Name: 固体癌の病理学的進行を再現するための3D細胞印刷低酸素癌オンチップ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-05T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: 学ぼう、3Dバイオプリンティングを用いた低酸素ガス透過性バリアとガラスカバーによる固体癌の中心低酸素モデル構築法。薬剤効果予測と患者特異的な抗がん剤処方、進行性がんの迅速診断に応用可能です。

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この研究は、文部省(2020R1A6A1A03047902およびNRF-2018H1A1A1062091)と韓国政府(MSIT)が出資する韓国国立研究財団(NRF)によって支援されました。NRF-2019R1C1C1009606およびNRF-2019R1A3A3005437)。

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<li>Kang, T. -Y., Hong, J. M., Jung, J. W., Yoo, J. J., Cho, D. -W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+assessment+of+a+microfluidic+network+system+for+oxygen+transport+in+engineered+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Design and assessment of a microfluidic network system for oxygen transport in engineered tissue.</a> Langmuir. 29 (2), 701-709 (2013).</li>
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<li>Brown, A. C., De Beer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+stereolithography+%28STL%29+slicing+and+G-code+generation+algorithm+for+an+entry+level+3-D+printer%5BTitle%5D)+AND+%222013+Africon+%28IEEE%29%22%5BJournal%5D)">Development of a stereolithography (STL) slicing and G-code generation algorithm for an entry level 3-D printer.</a> 2013 Africon (IEEE). , 1-5 (2013).</li>
<li>Shim, J. -H., Lee, J. -S., Kim, J. Y., Cho, D. -W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioprinting+of+a+mechanically+enhanced+three-dimensional+dual+cell-laden+construct+for+osteochondral+tissue+engineering+using+a+multi-head+tissue%2Forgan+building+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Micromechanics+and+Microengineering%22%5BJournal%5D)">Bioprinting of a mechanically enhanced three-dimensional dual cell-laden construct for osteochondral tissue engineering using a multi-head tissue/organ building system.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 22 (8), 085014(2012).</li>
<li>Gillispie, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+methodologies+for+extrusion-based+bioink+printability%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Assessment methodologies for extrusion-based bioink printability.</a> Biofabrication. 12 (2), 022003(2020).</li>
<li>Kim, B. S., Das, S., Jang, J., Cho, D. -W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+extracellular+matrix-based+bioinks+for+engineering+tissue-and+organ-specific+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Decellularized extracellular matrix-based bioinks for engineering tissue-and organ-specific microenvironments.</a> Chemical Reviews. 120 (19), 10608-10661 (2020).</li>
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著者らは開示を持っていません。

本研究では、3D細胞印刷技術に基づく低酸素癌オンチップの製造プロセスについて説明する。設計されたチップにおける低酸素勾配の形成は、コンピュータシミュレーションを通じて予測された。不均質な低酸素勾配を誘発できる環境を、3Dプリントされたガス透過性バリアとガラスカバーを組み合わせた簡単な戦略を通じて再現した。偽パリセードおよび癌幹細胞の少ない集団を含む神経膠芽腫の低酸素関連の病理学的特徴を、チップの低酸素勾配条件下で再現した。
生産性と再現性を向上させるために、2つの主要な製造ステップを、以前に公開されたモデル15と比較して順次変更した。まず、PDMSバリアを間接的に作製し、硬化剤を含有するPDMSの印刷性が悪く、これはワンステップダイレクト印刷方式ではなくリアルタイムで硬化する。したがって、より高い印字性を有する生体適合性PEVAは、犠牲型を製造するように適合し、PDMSを加え、ガス透過性バリアを作成した。第二に、スライドガラスの種類を親水性コーティングスライドガラスに変更し、バイオイン沈着および形状忠実度を支持するのに有利である。最後...

がんの微小環境は、がんの進行を促進する重要な要因です。生化学的、生物物理学的、細胞の手掛かりを含む複数の成分が、癌の病理学的特徴を決定する。これらの中でも、低酸素症は、がんの生存、増殖、および浸潤1と強く関連している。がん細胞の増殖と分裂が無限に生じるため、栄養素と酸素が継続的に枯渇し、低酸素勾配が生成されます。低酸素条件下では、細胞は低酸素転写因子(HIF)関連分子カスケードを活性化します。このプロセスは壊死性コアを誘導し、代謝変化を引き起こし、血管過形成および転移を2,3に開始する。その後、がん細胞の低酸素症が隣接する正常組織の破壊を引き起こす。さらに、低酸素症は、多因子的な様式における固形腫瘍の治療抵抗性と強く関連している。低酸素症は、放射線感受性が活性酸素種1,4のために制限される放射線療法を著しく妨げる可能性がある。また、癌微小環境のpHレベルを低下させると、薬物蓄積が減少する1.したがって、インビトロでの低酸素症に関連する病理学的特徴を再現することは、科学的および前臨床所見のための有望な戦略である。
がんの特定の微小環境をモデル化することは、がんの発症を理解し、適切な治療法を探求するために不可欠です。動物モデルは、その強い生理学的関連性のために広く使用されてきたが、種の違いや倫理的問題に関連する問題は5.さらに、従来の2Dおよび3Dモデルは、がん細胞の操作とリアルタイムイメージングを可能にして詳細な分析を行うことができますが、その構造と細胞の複雑さは完全に再現できません。例えば、スフェロイド中の癌細胞凝集がコアに自然に低酸素症を発生させることができるので、癌スフェロイドモデルは広く使用されている。さらに、多数の均一なサイズのセルラースフェロイドは、プラスチックまたはシリコーンベースのマルチウェルシステム6,7を使用して製造されている。しかし、従来のプラットフォームで癌組織の正確な不均一構造を捕捉することに関しては柔軟性が低く、がん研究を改善するための高度なバイオ模倣プラットフォームを構築するための高度なバイオファブリケーション技術の確立が必要とされている8。
3D微小生理学的システム(MPS)は、癌細胞の複雑な幾何学的および病理学的進行を再現するための有用なツールである9.癌細胞は、成長因子およびケモカインの生化学的勾配を感知し、機械的不均一性をシステム上で再現するので、がんの開発の重要な特徴をインビトロで調べることができる。例えば、癌の生存率、転移性悪性度、および様々な酸素濃度に応じて薬剤耐性がMPS10、11を用いて検討されている。最近の進歩にもかかわらず、in vitroモデルの低酸素状態を発生させることは、物理的なガスポンプとの接続を含む複雑な製造手順に依存しています。そのため、がん特有の微小環境を構築するための簡便で柔軟な方法が必要です。
3D細胞印刷技術は、生体材料の空間的配置を正確に制御して、ネイティブの生物学的アーキテクチャ12を再現するため、かなりの注目を集めています。特に、がん微小環境の空間的特徴を構築するための高い制御性と実現可能性により、3D低酸素モデルの既存の限界を克服しています。3Dプリンティングは、レイヤごとのプロセスを通じてコンピュータ支援製造を容易にし、それによって、実際の組織アーキテクチャを模倣する複雑な形状の迅速で正確で再現可能な構造を提供します。3D MPSに対する既存の製造戦略の利点に加えて、癌進行の病態生理学的特徴は、生化学的、細胞、および生物物理学的成分13、14をパターニングすることによって再現することができる。
ここで、固体癌の不均質性を再現するための低酸素癌オンチップの3D細胞印刷戦略を提示する(図1)15。製造パラメータは、システム中枢低酸素形成の計算シミュレーションを介して決定した。がん-ストロマ同心円環は、神経膠芽腫細胞および内皮細胞を含むコラーゲンバイオインクスを用いて、固体癌の一種である神経膠芽腫の病態生理をエミュレートするために印刷された。放射状酸素勾配の形成は癌悪性腫瘍を悪化させた、強化された攻撃性を示す。さらに、患者固有の前臨床モデルへのチップの適用に関する将来の展望を示す。固形がん・模倣微小生理学的システムを作るための提案されたアプローチは、生体内およびインビトロの癌モデルとの間のギャップを埋めることが期待される。

<table><tbody><tr><td>細胞</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヒト臍帯静脈内皮細胞</td><td>プロモセル</td><td>C-12200</td><td></td></tr><tr><td>U-87 MG細胞</td><td>ATCC</td><td>ATCC HTB-14</td><td></td></tr><tr><td>Disposable</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 &mu;m シリンジ フィルター</td><td>ザルトリウス</td><td>16534-K</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 使い捨てシリンジ</td><td>ユング リム</td><td>10ml 21G32</td><td></td></tr><tr><td>10 mL ガラスバイアル</td><td>Hubena</td><td>A0039</td><td></td></tr><tr><td>10 mL セロロジカル ピペット チップ</td><td>SPL ライフサイエンス</td><td>91010</td><td></td></tr><tr><td>15 mL コニカル チューブ</td><td>SPL ライフサイエンス</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>18G プラスチック針</td><td>武蔵エンジニアリング</td><td>PN-18G-B</td><td></td></tr><tr><td>20G プラスチック テーパー ディスペンス チップ</td><td>武蔵エンジニアリング</td><td>TPND-20G-U</td><td></td></tr><tr><td>22x50 ガラス カバー</td><td>MARIENFIELD</td><td>0101142</td><td></td></tr><tr><td>25 mL 血清学的ピペット チップ</td><td>SPL ライフサイエンス</td><td>90125</td><td></td></tr><tr><td>3 mL 使い捨て注射器</td><td>HENKE-JET</td><td>4020-X00V0</td><td></td></tr><tr><td>40 &micro;m細胞ストレーナー</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 血清ピペットチップ</td><td>SPL ライフサイエンス</td><td>91005</td><td></td></tr><tr><td>50 mL コニカルチューブ</td><td>SPL ライフサイエンス</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 血清ピペットチップ</td><td>SPL ライフサイエンス</td><td>90150</td><td></td></tr><tr><td>50N精密ノズル</td><td>武蔵エンジニアリング</td><td>HN-0.5ND</td><td></td></tr><tr><td>アルミホイル</td><td>シンクワン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>キャピラリーチップ</td><td>Gilson</td><td>CP1000</td><td></td></tr><tr><td>Cell-scrapper</td><td>SPL lifescience</td><td>90030</td><td></td></tr><tr><td>Confocal dish</td><td>SPL lifescience</td><td>200350</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>プレコート組織学スライド</td><td></td><td>MATSUNAMI MAS-11</td><td></td></tr><tr><td>Reservoir</td><td>SPL lifescience</td><td>23050</td><td></td></tr><tr><td>T-75 細胞培養フラスコ</td><td>SPL ライフサイエンス</td><td>70075</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3DX プリンター</td><td>T&R Biofab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>オートクレーブ</td><td>JEIOTECH</td><td>AC-12</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>Cyrozen</td><td>1580MGR</td><td></td></tr><tr><td>共焦点レーザー顕微鏡</td><td>Olympus Life Science</td><td>FV 1000</td><td></td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>FISHER SCEINTIFIC</td><td>O221S366</td><td></td></tr><tr><td>Forcep</td><td>Korea Ace Scientific</td><td>HC.203-30</td><td></td></tr><tr><td>ハンドタリーカウンター</td><td>KTRIO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td>マリエンフィールド</td><td>0650030</td><td></td></tr><tr><td>インキュベーター</td><td>パナソニック</td><td>MCO-170AIC</td><td></td></tr><tr><td>層流キャビネット</td><td>DAECHUNG SCIENCE</td><td>CB-BMMS C-001</td><td></td></tr><tr><td>金属注射器</td><td>岩下エンジニアリング</td><td>SUSバレル 10CC</td><td></td></tr><tr><td>手術ハサミ</td><td>ヒロセ</td><td>電機HC.13-122</td><td></td></tr><tr><td>オーブン</td><td>JEIOTECH</td><td>OF-12, H070023</td><td></td></tr><tr><td>容積式ピペット</td><td>GILSON</td><td>NJ05652</td><td></td></tr><tr><td>冷蔵庫</td><td>SAMSUNG</td><td>CRFD-1141</td><td></td></tr><tr><td>ボルテックスミキサー</td><td>DAIHAN scientific</td><td>VM-10</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>DAIHAN SCIENTIFIC</td><td>WB-11</td><td></td></tr><tr><td>浄水器</td><td>WASSER LAB</td><td>DI-GR</td><td></td></tr><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.25 % Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Intron</td><td>IBS-BP007a</td><td></td></tr><tr><td>4% パラホルムアルデヒド</td><td>Biosesang</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% エタノール</td><td>Daejung</td><td>4018-4410</td><td></td></tr><tr><td>抗CD31抗体</td><td>Abcam</td><td>ab28364</td><td></td></tr><tr><td>抗HIF-1アルファ抗体</td><td>アブカム</td><td>ab16066</td><td></td></tr><tr><td>抗SHMT2/SHMT抗体</td><td>アブカム</td><td>ab88664</td><td></td></tr><tr><td>抗SOX2抗体</td><td>アブカム</td><td>ab75485</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>J10857-22</td><td></td></tr><tr><td>ブタ皮からのコラーゲン</td><td>ダリム ティッセン</td><td>PC-001-1g</td><td></td></tr><tr><td>DAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、二塩酸塩)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>内皮細胞増殖培地-2</td><td>プロモセル</td><td>C22011</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Gibco</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗マウス IgG (H+L) 交差吸着二次抗体、Alexa Fluor 488</td><td>Theromofisher</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギ IgG (H+L) 交差吸着二次抗体抗体、Alexa Fluor 594</td><td>Theromofisher</td><td>A-11012</td><td></td></tr><tr><td>High-glucose Dulbecco'S Modified Eagle Medium(DMEM)</td><td>Hyclone</td><td>SH30243-0</td><td></td></tr><tr><td>塩酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>311413-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Live/dead assay kit</td><td>Invitrogen</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IgG1, kappa monoclonal [15-6E10A7] - Isotype Control</td><td>Abcam</td><td>ab170190</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Phenol red溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290-100ML</td><td></td></tr><tr><td>ポリ(エチレン-酢酸ビニル)&nbsp;</td><td>ポリサイエンス</td><td>06108-500</td><td></td></tr><tr><td>ポリジメチルシロキサン</td><td>Dowhitech</td><td>シルガード184</td><td></td></tr><tr><td>ウサギIgG、ポリクローナル-アイソタイプ制御</td><td>Abcam</td><td>ab37415</td><td></td></tr>水<tr><td>酸化ナトリウム溶液</td><td>Samchun</td><td>S0610</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Biosesang</td><td>TRI020-500-50</td><td></td></tr>トリ<tr><td>パンブルー</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>ソフトウェア</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>COMSOL Multiphysics 3.5a</td><td>COMSOL AB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IMS beamer</td><td></td><td></td><td>社内ソフトウェア</td></tr><tr><td>SolidWorksパッケージ</td><td>Dassault Systems SolidWorks Corporation</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

固体癌の病理学的進行を再現するための3d細胞印刷低酸素癌オンチップ

3D Cell-Printed Hypoxic Cancer-on-a-Chip for Recapitulating Pathologic Progression of Solid Cancer

がん微小環境は、疾患の進行に大きな影響を与えます。特に、低酸素症は癌の生存、浸潤、および化学抵抗の主要な原動力である。低酸素関連癌病理を研究するためにいくつかのin vitroモデルが開発されているが、生体内で観察された癌微小環境の複雑な相互作用は、正確な空間制御の欠如のためにまだ再現されていない。その代わりに、がん生態学のより良いエミュレーションと正確な抗癌治療評価のための微小生理学的システムを作成するための3Dバイオファブリケーションアプローチが提案されている。ここでは、低酸素癌オンチップを作製する3D細胞印刷アプローチを提案する。チップ中の低酸素誘導成分は、酸素分布のコンピュータシミュレーションに基づいて決定した。癌-ストロマ同心円環は、神経膠芽腫細胞および内皮細胞を含むバイオインクを用いて、固体癌の一種を再現するために印刷された。得られたチップは、代表的な病態生理学的マーカーの形成を伴う癌における中央低酸素および悪化した悪性腫瘍を実現した。全体として、固形がん模倣微小生理学的システムを作るための提案されたアプローチは、がん研究のためのin vivoモデルとin vitroモデルの間のギャップを埋めることが期待される。

低酸素癌オンチップは、コンピュータ支援3D細胞印刷技術を用いて開発され、低酸素症および癌関連病理を再現した(図1)。酸素の輸送と消費は、3D ジオメトリ モデルを使用してシミュレートされました。このチップは、がん組織における放射状酸素拡散と枯渇を模倣するために同心円環の形で設計された(図2A)。酸素が拡散し、細胞によって消費された空間の制御体積を定義した後、中央低酸素発生のための適切な細胞密度を計算有限要素解析を通じて決定した(図2B、C)。
低酸素がんオンチップの3D印刷パスコードは、以前の結果に基づいて生成されました(図3)。犠牲のPEVA金型と癌構造のCADファイルは、STLフ...

低酸素症は腫瘍微小環境の特徴であり、癌の進行において重要な役割を果たしている。この記事では、低酸素関連の癌関連病理を再現するための3D細胞印刷技術に基づく低酸素癌オンチップの製造プロセスについて説明する。

固体癌の病理学的進行を再現するための3D細胞印刷低酸素癌オンチップ

Cancer microenvironment has a significant impact on the progression of the disease. In particular, hypoxia is the key driver of cancer survival, invasion, ...

低酸素症は、ゲノム不安定性および腫瘍形成を誘発する癌の開発の重要な原動力である。3Dバイオプリンティング技術を用いたインビトロの固形癌で中枢低酸素症を発生させる方法を実証する。この方法を使用すると、3Dプリントガス透過バリアとガラスカバーを組み合わせた簡単な戦略を用いて、ラジオ低酸素勾配を再現することができます。この低酸素癌オンチップ技術は、患者固有の抗癌薬処方を促進するために薬物有効性を予測するために使用することができる。また、積極的な癌の迅速な診断を可能にすることも期待されています。3ミリリットル中和コラーゲンプレゲル溶液の調製を支援するために、30ミリグラムのコラーゲンスポンジを5×5ミリメートル平方体に切った。滅菌10ミリリットルガラスバイアルに入れ、0.2ミクロンのシリンジフィルター0.1通常塩酸をバイアルに2.4ミリリットル加え、摂氏4度で3日間のインキュベーションを行い、毎分15回転します。消化後、40ミクロンの細胞ストレーナーを介して未消化のコラーゲン粒子をひずみ、酸性コラーゲン溶液を摂氏4度で最大7日間貯蔵する。1%中和コラーゲンプレゲル溶液のpHを調整するには、フェノールレッド溶液の30マイクロリットルを1%の最終濃度に加え、10XPBSの最終濃度に300マイクロリットルを加え、混合および遠心分離後の最終濃度10%に、通常の水酸化ナトリウム1個を使用してpHを7に中和し、色変化を確認し、蒸留水を3リットル単位に加えます。その後、pH調整された1%中和コラーゲンプレゲル溶液を摂氏4度で保存し、3日以内に使用します。中和したコラーゲンプレゲル溶液のゲル化を事前にチェックするには、プラス変位ピペットを使用して50マイクロリットルのコラーゲン液滴を小皿に加え、37°Cのインキュベーターで液滴を1時間インキュベートします。インキュベーションの終了時に、コラーゲンが透明色から不透明な白色に変化したかどうかを確認します。容器を傾けて、コラーゲンが容器の底に付着していることを確認します。そして、溶液中にコラーゲンコンストラクトが壊れていないことを確認するために、液滴にPBSを注ぎます。犠牲 PEVA 金型の 3D 印刷の場合は、[ファイル] をクリックしてファイル タイプを STL として保存し、3D CAD ファイルを STL ファイルに変換し、[オプション] をクリックしてフォームを ASCII として出力して G コードを生成します。生成された STL ファイルをインポートするには、[ファイル] をクリックして STL ファイルを開き、保存した STL ファイルを選択します。犠牲 PEVA 金型の G コードを自動的に生成するには、STL-CAD 交換器のスライス モデルを選択します。その後、チップ製造用の印刷経路を生成するには、摂氏110度で500キロパスカルの空気圧で50ゲージの精密ノズルを使用して、犠牲PEVA型を無菌接着剤親水構造スライドに印刷します。PDMSバリアをキャストするには、PDMSベースエラストマー6ミリリットルと600マイクロリットルの硬化剤をプラスチック製の貯蔵所に5分間混合し、均質にブレンドされた溶液を10ミリリットルの使い捨て注射器にロードする。20ゲージのプラスチックのテーパードディスペンサーチップをシリンジに装備し、ブレンドPDMS溶液で犠牲PEVA金型を充填します。ブレンド PDMS はこの犠牲 PEVA 金型を凸面で埋め、バリアは金型よりも高くなります。PEVAを溶かさないように、40°CのオーブンでPDMSバリアを36時間以上硬化させた後、精密ピンセットを使用して犠牲PEVA型を取り外し、オートクレーブで摂氏120度でガス透過性バリアを滅菌します。溶液を癌細胞と混合するには、採取した各細胞ペレットを20マイクロリットルの培養培地に再懸濁し、1%中和したコラーゲンプレゲル溶液を、ウェットアイス上の各再懸濁細胞懸濁液に1ミリリットル加え、穏やかな混合を行う。各細胞懸濁液を混合するために正の変位ピペットを使用してください。均質な溶液が得られたら、正の使い捨てピペットを使用して、細胞内包化されたコラーゲンバイオインを個々の3ミリリットルの使い捨て注射器に移し、3D細胞印刷まで4°Cで注射器を保存します。がん-ストロマ同心円環の3Dプリントでは、適切な3D CADファイルをSTLファイル形式に変換し、STL-CAD交換器を使用してがん間質同心円環のGコードを生成します。細胞にカプセル化したコラーゲンバイオインを3Dプリンタヘッドにセットし、頭とプレートの温度を摂氏15度に設定します。生成された印刷パスを3Dプリンタの制御ソフトウェアにロードし、[開始]をクリックして、18ゲージのプラスチック針を搭載したGコードに従って、15°Cで約20キロパスカルの空気圧でコラーゲンバイオインクをガス透過性バリアに印刷します。すべての印刷操作の終わりに、手動で低酸素勾配を生成するガス透過性バリアの上に殺菌された22 x 50ミリメートルのガラスカバーを置きます。3つの低酸素癌オンチップを生成した後、チップを37°Cのインキュベーターに1時間移し、コラーゲンバイオインクを架橋します。低酸素がんオンチップがすべて印刷されたら、ガス透過性バリアの上にカバーグラスをセルスクレーパーで軽くこすり、密着性を保ちます。癌構築物を取り外すことなく細胞培養培地をチップにリフレッシュするには、チップを傾け、ピペットを使用して各チップの側面に1.5ミリリットルの内皮細胞増殖培地を導入する。低酸素癌オンチップは、同心円状のリングの形で、癌組織で観察された放射状酸素拡散と枯渇を模倣するように設計された。酸素が拡散して細胞によって消費される空間の制御容積を定義した後、中枢低酸素発生のための適切な細胞密度を計算的有限要素解析によって決定することができる。3D細胞印刷では、固体癌の解剖学的特徴を再現するために、区画化された癌間質同心環構造を作成することができる。定量的には、ポストプリンティング細胞の生存率は、典型的には、癌および間質細胞に対して製造条件が適切であることを確認する96%より大きい。本代表分析では、酸素勾配の有無に応じて2つの群を比較し、低酸素勾配が癌進行に及ぼす影響を検証した。いずれの条件においても、成熟したCD31陽性内皮細胞が周辺領域内に存在し、空間パターン化された生きている構築物が3Dバイオプリンティング技術を用いて作製されたことを示している。酸素勾配負条件と比較すると、勾配陽性条件は低酸素勾配を示し、HIF1アルファの徐々な発現を示した。SHMT2陽性擬似パリセド細胞およびSOX2陽性多能性細胞も認められており、固形癌の積極的な病態生理学的特徴の存在を示す。低酸素がんオンチップは、固形癌の病態生理学的特徴と、微小環境を促進する癌細胞と腫瘍形成との間の動的クロストークを調べるための有用なツールである。この方法論は合理的な時間枠で患者固有の薬物設計に適応することができるので、このアプローチは、in vivoと癌のインビトロモデルとの間のギャップを埋めることが期待される。

3d-cell-printed-hypoxic-cancer-on-chip-for-recapitulating-pathologic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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