のブレンドを注入し、通常は閉じ込められたガスを放出する。
これらの非伝統的な収穫技術は比較的新しいため、近くの水路に対するそのような慣行の影響を調査することが重要です。フラッキング活動は、機器輸送と井戸パッド建設のための広大な土地のクリアを義務付けています。井戸パッド2ごとに約1.2~1.7ヘクタールの土地をクリアする必要があり、システム3の流出と水質に影響を与える可能性があります。どのような殺生物剤が使用されているかを含め、フラッキング流体の正確な化学組成を取り巻く透明性の欠如があります。さらに、フラッキング排水は非常に生理学的になる傾向があります。さらに、廃水には、金属や天然放射性物質2が含まれていてもよい。そのため、人的ミスや機器の故障によるフラッキング液の漏出や流出の可能性が懸念される。
河川生態系は、周囲の景観4の変化に非常に敏感であることが知られており、流域全体の生物多様性5と適切な栄養サイクリング6を維持するために重要です。微生物は淡水の流れで最も豊富な生物であり、栄養循環、生分解、一次生産に不可欠です。微生物群集の組成および機能は、perturbanceに対する感受性のために生態系に関する情報を得るための素晴らしいツールとして機能し、最近の研究では、フラッキング活動7,8に近い状態に基づいて観察された細菌集合体の明確な変化が示されている。例えば、ベージェリンキア、バークホルデリア、メサノバクテリウムはフラッキング近くの小川で濃縮されたと同定され、シュードノカルディア、ニトロスピラ、ロドバクターはフラッキング7の近くにない小川で濃縮された。
16SリボソームRNA(rRNA)遺伝子の次世代シーケンシングは、全ゲノムシーケンシングアプローチ9よりも速くかつ安価である細菌群組成を決定する手頃な方法である。分子生態学の分野における一般的な実践は、16S rRNA遺伝子の高可変V4領域をシーケンシング分解能に使用する方法であり、多くの場合、同定の広い範囲を有する属レベルまで下がることが、予測不可能な環境試料に理想的である。この技術は、公開された研究で広く実装されており、水生環境に対するフラッキング操作の影響を特定するために成功裏に利用されています7,8.しかし、細菌は16S rRNA遺伝子のコピー数が変化し、検出された存在量10に影響を与えるのは注目に値する。これを説明するためのいくつかのツールがありますが、その有効性は疑わしい10です。有病率が急速に増加し、この弱点を欠いているもう一つの方法は、すべてのRNAが配列決定され、研究者が活性細菌とその遺伝子発現の両方を同定することを可能にするメタトランスクリプトームシーケンシングです。
したがって、以前に発表された研究7、8、11、12の方法とは対照的に、このプロトコルは、微生物群集機能(メタトランスクリプトミクス)を調査するためのサンプル収集、保存、処理、および分析もカバーしています。ここに記載されているステップは、研究者が抗菌性遺伝子を含む彼らの流れの微生物によって発現される遺伝子と経路にどのような影響を与えたかを見ることができます。さらに、サンプル収集に関する詳細レベルが向上しました。いくつかのステップとメモは経験豊富な研究者には明らかに見えるかもしれませんが、研究を始めたばかりの人にとっては非常に貴重な場合があります。
ここでは、我々の研究室の数年間の経験に基づいて、近くの河川にフラッキングが及ぼす影響を調査する手段として、細菌遺伝データを生成するためのサンプル収集および処理の方法を説明する。これらのデータは、下流アプリケーションで使用して、フラッキング状態に対応する差異を識別できます。

<table><tbody><tr><td>200プルーフエタノール</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A4094</td><td>400 mLをバッファーPEに追加する必要があります(Qiagen QIAQuck Gel Extraction kit protocolを参照)および96 mLをDNA/RNA洗浄バッファーに追加する必要があります(ZymoBIOMICS DNA/RNA Miniprepキットプロトコルを参照). ZymoBIOMICS DNA/RNA MiniprepおよびNEBNext&regには追加のエタノールが必要です。ウルトラ&トレード;II RNAライブラリー調製とサンプル精製ビーズキット。</td></tr><tr><td>アガロー</td>ス <td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP1356-100</td><td>ボトルあたり 100 g. 2% 30 mL ゲル 1 個を作るには、0.6 g のアガロースが必要です。</td></tr><tr><td>消毒漂白剤</td><td>ウォルマート(クロロックス)</td><td>カタログ番号なし</td><td>ラボ手順の前後の作業エリアのクリーニングに10%漂白剤溶液を使用してください</td></tr><tr><td>DNAゲルローディング染料</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>R0611</td>各<td>ユーザーメイド(つまり、非e-ゲル)には、すべてのサンプルを1&microの比率でローディング染料を含める必要があります。L染料を5&microに;Lサンプル</td></tr><tr><td>DNAラダー</td><td>MilliporeSigma</td><td>D3937-1VL</td><td>はしごは、すべてのゲル/e-ゲル</td></tr><tr><td>DNA/RNAシールド (2x)</td><td>Zymo Research</td><td>R1200-125</td><td>3 mL / 沈殿物サンプル(50 mL円錐形)および水サンプルあたり2 mL(フィルター)</td></tr>エ<tr><td>チジウムブロマイド</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP1302-10</td><td>ユーザーメイドのe-gels</td></tr>フォ<tr><td>ワードプライマー</td><td>統合DNAテクノロジー(IDT)</td><td>51-01-19-06</td><td>0.5 & マイクロ;PCR反応あたりのL</td></tr><tr><td>イソプロパノール</td><td>MilliporeSigma</td><td>563935-1L</td><td>通常、ライブラリあたり2 mL未満。必要な量は、切除されたゲルフラグメントの質量によって異なります(Qiagen QIAQuick Gel Extraction kit protocolを参照)。</td></tr><tr><td>PCRグレードの水</td><td>MilliporeSigma</td><td>3315932001</td><td>13 &micro;PCR反応あたりのL(1 &micro;LのサンプルDNAテンプレートを使用)</td></tr><tr><td>Platinum Hot Start PCR Master Mix (2x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13000012</td><td>10 & micro;PCR反応あたりのL</td></tr><tr><td>リバースプライマー</td><td>統合DNAテクノロジー(IDT)</td><td>51-01-19-07</td><td>0.5 &micro;1 L per PCR</td></tr><tr><td>反応 TBE バッファー (トリス-ホウ酸塩-EDTA)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>B52</td><td>1 L 10x TBE バッファー 1 L (30 mL ゲル 1 個を作るには 1x TBE バッファー 30 mL が必要)</td></tr><tr><td>1 L ボトル</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>02-893-4E</td><td>1 ストリームごとに 1 本必要 (使用の合間に滅菌すれば、同じボトルを複数のストリームに使用できます)</td></tr><tr><td>1.5 mL 微量遠心チューブ</td><td>ミリポアシグマ</td><td>BR780400-450EA</td><td>DNA抽出ごとに5本の微量遠心チューブが必要であり、RNAの精製にはさらに3本が必要です(ZymoBIOMICS DNA/RNA Miniprepキットプロトコルを参照)</td></tr><tr><td>2%アガロースe-gel</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>G401002</td><td>各ゲルは10個のサンプルを流すことができます(PCR陰性の場合は9個、抽出陰性が同じゲルで実行されている場合は8個)</td></tr><tr><td>50mLコニカル</td><td>CellTreat</td><td>229421</td> 1個 <td>50mLコニカル沈殿物サンプルあたり必要</td></tr> ビー<tr><td>カー</td><td>ミリポアシグマ</td><td>Z740580</td><td>1個だけ必要(火炎滅菌用)</td></tr><tr><td>アルミホイ</td><td>ル ウォルマート(Reynolds KITCHEN)</td><td>アルミ</td><td>ホイルは折りたたんでオートクレーブ保存ができません。環境にさらされていない部品は、フィルター を処理するための無菌、DNAおよびRNAフリーの表面として使用できます(クロスコンタミネーションを避けるためにフィルターごとに1つの折り畳みピース)</td></tr><tr><td>オートクレーブ</td><td>Gettinge</td><td>LSS 130</td><td>必要な</td></tr><tr><td>遠心分離</td><td>機MilliporeSigma</td><td>EP5404000138-1EA</td><td>必要な</td></tr><tr><td></td><td>クーラーULINE</td><td>S-22567</td><td>どんなクーラーでも使えます。これは発泡スチロールでできているため、軽量でフィールドサンプリングに持ち運びやすいため、リストされています。</td></tr><tr><td>ディスラプター Genie</td><td>Bio-Rad</td><td>3591456</td><td>必要な</td></tr><tr><td>電気泳動チャンバー</td>は1つだけ <td>Bio-Rad</td><td>1664000EDU</td><td></td></tr><tr><td>必要な電気泳動電源</td>は1つだけ <td>Bio-Rad</td><td>1645050</td><td>必要な</td></tr>のは1つだけ <tr><td>フリーザー (-20 C)</td><td>K2 SCIENTIFIC</td><td>K204SDF</td><td>DNA抽出物の保存に必要な1つ</td></tr><tr><td>フリーザー (-80 C)</td><td>K2 SCIENTIFIC</td><td>K205ULT</td><td>RNA抽出物の保存に必要なもの</td></tr><tr><td>手袋</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>19-020-352</td><td>カタログ番号はミディアムグローブ用です。</td></tr><tr><td>ヒートブロック</td><td>ミリポアシグマ</td><td>Z741333-1EA</td> 必要なのは<td>1つだけ</td></tr><tr><td>ラボバーナー</td><td>Sterlitech</td><td>177200-00</td><td>必要な</td></tr><tr><td>のは1つだけ 層流フード</td><td>エアクリーンシステム</td><td>AC624LFUV</td><td>つだけ</td></tr><tr><td>必要なライブラリ精製キット</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>1つのキットで50回の反応が可能</td></tr><tr><td>マグネットプレート</td><td>アルパクア</td><td>A001219</td><td>1つだけ必要な</td></tr><tr><td>微量遠心機</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>75004061</td><td>必要な</td></tr><tr><td>マイクロピペットは1つだけ(1000 &micro;L容量)</td><td>Pipette.com</td><td>L-1000</td><td>必要な</td></tr><tr><td>マイクロピペットは1つだけ(2個&マイクロ;L容量)</td><td>Pipette.com</td><td>L-2</td><td>必要な</td></tr><tr><td>マイクロピペットは1つだけ(20 &micro;L容量)</td><td>Pipette.com</td><td>L-20</td><td>必要な</td></tr><tr><td>マイクロピペットは1つだけ(200 &micro;L容量)</td><td>Pipette.com</td><td>L-200R</td><td>1個のみ</td></tr>必要 <tr><td>NEBNext Ultra II RNAライブラリー調製 サンプル精製ビーズ</td><td>New England BioLabs Inc.</td><td>E7775S</td><td>1つのキットには、24サンプル分の試薬が入っています。</td></tr><tr><td>パラフィルム</td><td>ミリポアシグマ</td><td>P7793-1EA</td><td>フィルターごとに2つの1インチx 1インチの正方形が必要です</td></tr><tr><td>PCRチューブ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>AM12230</td><td>反応ごとに1本のチューブが必要です</td></tr><tr><td>ピペットチップ(1000 &micro;Lボリューム)</td><td>Pipette.com</td><td>LF-1000</td><td>576チップパック</td></tr><tr><td>ピペットチップ(20個入り & マイクロ;Lボリューム)</td><td>Pipette.com</td><td>LF-20</td><td>960チップパック</td></tr><tr><td>ピペットチップ(200 & micro;L volume)</td><td>Pipette.com</td><td>LF-250</td><td>960 tips パック</td></tr><tr><td>PowerWulf ZXR1+ コンピュータークラスター</td><td>PSSC Labs</td><td>番号なし</td><td>これは、メタトランスクリプトミクス分析をタイムリーに実行できる強力なスーパーコンピューターの一例にすぎません。必要なのは1つだけです。&nbsp;</td></tr><tr><td>Qubit 蛍光光度計スターターキット</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>Q33239</td><td>Qubit 4 蛍光光度計、100 DNA アッセイに十分な試薬、500 量子ビットチューブが付属</td></tr><tr><td>Scoopula</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-357Q</td><td>必要な</td></tr><tr><td>滅菌ブレードは</td><td>AD Surgical</td><td>A600-P10-0</td><td>フィルターごとに</td></tr><tr><td>Sterivex-GP 圧力フィルターユニット</td><td>ミリポアシグマ</td><td>SVGP01050</td><td>水サンプルごとに必要なフィルター1</td></tr>つ <tr><td>Thermocycler</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>必要なバイスグリップ</td>は1つだけ <td>Irwin</td><td>2078500</td><td>必要なフィルターは1つだけです(フィルターを割って開くため)</td></tr> <tr><td>Vortex-Genie 2</td><td>MilliporeSigma</td><td>Z258415-1EA</td><td>必要な</td></tr><tr><td>WHIRL-PAKバッグ</td><td>は1つだけ ULINE</td><td>S-22729</td><td>フィルターごとに1つ必要</td></tr><tr><td>ZymoBIOMICS DNA / RNA Miniprep kit</td><td>Zymo Research</td><td>R2002</td><td>1つのキットには、50サンプル分の試薬が入っています。&nbsp;</td></tr></tbody></table>

微生物分子シグネチャを用いた河川における水圧破砕の影響評価

Evaluating the Impact of Hydraulic Fracturing on Streams using Microbial Molecular Signatures

一般に「フラッキング」と呼ばれる油圧破砕(HF)は、高圧水、砂、化学物質の混合物を使用して岩石を破壊し、石油とガスを放出します。このプロセスは、以前は入手できなかった資源へのアクセスを提供し、現在は米国の天然ガス全体の3分の2を生産しているので、米国のエネルギー産業に革命をもたらしました。フラッキングは米国経済にプラスの影響を与えているが、いくつかの研究は、その有害な環境への影響を強調している。特に懸念されるのは、流域全体の健康に不釣り合いな大きな影響を与えるため、特に重要なヘッドウォーターストリームに対するフラッキングの影響です。これらのストリーム内の細菌は、存在する細菌とその乱れた流れの豊富さは、それ以外の比較可能だが乱れない流れのものとは異なると予想されるので、ストリームの健康の指標として使用することができます。したがって、このプロトコルは、ストリームがフラッキングによって影響を受けたかどうかを判断するために細菌コミュニティを使用することを目的としています。このためには、フラッキング(影響を受ける可能性がある)や上流の近くの小川や、フラッキング活動の異なる流域(影響を受けていない)からの堆積物と水のサンプルを収集する必要があります。これらのサンプルは、次いで核酸抽出、ライブラリー調製、およびシーケンシングを行い、微生物群集組を調査する。相関分析と機械学習モデルは、その後、コミュニティの変動を説明する特徴を特定し、フラッキングの影響に対する予測バイオマーカーを特定するために使用することができます。これらの方法は、フラッキングに近いヘッドウォーターストリーム間の微生物群集の様々な違いを明らかにし、フラッキング活動の環境への影響に関する将来の調査の基礎となる。

DNAおよびRNA抽出の成功は、様々な装置やプロトコルを用いて評価することができます。一般的に、いずれかの検出可能な濃度は、抽出が成功したと結論付けるのに十分であると考えられる。 その後、表 1 を 調べると、1 つを除くすべての抽出が成功と呼ばれる。このステップでの失敗は、多くの場合、低い初期バイオマス、不良サンプル保存、または抽出中の人為的ミスによるものです。フィルターの場合、濃度が検出以下であっても抽出が成功している可能性がある。これらの抽出物がPCR(16Sを行う場合)またはライブラリ調製後の検出可能な濃度(メタトランスクリプトミクス)のバンドを得ない場合、それらは本当に失敗した可能性が高いです。
16Sプロトコルに従う場合、 図1のウェル4と6に見られるようにPCR増幅後の明るいバンドは成功を示し、一番上の行の他のウェルに見られるようにバンドの欠如は失敗を示します。さらに、ゲルレーンの明るいバンドに負のPCRコントロールを含む場合も、負のコントロールに影響を与える汚染がサンプルに影響を与えないと考える危険があるため、障害を示します。
16Sとメタトランスクリプトミクスの両方について、配列決定の成功は、得られた配列数を見ることによって評価することができる(図2)。16S サンプルには、最低 1,000 個のシーケンスを含める必要があり、少なくとも 5,000 個が理想的です (図 2A)。同様に、メタトランスクリプト法サンプルは、最低500,000個の配列を持ち、少なくとも2,000,000個が理想的である必要があります(図2B)。これらの最小値よりも少ないシーケンスを持つサンプルは、細菌群を正確に表さない可能性があるため、分析には使用しないでください。ただし、最小と理想の間に収まっているサンプルは使用できますが、その範囲に多数のサンプルが含まれる場合は、より慎重に解釈する必要があります。
その後のダウンストリーム分析の成功は、期待される出力ファイルが取得されたかどうかに基づいて単純に判断できます。いずれにせよ、QIIME2やR(図3)などのプログラムは、フラッキングに基づいて細菌群集間の潜在的な有意差の評価を可能にするべきである。 図3 のデータは、16Sおよびメタトランスクリプトミクス分析のために13の異なるストリームで21の異なる部位から堆積物サンプルを収集することによって得られた。これらの21のサイトのうち、そのうちの12はフラッキング活動の下流にあり、HF+に分類され、そのうちの9つはフラッキング活動の上流か、フラッキングが起こっていない流域のいずれかでした。これらのストリームは HF-に分類されました。フラッキング活動の存在に加えて、ストリームはそれ以外の場合は同等でした。
これらの違いは、フラッキングステータスに基づいて一貫した構成シフトの形を取る可能性があります。その場合、図 3A および図 3Bのように、HF+ サンプルと HF- サンプルは PCoA プロットで互いに離れてクラスター化することが期待されます。これらの明らかな変化が単なる聖任法のアーティファクトではないことを確認するには、さらなる統計分析が必要です。例えば、図3Aおよび図3Bが基づく距離行列上のPERMANOVA22検定は、フラッキング状態に基づいて明らかにされた有意なクラスタリングに基づいているため、プロットで観察された分離は、聖任のアーティファクトではなく、サンプルの細菌群集間の違いと一致することを意味する。重要なPERMANOVAまたはANOSIMの結果は、HF+サンプルとHF-サンプルの間の一貫した違いを強く示すもので、HF+サンプルがフラッキングの影響を受けたことを示し、p値が高い場合はサンプルが影響を受けないことを示します。メタトランスクリプトデータも同様に、同じ方法を用いて視覚化および評価することができる。
微分特性(微生物または機能)を調べると、サンプルも影響を受けているという証拠が明らかになります。差分フィーチャを決定する方法の 1 つは、ランダム フォレスト モデルを作成することです。ランダムフォレストモデルを使用して、サンプルのフラッキング状態をどの程度適切に分類できるかを確認できます。モデルが偶然予想以上に優れている場合、それはフラッキングステータスに依存する違いの追加の証拠になります。さらに、最も重要な予測変数は、サンプルを正しく区別するために最も重要な機能を明らかにするでしょう(図3C)。これらの機能はまた、フラッキングステータスに基づいて一貫して異なる値を持っていたでしょう。これらの差動機能が決定されると、文献をレビューして、以前にフラッキングに関連付けられているかどうかを確認できます。しかし、ほとんどの場合、16S rRNA組成データしか使用していないため、差動関数を決定する研究を見つけるのは難しいかもしれません。したがって、差動機能の影響を評価するために、考えられる方法の1つは、それらが以前にフラッキング液で一般的に使用される殺生物剤に対する潜在的な耐性と関連しているかどうか、または非常に生理的な条件を容認するのに役立つかどうかを確認することです。さらに、対象の分類の機能プロファイルを調べると、フラッキングの影響の証拠が明らかになる可能性があります(図 3D)。例えば、タクソンがランダムフォレストモデルによって差と識別された場合、HF+サンプル中の抗菌性プロファイルをHF-サンプルのプロファイルと比較することができ、それらが大きく異なる場合は、殺生物剤を含むフラッキング流体がストリームに入ることを示唆する可能性があります。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>サンプル ID</td>
			<td>濃度(ng/μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>1.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>1.55</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>0.745</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>0.805</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>7.82</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>0.053</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>0.248</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>0.945</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>1.82</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>0.804</td>
		</tr>
<tr>
<td>11</td>
			<td>0.551</td>
		</tr>
<tr>
<td>12</td>
			<td>1.69</td>
		</tr>
<tr>
<td>13</td>
			<td>4.08</td>
		</tr>
<tr>
<td>14</td>
			<td>Below_Detection</td>
		</tr>
<tr>
<td>15</td>
			<td>7.87</td>
		</tr>
<tr>
<td>16</td>
			<td>0.346</td>
		</tr>
<tr>
<td>17</td>
			<td>2.64</td>
		</tr>
<tr>
<td>18</td>
			<td>1.15</td>
		</tr>
<tr>
<td>19</td>
			<td>0.951</td>
		</tr>
</tbody></table>表1:フッ素計1xDSDNA高感度アッセイに基づくDNA濃度の例。 14を除くすべてのこれらのサンプルの抽出は、検出可能な量のDNAを有するため成功すると考えられる。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61904/61904fig01.jpg"> 図1:PCR産物を含むe-gelの例 ゲルはUV光の下で事前染色され、視覚化され、その上に存在するDNAが輝く原因となる。PCRは、(はしごに基づいて)予想されるサイズの単一の明るいバンドを持っていたので、最初の行の井戸4と6のサンプルに対して働いた。他の6つのウェルのサンプルのPCRは、バンドを作り出さなかったため失敗しました。陽性対照(第1ウェル、2行目)は明るいバンドを有し、PCRが適切に行われたことを示し、負の対照(ウェル6および7、2列目)はバンドを持っていなかったので、サンプルが汚染されなかったことを示す。陰性のバンドがサンプルと同じくらい明るい場合、PCRはサンプルが汚染の結果だけではないアンプリコンを持っていると仮定するのは危険であるため、障害と見なされていました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61904/61904fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61904/61904fig02.jpg"> 図2:シーケンスカウントの例 (A)16S のシーケンスカウント例。これらの16Sサンプルのほとんどすべてが1,000以上の配列を持っていました。1,000未満の配列を持つ非常に少数は、細菌群集を正確に表現するのに十分な配列を持っていなかったため、下流の分析から除外する必要があります。いくつかのシーケンスは1,000から5,000のシーケンスの間を持っていました。理想的ではありませんが、それらは最低限を超えるのでまだ使用できるでしょう、そしてサンプルの大半は理想的な最低5,000を超えています。(B) メタトランスクリプトミクスの例カウント。すべてのサンプルは、最小(500,000)と理想的な最小(2,000,000)のシーケンス数の両方を超えました。したがって、シーケンスは、それらのすべてのために成功し、すべてのダウンストリーム分析で使用することができました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61904/61904fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61904/61904fig03.jpg"> 図3: 分析例 (A) 重み付き Unifrac 距離行列を使用して計算された座標に基づく PCoA プロットが、QIIME2 を通じて作成され、視覚化された。(B) QIIME2 からエクスポートされた重み付け Unifrac 距離行列で計算された座標に基づく PCoA プロット。座標は、R.メタデータベクトルのPhyloseqとggplot2パッケージを使用して視覚化され、ビーガンパッケージを使用してプロットに適合しました。各ポイントはサンプルの細菌群を表し、より類似したコミュニティ組成物を示す近い点を有する。これらの16Sの沈積サンプルのフラッキング状態に基づくクラスタリングが観察された(PERMANOVA、p=0.001)。さらに、このベクターは、HF+サンプルがバリウム、臭化物、ニッケル、亜鉛のより高いレベルを有する傾向があることを明らかにし、HF-サンプルと比較して異なる細菌群集組に対応した。(C) サンプル間のフラッキング状態を予測するために細菌の存在量をどこで使用できるかをテストしたランダムフォレストモデルの最良の予測因子のプロット。ランダム フォレスト モデルは、ランダム フォレスト パッケージを使用して R を通じて作成されました。上位20個の予測変数は、不純物の減少(HF+およびHF-サンプルをグループ化した数の尺度)と同様に、ジニ指数の平均減少の形で、サンプルを分離するために利用される。(D)メタトランスクリプトデータに基づくバークホルデニアル性プロファイルの抗菌性プロファイルを示す円グラフ。シーケンスは、彼らが属している分類を決定するためにKraken2で最初にアノケン付きにしました。BLASTは、これらのアコード化された配列とMEGARes 2.0データベースと共に使用され、どの抗菌性遺伝子(「MEG_#」の形で)が積極的に発現されているかを決定しました。その後、バークホルデリアのメンバーによって発現された抗菌性遺伝子を抽出し、そのタクサの中で最も流行したものを確認した。メタトランスクリプトオミクスは、コストと時間がかかりますが、16Sデータではできない機能分析を可能にします。特に、Kraken2はHUMAnN2の代わりにこの例の分析に使用されました。クラーケン2はHUMAnN2よりも速いです。しかし、組成、寄与、機能(遺伝子)やHUMAnN2のような経路の代わりに、組成情報のみを出力します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61904/61904fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル: メタトランスクリプトミクスパイプラインの例。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61904/Supplemental%20File_61904_R2_RE.docx" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

ここでは、水と堆積物の微生物群集を分析することによって、近くの河川に対する水圧破砕の影響を調査するプロトコルを提示します。

Hydraulic fracturing (HF), commonly called &#34;fracking&#34;, uses a mixture of high-pressure water, sand, and chemicals to fracture rocks, releasing oil ...

このプロトコルは、水圧破砕が近くのストリーム内の細菌に影響を与えるかどうか、そしてどのように影響するか、またストリーム自体に影響を与えるかどうかという質問に答えるために使用できます。この技術の主な利点は、データ分析を通じてサンプル収集から研究者を取るので、その全体的な性質です。この手順のデモンストレーションは、私の研究室のバイオインフォマティクス学者のジェレミー・チャンゼー、ジュニアタ・カレッジの学部生であるシドニー・リーガル、私の研究室マネージャーのギリアン・ライスターです。核酸抽出用の沈着物サンプルを収集するには、手袋を使用して、キャップされた無菌50ミリリットルの円錐管を海岸から流水に沈めます。チューブが水没している間、キャップを取り外し、キャップを使用して、チューブに1〜3センチメートルの深さから約3ミリリットルの堆積物をすくいます。サンプルを採取した後、チューブから約1ミリリットルの水を除くすべてをダンプし、1,000マイクロリットルのピペットを使用して3ミリリットルのDNA/RNA保存剤をサンプルに加えます。キャップ付き円錐管を5秒間旋回し、防腐剤とサンプルを完全に混合し、サンプルを氷の上に保存します。ラボに戻ると、16S DNA分析のためにマイナス20°C、メタトランスクリプトミクスRNA分析のためにマイナス70°Cでサンプルを保存します。フィルターコレクションの場合、完全にボトルを1回充填する前にボトルを条件付けするために、流水で無菌1リットルボトル全体を完全に充填して空にします。安定した表面に、無菌のルアーロックシリンジに流水のフルボリュームを引き込み、0.22ミクロンの毛穴サイズで無菌およびDNA/RNAフリー直径1.7センチメートルのポリエーテルスルホンフィルターにシリンジを接続します。フィルターを通して流水の全容を洗い流す。サンプルの体積全体を同じように濾過したら、約20ミリリットルの空気をシリンジに引き込み、フィルターを通して空気を押し込んで、フィルターから余分な水を取り除きます。次に、P1000マイクロピペットを使用して、フィルタのバレル内のピペットの先端でフィルターを水平に保持しながら、フィルタのより大きな開口部に2ミリリットルのDNA/RNA保存剤を追加し、防腐剤がフィルタに入ることを確認します。その後、各開口部の周りにパラフィンフィルムのしっかりと包まれた正方形でフィルターを密封し、氷の上の滅菌サンプルバッグにフィルタを置きます。サンプリングから戻ると、16Sまたはメタトランスクリプト分析用のフィルタをサンプルに保存します。サンプルの移管を開始する前に、10%漂白剤と70%エタノールで作業領域を清掃してください。沈み込みサンプルからの核酸抽出には、炎とエタノール殺菌金属工具を使用して、約250ミリグラムのサンプルをマイクロ遠心チューブに移します。フィルターサンプルからの核酸抽出には、70%エタノールと炎殺菌バイスグリップを使用して、滅菌表面のフィルターケーシングを破り、ケーシングからコアを取り除きます。無菌メスを使用して、コアの上部、底部、および継ぎ目に沿ってスライスし、滅菌ピンセットを使用してフィルターペーパーを折りたたみ、メスで小片に切ります。その後、フィルター片を、滅菌されていない表面に接触することなく、慎重にマイクロ遠心チューブに入れなさい。いずれかのタイプのサンプル内の細胞のリシスの場合、チューブを高速で細胞破壊器に供する。少なくとも5分後、サンプルを遠心分離し、上清を新しい滅菌マイクロ遠心チューブに移します。溶解バッファーを上清に1対1の比率で加え、溶液を提供されたフィルターに移します。フィルターを新しいマイクロ遠心チューブに入れ、400マイクロリットルの準備バッファーをチューブに加えます。遠心分離後、700マイクロリットルの洗浄バッファーをチューブに加え、フィルターを再び遠心分離します。フロースルーを廃棄した後、400マイクロリットルの洗浄バッファーをチューブに加えて遠心分離し、フィルターを新しい滅菌マイクロ遠心チューブに移します。DNAを溶出するには、50マイクロリットルのDNase/RNaseフリー水でフィルターを室温で5分間処理します。その間に、3つのHRCフィルターをコレクションチューブに入れ、600マイクロリットルのHRC準備液を加えます。遠心分離後、フィルターを新しい滅菌マイクロ遠心チューブに移し、溶出したDNAを遠心分離のためにフィルターに移します。フロースルーには、抽出されたDNAが含まれています。DNA 16S RNAライブラリーを作成するには、まず、標準的なPCRプロトコルを用いて16SリボソームRNA増幅用に新たに抽出したDNA産物を使用します。得られたPCR産物の7マイクロリットルと13マイクロリットルのDNaseフリー水を混合し、PCR溶液を2%アガロースゲルにロードします。その後、ゲルを60〜90分間90ボルトで実行し、増幅成功の証拠として386塩基対のバンドサイズを確認します。DNA 16S リボソーム RNA ライブラリを精製するには、明るいバンドを生み出した PCR 産物の 10 マイクロリットルと、無菌マイクロ遠心チューブにかすかなバンドを生じさせたサンプルの 13 マイクロリットルをプールし、各プールされたサンプルのナノグラムを 150 ~ 200 ナノグラムの新しい 2%ゲルの個々のウェルにロードします。示されているようにゲルを動かした後、ゲルから386塩基対バンドを物品切りし、市販キットを使用してDNAを精製します。次に、精製したDNAを塩酸塩10ミリモルトリスの30マイクロリットルで溶出し、精製されたライブラリをドライアイスに詰めてから、次世代シーケンシングに向けて出荷します。この代表的な分析では、1つを除くすべての抽出は成功と呼ばれます。PCR増幅後に観察された明るいバンドは、16Sプロトコルの成功を示します。16Sサンプルは最低1,000個の配列を持ち、少なくとも5,000個の配列が理想的であるのに対し、メタトランスクリプトサンプルは最低500,000個の配列を持ち、少なくとも200万個が理想的である必要があります。16Sおよびメタトランスクリプト法分析のための13の異なるストリームで21の異なる部位からの沈入サンプルが示されている。これらの21のサイトのうち、12はフラッキング活動の下流にあり、油圧破砕陽性に分類され、9はフラッキング活動の上流またはフラッキングが存在せず、油圧破砕陰性に分類される流域であった。PERMANOVA分析によって評価されるように、水圧破砕正負データの間で観察された分離は、水圧破砕陽性サンプルがフラッキングの影響を受けたことを示唆している。最も重要なランダムフォレスト予測因子は、サンプルを正しく区別するために最も重要な機能を明らかにします。ランダムフォレストモデルによって重要と識別された場合、水圧破砕陽性サンプルにおけるその抗菌性プロファイルは、負のサンプルを破砕する油圧でのプロファイルと比較することができます。それらが大きく異なる場合、それは殺生物剤を含むフラッキング流体がストリームに入った可能性があります。微生物は至る所にあるので、汚染はこの種の作業で重大な潜在的な問題です。初期サンプル転送手順は、特にこの傾向があります。微生物の生分解や他の代謝に興味がある場合は、RNAの散弾銃シーケンシングを使用して、活性微生物遺伝子発現を調べることができます。この技術により、その場所での細菌群集を調査するための分子技術の標準化と、細菌配列データのバイオインフォマティクス分析が可能になります。

evaluating-impact-hydraulic-fracturing-on-streams-using-microbial

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