Name: CRISPR/Cas9突然変異誘発のためのサンドフライ(フレボトムスパパタシ)胚微小注射 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 44 s
Description: 学ぶCRISPR/Cas9によるサンドフライ（Phlebotomus papatasi）の胚微小注射法。遺伝子機能解析と病媒昆虫のゲノム編集技術を確立し、ベクター制御戦略の発展に貢献します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

著者らは、ヴァネッサ・メルデナー=ハレルが原稿を批判的に読んでくれて感謝している。

砂のフライの供給のための血液源としてマウスを使用するは、国立衛生研究所(NIH)の実験動物のケアと使用のためのガイドの勧告に従って厳格に行われました。このプロトコルは、NIAID NIH(プロトコル番号LPD 68E)の動物管理および使用委員会によって承認されました。無脊椎動物はNIHガイドラインの対象とはなりません。
1. 針の準備 (図 1)
<ol><li>ムーティとハレル19に記載されているように針とベベルを引っ張ります。簡単に言えば、二段ガラスのマイクロピペットの引き手に針を引っ張り、ホウケイ酸ガラスの毛細血管を使用する。</li>
	<li>余分な細かい石を使用して、マイクロピペットベベラーに濡れたベベルで針を研ぎます。</li>
</ol>2. 胚の収集とマイクロマニピュレーション (図 2)
<ol><li>注射日の5日前に、血中の砂はコロニー維持のために日常的に行われるように雌を飛ばす。サンドフライコロニーの飼育手順および必要な材料については、Lawyerら.1インキュベーターの昆虫を湿度70%、26°Cで全開発中に維持する 方法をご覧ください。<ol>
<li>ある日、血液を摂食後、サイドポート付きの石膏ポットで100-150のグループによって血液供給された女性を捕獲する。コロニーのメンテナンスのために通常、糖溶液(30%スクロース - 小さな綿のボールを浸すのに十分な量)でそれらを供給することによって、女性を維持します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>2-3日目の送血後は、石膏ポットを湿らせないでください。乾燥した基材にメスを保つことは、女性が湿った環境で卵を産むことを好むので、早期産を防ぎます。</li>
	<li>5日目の送食後に、胚の採取、微小改分、および微小注射を行う。産卵室に湿ったろ紙を導入します。寝たての胚は完全に発達した絨毛を持たず、白く見える。白い胚の視覚化を容易にするために手順の間に黒いろ紙を使用してください。</li>
	<li>口の吸引器を使用してサイドポートを介して産卵室に石膏ポットから女性の小さなグループを転送します。湿った基質(ろ紙)の存在は、オビポジットに女性を誘導する。</li>
	<li>30〜60分後、チャンバーから新しく敷設された胚で濾紙を慎重に取り出します。濾紙と胚をペトリ皿に3時間まで保管します。この間、定期的にフィルターペーパーの水分レベルを評価して、湿った状態を保つようにします。この間、女性の新しいグループでステップ2.4〜2.6を繰り返し、できるだけ多くの胚を収集します。</li>
	<li>注入のための顕微鏡のスライドを準備する:手動で非常に細かい絵筆で卵を一つずつ収集し、慎重にガラスカバースリップをトッピング顕微鏡スライドに置かれた湿った黒いフィルター紙の別の部分にそれらを転送します。<ol>
<li>濾紙に水を加え、胚を湿らせたままにするのに十分ですが、カバースリップから離れたり、カバースリップの下に吸い込まれたりしないようにします。カバースリップに対して胚を並べる。カバースリップは、注射中に卵が転がり落ちるのを防ぐバックストップとして機能します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 胚注射 (図 3)
<ol><li>卵の収集開始後2.5〜3時間の注射を開始します。室温および周囲の実験室の湿気で注入を行う。</li>
	<li>整列した胚が湿った状態に保たられるように十分な水を持っていることを確認してください。 注:注射中に胚を湿らせておくのが重要です。注射工程で湿っていないと、注射は、針が胚を突き刺すのに問題があるため困難になる。正しい量の水は、胚が周囲に半月板の水を持っている点ですが、カバースリップは水の上に浮かばず、胚がカバースリップの下に押し込みます。注射中に胚の周りの水の量を監視することが重要です。必要に応じて水を加え、胚を湿らせた状態に保ちます。</li>
	<li>ブラシを水で濡らし、濾紙の裏端に水を移して、慎重に水を加えます。この方法で水を追加すると、ゆっくりと制御された方法で水を追加できるため、胚を湿らせ続けるのに十分な量が追加されます。水が多すぎると胚が整列して浮き出てしまい、胚を注入するのが難しくなる。</li>
	<li>バックロード注入はマイクロインジェクション針に混入する。手描きのホウケイ酸ニードルフィラーを使用して、約0.5〜1μLの注射ミックスを針に加え、ゲルローディングピペットチップも使用できます。この注入ミックスは、市販の組換えCas9タンパク質(300 ng/μL)と混合した特定の遺伝子座を標的にするように設計された1つまたは複数のガイドRNA(それぞれ80 ng/μL)で構成されています。</li>
	<li>射出圧力を30 psiから始め、注射トリガを押して針の先端から空気を排出します。これにより、注射ミックスが流れるよう注射の針先に強制的にします。この時点で、注入材料が流れ始めるまでホールド/定圧をゆっくりと上げ、針から流れる注入ミックスのポイントのすぐ下になるようにホールド/定圧を下げます。ゲート設定は、少量の材料が胚に入るのを見ることができるように、十分な注入材料を提供する必要があります。 注: ショウジョウバエ や蚊に使用される他のプロトコルと同様のハロカーボンオイルの下での砂フライ胚の注入は、最初はテストされましたが、これらの注射の生存率は非常に低かった。上記のように湿った濾紙上の注射に切り替えることによって生存率が向上した。</li>
	<li>胚の側面に針を挿入します。胚を突き刺すために針を助けるバックストップとして胚の後ろのカバースリップを使用してください。針を穏やかに取り除く前に、少量の注射ミックスを胚に送り込みます。</li>
	<li>針を取り外した直後に、注射器を押して、針先から詰め戻り材料を取り除きます。これは、針が詰まるのを防ぐのに役立ちます。</li>
	<li>次の胚に進みます。各注射の間に、濾紙が湿っていて、針が詰まっていることを確認してください。</li>
	<li>すべての胚が注入されたら、注入された胚の数を数え、ランニング集計を維持します。</li>
	<li>カバースリップが浮くように濾紙に水を加えてカバースリップを取り外します。この時点で、プローブ(昆虫のピンを先端に接着した木製アプリケータースティック)を使用してフィルターペーパーを所定の位置に保持し、指を使用して注入された胚からカバースリップを引き離します。</li>
	<li>カバースリップが取り除かれたら、濾紙から余分な水を消します。</li>
</ol>4. 射出後の飼育 (G0)(図 4)
<ol><li>湿った濾紙のいくつかの層の上に胚を入れた濾紙をペトリ皿に入れ、湿度を維持します。他の胚を注入するために必要な時間の間、胚をここに保管してください。胚は、このような最大3時間保持することができる。注射後、彼らはゆっくりと茶色になります。</li>
	<li>すべての胚が注入されたら、手動で以前に湿らせた小さなサイズの石膏ポットに移します。各ポットにあまりにも多くの胚を入れて、それらの間の距離を維持しないでください, 個人間の可能な真菌汚染を避けるために.鍋をスクリーンで覆い、開発全体の間に湿度70%と26°Cのインキュベーターに維持されるサンドフライコロニーの卵のために通常行われるようにそれらを保存します。</li>
	<li>1日目の注射後、損傷した胚と死んだ胚をすべてペイントブラシで取り除きます。0.5%プロピオン酸の100 μLを加えて、注入された胚を含む石膏ポットに滴下して、真菌汚染を制限します。注射プロセス中に損傷を受けた胚からの細胞質の放出は、真菌の成長に特に有利である。</li>
	<li>毎日石膏ポットをチェックし、悪いまたは死んだ胚を削除します。真菌が存在する場合は、感染したすべての胚を除去し、0.5%プロピオン酸の数滴を追加します。</li>
	<li>8日目から12日目の注射後の幼虫ハッチ。1日2回、新たに出現した幼虫を5〜10のグループで新しい石膏ポットに移します。少量の食べ物を加え、週に2〜3回食べ物をチェックしてください。<ol>
<li>幼虫の食物の量を注意深く監視し、真菌汚染のリスクを大きく高めます。サンドフライ幼虫は、十分な食べ物がない場合、彼らはカニバリズムすることができますが、グループでより良い生き残ることができます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>幼虫が子犬になると、女性を処女として維持するためにセックスでそれらを分離します。生存者が多い場合は、男性を捨て、メスだけを飼います。 注:男性と女性の両方が突然変異を運ぶことができ、送信することができます。しかし、メスは渡る前に処女を保たれなければならないので、セックスによってwt昆虫を分離することを避けるためにG0 注入された女性だけを使用する方が簡単です。成人の生存者の数が少なく、この場合、ソートされたwt処女女性と交配される場合、G0 の男性はバックアップとして保持することができます。</li>
</ol>5. 変異型対立体の選択とスクリーニング (図5)
<ol><li>ケージ内のwt雄を持つG0 メスをマスクロスする。通常のコロニーの維持のために行われるように、それらを完全に供給する血液。</li>
	<li>1日は、授乳後、口の吸引器を使用して個々の石膏チューブに個々の石膏チューブに2〜3重量の男性と各G0 メスを転送します。毎日変わった小さな綿のボールに砂糖でハエを養い、石膏の水分が産卵に適していることを確認するために水の注射器を使用しています。</li>
	<li>G0 メスが卵を産んだ後(G1に対応)、後のジェノタイピングのために個々の、アノゲートされたエペンドルフチューブに体を集める。通常のwtコロニーに対して行われるように胚を維持する。</li>
	<li>選択した方法によりG0 メスからDNAを抽出する。</li>
	<li>例えばCRISPRカットの予想領域を取り巻くプライマーを用いたPCRアッセイを設計することにより、変異の存在を求めてDNAをスクリーニングする。</li>
	<li>変容の証拠を示すG0メスによって敷設されたG1胚のみを保管する。これらのG1胚が子犬に発達する場合は、性別によってそれらを分離し、メスだけを保つ。同じG0メスからwtの男性にG1メスを渡り、それらを血液中に供給し、2〜3人の女性と4〜5人の男性の小グループで小さなサイズの容器に移します。 注:すべてのG1 個体はユニークな突然変異を運ぶ機会があるので、生き残った個体の数が高すぎない場合は、G1 メスをwt男性と個別に横断する方が良いです。同じチューブに異なる突然変異を運ぶ複数の雌の場合はまれであるが、発生する可能性があります。このような場合、ジェノタイピング後に観察された場合、G2 子孫の女性は、wt雄に個別に交配する必要があります。この交配スキームは、子孫における複数の突然変異の可能性を回避する。</li>
	<li>産卵後、G1 メスの体を収集し、突然変異のためにそれらをスクリーニングします。少なくとも1人の女性が突然変異の証拠を示した管だけを保管してください。</li>
	<li>後の世代のために単一のペアをクロスします。産卵後、両親が突然変異の存在をスクリーニングする。両親が同じ突然変異のためにホモ接合体になるまで、各世代で繰り返します。一度特定されると、彼らはホモ接合突然変異株の創設者になります。</li>
</ol>

<ol><li>Lawyer, P., Killick-Kendrick, M., Rowland, T., Rowton, E., Volf, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+colonization+and+mass+rearing+of+phlebotomine+sand+flies+%28Diptera%2C+Psychodidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Parasite%22%5BJournal%5D)">Laboratory colonization and mass rearing of phlebotomine sand flies (Diptera, Psychodidae).</a> Parasite. 24, 42(2017).</li>
<li>Pelletier, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+recognition+of+Leishmania+major+poly-beta-galactosyl+epitopes+by+galectin-9%3A+possible+implication+of+galectin-9+in+interaction+between+L.+major+and+host+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Specific recognition of Leishmania major poly-beta-galactosyl epitopes by galectin-9: possible implication of galectin-9 in interaction between L. major and host cells.</a> Journal Biological Chemistry. 278 (25), 22223-22230 (2003).</li>
<li>Kamhawi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+insect+galectins+in+parasite+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A role for insect galectins in parasite survival.</a> Cell. 119 (3), 329-341 (2004).</li>
<li>Louradour, I., Ghosh, K., Inbar, E., Sacks, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+Mutagenesis+in+Phlebotomus+papatasi%3A+the+Immune+Deficiency+Pathway+Impacts+Vector+Competence+for+Leishmania+major%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 Mutagenesis in Phlebotomus papatasi: the Immune Deficiency Pathway Impacts Vector Competence for Leishmania major.</a> MBio. 10 (4), (2019).</li>
<li>Xi, Z., Ramirez, J. L., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Aedes+aegypti+toll+pathway+controls+dengue+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">The Aedes aegypti toll pathway controls dengue virus infection.</a> PLoS Pathogens. 4 (7), 1000098(2008).</li>
<li>Ramirez, J. L., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Toll+immune+signaling+pathway+control+conserved+anti-dengue+defenses+across+diverse+Ae.+aegypti+strains+and+against+multiple+dengue+virus+serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development+and+Comparative+Immunology%22%5BJournal%5D)">The Toll immune signaling pathway control conserved anti-dengue defenses across diverse Ae. aegypti strains and against multiple dengue virus serotypes.</a> Development and Comparative Immunology. 34 (6), 625-629 (2010).</li>
<li>Ramirez, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+tripartite+interactions+between+the+Aedes+aegypti+midgut+microbiota%2C+innate+immune+system+and+dengue+virus+influences+vector+competence%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Reciprocal tripartite interactions between the Aedes aegypti midgut microbiota, innate immune system and dengue virus influences vector competence.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (3), 1561(2012).</li>
<li>Hu, C., Aksoy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+responses+regulate+trypanosome+parasite+infection+of+the+tsetse+fly+Glossina+morsitans+morsitans%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Innate immune responses regulate trypanosome parasite infection of the tsetse fly Glossina morsitans morsitans.</a> Molecular Microbiology. 60 (5), 1194-1204 (2006).</li>
<li>Meister, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anopheles+gambiae+PGRPLC-mediated+defense+against+bacteria+modulates+infections+with+malaria+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Anopheles gambiae PGRPLC-mediated defense against bacteria modulates infections with malaria parasites.</a> PLoS Pathogens. 5 (8), 1000542(2009).</li>
<li>Meister, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+signaling+pathways+regulating+bacterial+and+malaria+parasite+infection+of+the+mosquito+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Immune signaling pathways regulating bacterial and malaria parasite infection of the mosquito Anopheles gambiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (32), 11420-11425 (2005).</li>
<li>Telleria, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspar-like+gene+depletion+reduces+Leishmania+infection+in+sand+fly+host+Lutzomyia+longipalpis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Caspar-like gene depletion reduces Leishmania infection in sand fly host Lutzomyia longipalpis.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (16), 12985-12993 (2012).</li>
<li>Sant'Anna, M. R., Alexander, B., Bates, P. A., Dillon, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+in+phlebotomine+sand+flies%3A+Xanthine+dehydrogenase+knock+down+by+dsRNA+microinjections%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Gene silencing in phlebotomine sand flies: Xanthine dehydrogenase knock down by dsRNA microinjections.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 38 (6), 652-660 (2008).</li>
<li>Sant'anna, M. R., Diaz-Albiter, H., Mubaraki, M., Dillon, R. J., Bates, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+trypsin+expression+in+Lutzomyia+longipalpis+using+RNAi+enhances+the+survival+of+Leishmania%5BTitle%5D)+AND+%22Parasites+and+Vectors%22%5BJournal%5D)">Inhibition of trypsin expression in Lutzomyia longipalpis using RNAi enhances the survival of Leishmania.</a> Parasites and Vectors. 2 (1), 62(2009).</li>
<li>Diaz-Albiter, H., Mitford, R., Genta, F. A., Sant'Anna, M. R., Dillon, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+scavenging+by+catalase+is+important+for+female+Lutzomyia+longipalpis+fecundity+and+mortality%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species scavenging by catalase is important for female Lutzomyia longipalpis fecundity and mortality.</a> PLoS One. 6 (3), 17486(2011).</li>
<li>Barrangou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+provides+acquired+resistance+against+viruses+in+prokaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes.</a> Science. 315 (5819), 1709-1712 (2007).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Pawelczak, K. S., Gavande, N. S., VanderVere-Carozza, P. S., Turchi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulating+DNA+Repair+Pathways+to+Improve+Precision+Genome+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Modulating DNA Repair Pathways to Improve Precision Genome Engineering.</a> ACS Chemical Biology. 13 (2), 389-396 (2018).</li>
<li>Martin-Martin, I., Aryan, A., Meneses, C., Adelman, Z. N., Calvo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+sand+fly+embryo+microinjection+for+gene+editing+by+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Optimization of sand fly embryo microinjection for gene editing by CRISPR/Cas9.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (9), 0006769(2018).</li>
<li>Meuti, M., Harrell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+and+Injecting+Embryos+of+Culex+Mosquitoes+to+Generate+Null+Mutations+Using+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations Using CRISPR/Cas9.</a> JoVE. (163), e61651(2020).</li>
<li>Chaverra-Rodriguez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+delivery+of+CRISPR-Cas9+ribonucleoprotein+into+arthropod+ovaries+for+heritable+germline+gene+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Targeted delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein into arthropod ovaries for heritable germline gene editing.</a> Nature Communications. 9 (1), 3008(2018).</li>
<li>Chaverra-Rodriguez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+mutagenesis+of+Nasonia+vitripennis+through+ovarian+delivery+of+CRISPR-Cas9+ribonucleoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Germline mutagenesis of Nasonia vitripennis through ovarian delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein.</a> Insect Molecular Biology. , (2020).</li>
<li>Heu, C. C., McCullough, F. M., Luan, J., Rasgon, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9-Based+Genome+Editing+in+the+Silverleaf+Whitefly+%28Bemisia+tabaci%29%5BTitle%5D)+AND+%22CRISPR+Journal%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9-Based Genome Editing in the Silverleaf Whitefly (Bemisia tabaci).</a> CRISPR Journal. 3 (2), 89-96 (2020).</li>
<li>Macias, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9-Mediated+Gene-Editing+in+the+Malaria+Mosquito+Anopheles+stephensi+by+ReMOT+Control%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%2C+Genomes+and+Genetics+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Cas9-Mediated Gene-Editing in the Malaria Mosquito Anopheles stephensi by ReMOT Control.</a> Genes, Genomes and Genetics (Bethesda). 10 (4), 1353-1360 (2020).</li>
</ol>

ここでは、フレボトムスパパタシサンドハエでCRISPR/Cas9による標的性変異誘発のための最近開発された胚微小注射法を紹介する。昆虫遺伝子改変のための胚微小注射は、1980年代半ばにショウジョウバエで開発され、現在では多種多様な昆虫に日常的に使用されています。遺伝子組み換え物質の送達のための他の方法は、例えばReMOT20、21、22、23およびエレクトロポレーション23のような昆虫で使用するために開発されている。しかし、胚微小注入は現在、これらの材料の送達のための最も汎用性が高く、効率的な方法である。ReMOTは、送達方法として非常に有望であり、胚微小注射と比較して成人注射の相対的な容易さのために、砂ハエでの使用のために検討されるべきである。しかし、...

ベクター媒介性疾患は、絶え間ない進化における公衆衛生上の大きな脅威です。世界保健機関(WHO)によると、非常に異なる系統形成家族(蚊、ダニ、ノミなど)に広がる何百ものベクター種が膨大な数の微生物病原体の伝染を引き起こし、その結果、年間70万人以上の人が死亡する。ベクター昆虫の中で、フレボトミン砂ハエ(ディプテラ、サイコディダエ)は広大な群を構成し、80種の実証済みベクター種が異なる地理的領域で見られる明確な現象学的形質およびベクター能力を示す。彼らは リーシュマニア属の原虫寄生虫のベクターであり、リーシュマニアーゼの約130万人の新しい症例を引き起こし、年間約20,000〜30,000人の死亡を引き起こす。リーシュマニアーゼ臨床転帰は多様であり、自己制限的な皮病変から治療がない場合には致命的な内臓播種に至るまで症状が広がる。
砂のハエは厳密に地上の昆虫です。他のディプテラと比較して比較的長いライフサイクルは、温度、湿度、栄養などの異なるパラメータに応じて、最大3ヶ月間続きます。それは1つの胚段階(6〜11日)、4つの幼虫段階(合計23〜25日間持続する)と1つのプパル段階(9〜10日)とそれに続く変態と成人から構成される。砂のハエは飼育のために湿気と暖かい環境を必要とします。オスもメスも、花の蜜から野生で得られる糖を食べる。卵の生産のために血液の食事から得られるタンパク質を必要とするので、女性だけが血液供給剤である。
研究の重要な焦点は、伝染性感染症の発症につながるベクター/寄生虫相互作用の性質を特定することです。他のベクター昆虫と同様に、砂ハエに固有のパラメータは、病原体を宿主に運び、伝染する能力として定義されるベクター能力に影響を与えることを示している。例えば、フレボトムス・パパタシサンドフライミドグ細胞によるガレクチンの発現は、寄生虫表面成分を認識する受容体として作用し、リーシュマニアメジャー2,3に対するそれらのベクター能力に直接影響を及ぼすことができる。昆虫免疫応答経路は、免疫不全(IMD)、リーシュマニアメジャー4のフレボトムスパパタシサンドフライベクター能力にも極めて重要である。感染性病原体の伝染を制御するベクター昆虫免疫応答経路の重要な役割は、Aedes aegypti蚊5、6、7、ツェツェフライグロッシナ・モルシタンス8、アノフェレスガンビア蚊9、10でも同様に報告されている。
サンドフライ/リーシュマニア相互作用の研究は、これらの昆虫での使用に適応した遺伝子発現修飾法の欠如によって制限されている。最近まで11、12、13、14の小さな干渉RNA(siRNA)による遺伝子のダウンレギュレーションのみが行われていた。この技術は、成人女性の微小注射に関連する死亡率によって制限され、機能の部分的な喪失しか起こらず、世代から世代へと伝達することができない。
CRISPR/Cas9技術は、砂ハエなどの非モデル生物の機能ゲノム研究に革命をもたらしています。バクテリオファージ15、16に対する防御のために原核生物中の適応免疫系から改変され、CRISPR Cas9システムは昆虫を含む優れた真核生物のゲノム編集ツールとして急速に適応されている。CRISPR/Cas9の標的ゲノム編集の原理は、特定のゲノム遺伝子座に対する単一ガイドRNA(sgRNA)の相補性に基づいています。Cas9ヌクレアーゼはsgRNAに結合し、sgRNAがその相補配列に関連するゲノムDNAに二本鎖DNA(dsDNA)破断を生み出します。Cas9-sgRNA複合体は、sgRNA中の17〜20の相補塩基によって標的配列に導かれ、dsDNAブレークは、次いで2つの独立した経路によって修復することができる:非相同端接合(NHEJ)または相同性指向修復(HDR)17。NHEJの修復は、休憩の単純な閉鎖を伴うが、頻繁に小さな挿入/削除イベントにつながる。HDRによるDNA修復は、ドナーDNA分子共有相同性を標的DNAとの間で修復用のテンプレートとして使用します。昆虫は両方の機械を持っています。
CRISPR/Cas9技術は、NHEJ修復経路を介して、選択された遺伝子座に突然変異を生成することができます。または、適切なドナーテンプレートを使用してHDR経路を介して、ノックインや発現レポーターなどのより複雑なゲノム編集戦略のために。サンドハエでは、免疫応答因子Relishの ヌル 変異対立体が 、フレボトムス・パパタシ4においてNHEJ媒介CRISPRを介して生成された。サンドフライ胚はまた、黄色をコードする遺伝子を標的とするCRISPR/Cas9ミックスを用いた別の研究で注射された。それでも、突然変異を運ぶ成人は18を産生しなかった。ここでは、NHEJ媒介CRISPR/Cas9による砂飛球標的突然変異誘発の詳細な方法について説明し、特にプロトコルの重要なステップである胚微小注射に焦点を当てる。

<table><tbody><tr><td>黒の濾紙4.25CM PK100</td><td>VWR</td><td>28342-012</td>約<td>46 X 22mmの長方形にカットします。これらはスライドとカバーガラスの間に配置され、注入中に胚の湿ったベース層として機能します。</td></tr><tr><td>カバースリップ</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>12-543A</td><td></td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>任意のブランド</td><td></td><td>胚の整列用</td></tr><tr><td>ガラススライド</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-550-A3</td><td>マイクロインジェクションのベース層 セットアップ 図2A</td></tr><tr><td>昆虫ケージ</td><td>カスタムメイドまたはいくつかの商用オプション</td><td></td><td>弁護士、フィリップ、ミレイユ・キリック・ケンドリック、トビン・ローランド、エドガー・ロートン、ペトル・ヴォルフを抱きしめ、交配する大人のためのポリカーボネートケージ。&ldquo;フレボトミンサンドフライ(双翅目、Psychodidae)の実験室でのコロニー形成と大量飼育。寄生虫24。2020年8月6日にアクセス。https://doi.org/10.1051/parasite/2017041。</td></tr><tr><td>幼虫の食べ物</td>は、ウサギのチャウとウサギの糞を混ぜて<td>カスタムメイド</td><td></td>しました<td>弁護士、フィリップ、ミレイユ・キリック・ケンドリック、トビン・ローランド、エドガー・ロートン、ペトル・ヴォルフ。フレボトミンサンドフライ(双翅目、Psychodidae)の実験室でのコロニー形成と大量飼育。寄生虫24。https://doi.org/10.1051/parasite/2017041。</td></tr><tr><td>マイクロキャップ 100ミリリットル</td><td>ドラモンド</td><td>1-000-1000</td><td>マイクロインジェクション針を埋め戻すために使用</td></tr><tr><td>口内吸引器</td><td>ジョン・W・ホック社</td><td>モデル612</td><td>HEPAフィルター付き</td></tr><tr><td>オリンパス SZX12</td><td>オリンパスライフサイエンス</td><td></td><td>マイクロインジェクション顕微鏡</td></tr><tr><td>オビポツ</td><td>ナルゲ社</td><td></td><td>オビポットは、底に2.5cmの穴を開けて125mlまたは500mlのストレイサイドプロリプロピレンジャーから作られ、パリの石膏1cmで満たされています。弁護士、フィリップ、ミレイユ・キリック・ケンドリック、トビン・ローランド、エドガー・ロートン、ペトル・ヴォルフ。&ldquo;フレボトミンサンドフライ(双翅目、Psychodidae)の実験室でのコロニー形成と大量飼育。寄生虫24。2020年8月6日にアクセス。https://doi.org/10.1051/parasite/2017041。</td></tr><tr><td>ペイントブラシ6-0</td>任意の<td>画サプライ会社</td><td>n / a</td><td>胚の整列に使用</td></tr><tr><td>プロピオン酸</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>402907</td><td>抗真菌剤</td></tr><tr><td>標準ガラス毛細血管</td><td>世界精密機器</td><td>1B100-3</td>マイクロ<td>インジェクション針トリ</td></tr><tr><td>オMPC100コントローラーとMP845マニピュレーター</td>サ<td>ッター機器</td><td></td><td>マイクロインジェクションコントローラーを作るために使用されますマイクロマニピュレーター</td></tr></tbody></table>

crispr/cas9突然変異誘発のためのサンドフライ(フレボトムスパパタシ)胚微小注射

Sand Fly (Phlebotomus papatasi) Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

サンドハエは リーシュマニア 種の自然ベクターであり、原虫寄生虫は皮病変から内臓病理に至るまで幅広い症状を生み出す。ベクター/寄生虫相互作用の性質を解読することは、 リーシュマニア の宿主への伝達をよりよく理解するために重要である。砂飛ぶベクトル能力を制御するパラメータ(すなわち、病原体を運び、伝達する能力)の中で、これらの昆虫に固有のパラメータが重要な役割を果たすることが示された。昆虫免疫応答は、例えば、 リーシュマニアに対するサンドフライベクター能力に影響を与える。このようなパラメータの研究は、これらの非モデル生物での使用に適応した遺伝子発現修飾の方法の欠如によって制限されている。小さな干渉RNA(siRNA)による遺伝子のダウンレギュレーションは可能ですが、技術的に困難であることに加えて、サイレンシングは機能の部分的な損失をもたらし、世代から世代へと伝えることはできません。CRISPR/Cas9技術による標的突然変異誘発は、最近 、フレボトムスパパタシ サンドフライに適応した。この技術は、特異的に選択された遺伝子座における転化可能な突然変異の生成につながり、目的の遺伝子を研究することを可能にする。CRISPR/Cas9システムは、後に非相同エンドジョイングレンス(NHEJ)または相同性駆動修復(HDR)のいずれかによって修復されたターゲット二本鎖DNA切断の誘導に依存しています。NHEJは、休憩の単純なクロージャで構成され、頻繁に小さな挿入/削除イベントにつながります。対照的に、HDRは、標的DNAと相同性を共有するドナーDNA分子の存在を修復のテンプレートとして使用する。ここでは、これまでにサンドフライベクターに適応した唯一のゲノム修飾技術であるNHEJを用いたCRISPR/Cas9による標的変異誘発に対するサンドフライ胚微小注入法を提示する。

ここで説明したCRISPR/Cas9マイクロインジェクションプロトコルは、前の出版物4で確立された前の出版物で確立されたサンドフライ変異体を生成する。このアプローチは、540人の個体のうち11人がこの処置を生き延び、そのうち9人が突然変異体であったため、非常に効率的な突然変異誘発を生じさせた。CRISPR/Cas9突然変異のガイドを設計する際、重要な最初のステップは、標的とする領域の周りの領域を配列することです。シーケンシングのテンプレートは、注射のための胚の供給源として使用される株からでなければなりません。ガイドを設計するために公開されたゲノム配列だけに頼るのは危険です。公開されたゲノムとプリガイド設計配列の違いは珍しいことではありません。場合によっては、対象遺伝子の周りの領域が配列決定されるときに、公開されたゲノム配列から設計されたガイドが存在しない(ハレル、個人的な観察)。さらに、この配列には、ジェノタイピング中に実際のCRISPR編集と誤りになる可能性のある一塩基多型(SNPs)が含まれる場合があります。したがって、ターゲット領域のシーケンスを確認することは、プロトコルの残りの部分...

このプロトコルは、胚の採取、注射、昆虫飼育、同定、および目的の突然変異の選択など、砂ハエにおけるCRISPR/Cas9標的突然変異のステップを詳述する。

CRISPR/Cas9突然変異誘発のためのサンドフライ(フレボトムスパパタシ)胚微小注射

Sand flies are the natural vectors for Leishmania species, protozoan parasites producing a broad spectrum of symptoms ranging from cutaneous lesions to ...

標的突然変異誘発は、最近になってサシチョウバエに適応したばかりで、これらのベクター昆虫の関心遺伝子の役割と機能を理解するための重要な技術です。胚マイクロインジェクションは、昆虫のゲノム編集において非常に重要なステップですが、私たちが扱っている種、私たちの場合はサシチョウバエに適応させる必要があります。他の昆虫種と比較して、サシチョウバエの胚は非常に小さいです。発達には長い時間がかかり、特に湿度のレベルに敏感です。注射の5日前に、定期的なコロニーの維持管理と同様に、雌のサシチョウバエに血液を供給します。給餌後1日、血液を与えられた雌をサイドポートのある石膏ポッドで捕獲し、100〜150のグループでハエに30%のショ糖溶液を与えます。授血後5日目に、湿った白い濾紙を産卵室に入れます。そして、口吸引器を使用して、石膏ポッドから約10匹の女性を集めて産卵室に移します。30〜60分後、ペトリ皿と濾紙をエギングチャンバーから取り出します。それに注意を払いながら、濾紙は湿ったままで、この期間を通じて新しい女性と胚のグループを収集し続けます。すべての胚を採取したら、実体顕微鏡と非常に細いペイントブラシを使用して、約50個の胚を湿った黒い濾紙の個々の部分に慎重に移し、顕微鏡スライドに置き、スライドごとに1枚のカバースリップをトッピングします。各濾紙に十分な水を加えて、胚が浮いたりカバースリップの下に吸い込まれたりしないように湿らせ、胚をカバースリップに並べます。卵の収集開始から2〜3時間後、スライドを解剖顕微鏡の下に置き、絵筆を使用して濾紙の裏側に慎重に水を追加します。0.5〜1マイクロリットルの負荷注入混合物をマイクロ注入針に戻し、顕微鏡下で圧力1平方インチあたり30ポンドに設定された空気圧注入コントローラーに針を取り付けます。トリガーを押すと、針先から空気が排出されます。空気が抜けたら、保持圧力をゆっくりと上げます。注入材料が流れ始めたら、針から流れる注入混合物の点のすぐ下まで保持圧力を下げ、針を最初の胚の側面に挿入します。胚の後ろのカバースリップをバックストップとして使用して、針を静かに取り外す前に、少量の注入混合物を胚に送液します。針を取り外した直後に、インジェクターを押して針先から背部に充填された物質を取り除き、次の胚に進みます。すべての胚が注入されたら、注入された胚の数を数えて連続集計を行い、カバースリップが浮くように濾紙に水を加えます。次に、プローブを使用して濾紙を所定の位置に保持し、カバースリップを胚から引き離します。そして、彼は滑り台から余分な水分を拭き取るための濾紙でした。濾紙を新しいペトリ皿の湿った濾紙の束に移し、各胚を湿らせた小さなサイズの石膏ポッドに密集さずに手動で移します。次に、ポッドをスクリーンで覆い、ポッドを湿度70%の26度のインキュベーターに保管します。ほとんどの成功したマイクロインジェクションプロトコルと同様に、注入される胚に適した優れたマイクロインジェクション針が重要です。優れた鋭利な針は、注入後に材料が逃げることを許さずに、胚を容易に貫通することができます。引っ張られた針には、長すぎるテーパーがあってはなりません。そうしないと、テーパーの大部分で針の内腔が非常に狭くなり、材料を針に押し込むのに十分な高い注入圧力を得ることが困難になります。注射後に飼育された健康な胚は保持し、損傷した真菌で汚染された、乾燥した、または変形した胚は廃棄する必要があります。潜在的な変異対立遺伝子は、予想される切断部位の周囲の領域のPCR分析により、注射後に飼育された個体で特定できます。注入した胚を用いて変異株を樹立した後、ジェノタイピングPCRにより、ホモ接合型変異体の兄弟交配を同定することができます。優しく、胚を操作し、注入するための良い針を持つことが不可欠です。そして、胚が全手順を通じて水分補給されていることを確認するためです。一部のハエのゲノム編集は始まったばかりです。この技術は、より複雑なゲノム改変戦略が続くべき最初のステップです。

sand-fly-phlebotomus-papatasi-embryo-microinjection-for-crisprcas9

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

地中海のショウジョウバエ(メドフライ)Ceratitis...

世界的な農業害虫昆虫における胚のマイクロインジェクションを介して、核酸の送達、<em&gt;チチュウカイミバエ</em

キョウソヤドリコバチ胚のマイクロインジェクションは、ゲノムの遺伝の変更を生成するため不可欠な方法です。マイクロインジェクションと大幅にこの生物の将来ゲノム操作を容易にするキョウソヤドリコバチ胚移植の手順の詳細については、ここで説明しました。...

胚のインジェクションと移植キョウソヤドリコバチゲノム操作手法

このプロトコルは、CRISPR/Cas9遺伝子編集ツールで動作するように最適化された Culex quinquefasciatus...

キュレックス・キンケファシアトゥスにおける効率的な部位特異的変異誘発のための胚微小注入技術

CRISPR/Cas9は、非モデル生物の遺伝子機能を特徴付けるためにますます使用されています。このプロトコルは、注射ミックスの調製から蚊の胚の取得と注入に、および必要な突然変異のために注入された蚊とその子孫を飼育、横断、およびスクリーニングする方法に 、Culex...

CRISPR/Cas9を使用してヌル突然変異を生成するための Culex 蚊の胚の調製と注入

我々は、卵の飼育、マイクロインジェクション、およびゲノム編集後に変異株を生成し維持するために、ファイヤーブラット サーモビア家電...

ファクトブラトサーモビア家電におけるゲノム編集のための卵マイクロインジェクションと効率的な交配

ここでは、 ナソニアビトリペンシス での効率的なプパルおよび成人注射を胚微小注射の代替手段として説明し、RNA干渉(RNAi)またはCRISPR/Cas9ゲノム編集によるRNAサイレンシングまたは遺伝子ノックアウトのいずれかを使用して目的の遺伝子の機能解析を可能にする。...

ナソニアビトリペニスにおけるRNAiおよびCRISPR遺伝子編集のためのプパルおよび成人注射

昆虫の真社会性の多くの特徴は、コロニー内のコミュニケーションと分業に依存しています。マイクロインジェクションとCRISPRを介した突然変異誘発によるアリ胚の主要な調節遺伝子の遺伝子操作は、真社会性昆虫の利他的行動の性質に関する洞察を提供します。...

アリハルペグナトス塩析装置におけるCRISPRを介した突然変異誘発のための胚注射

ここでは、CRISPR/Cas9ゲノム編集によって作成された Helicoverpa armigera...

CRISPR/Cas9ゲノム編集 ヘリコベルパ・アルミゲラ (Hübner)の胚マイクロインジェクションとノックアウト変異体の同定

ここには、CRISPR/Cas9ベースのゲノム編集を介してゲノムを改変する目的で、または生殖系列形質転換を介して顕著な転移性要素を追加する目的で、前細胞トウモロコシウンカ胚を収集してマイクロ注入するためのプロトコルがあります。...

トウモロコシウンカ、 ペレグリヌスマイディス、CRISPR/Cas9ゲノム編集のための胚のマイクロインジェクション

この論文は、オリエンタルショウジョウバエBactrocera dorsalisのCRISPR/Cas9突然変異誘発のための段階的なプロトコルを提示します。この標準化されたプロトコルによって提供される詳細な手順は、B.

オリエンタルショウジョウバエバクトセラ背側のCRISPR/Cas9変異誘発のためのプロトコル

この記事では、ショウジョウバエのphiC31インテグラーゼ媒介トランスジェネシスを例に、トランスジェニックフライを作成するための重要なステップである胚マイクロインジェクションの最適化されたプロトコルを紹介します。...

ショウジョウバエにおけるトランスジェネシスのための胚マイクロインジェクション

学ぶCRISPR/Cas9によるサンドフライ（Phlebotomus papatasi）の胚微小注射法。遺伝子機能解析と病媒昆虫のゲノム編集技術を確立し、ベクター制御戦略の発展に貢献します。

CRISPR/Cas9突然変異誘発のためのサンドフライ(フレボトムスパパタシ)胚微小注射

さらに動画を探す