Name: 睡眠美容トランスポゾントランスポゾントランスフェクトヒト網膜色素上皮細胞における酸化ストレスの誘導と分析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: 学ぶ過酸化水素を用いた網膜色素上皮細胞の酸化ストレスモデル構築法。PEDFやGM-CSFなどの抗酸化タンパク質効果を評価し、加齢性黄斑変性症など神経網膜変性疾患の新規治療法開発に貢献する研究手法を習得できます。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

著者らは、グレッグ・シーリーとアラン・コンティに優れた技術支援と、ベルリンのマックス・デルブリュック・センターのツズザンナ・イズスヴァーク教授に感謝したいと考えています。この研究は、第7枠組みプログラムの文脈でスイス国立科学財団と欧州委員会によって支援されました。Z.Iは欧州研究評議会、ERCアドバンス[ERC-2011-ADG 294742]によって資金提供されました。

人間の目の収集と使用のための手順は、研究のための教育倫理委員会によって承認されました (no. 2016-01726).
1. 細胞の分離と培養条件
<ol><li>ヒトARPE-19細胞株<ol>
<li>ダルベッコの修飾ワシのミディアム/栄養素混合物F-12ハム(DMEM/ハムのF-12)に10%のウシ胎児血清(FBS)、80 U/mLペニシリンを加えた培養5 x 105 ARPE-19細胞、 T75フラスコの加湿雰囲気で37°Cで80μg/mLレンサプレプトマイシン、2.5μg/mLアンホテリシンB(完全培地)を37°Cで、T75フラスコの5%CO2および95%の空気の空気(他の細胞密度については表1参照)</li>
		<li>週に 3 回、メディアを変更します。</li>
		<li>細胞が約90%合流(定性評価)に成長したら、培地を吸引し、滅菌1x PBSで細胞を洗浄する。</li>
		<li></li><li></li><li></ol></li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td colspan="2"></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="2"></td><td rowspan="2"></td><td></td><td rowspan="2"></td><td rowspan="2"></td><td rowspan="2"></td><td rowspan="2"></td></tr><tr><td></td></tr></tbody></table><ol start="2"><li><ol><li></li><li><li> </li></ol></li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"></td><td rowspan="2"></td><td rowspan="2"></td><td rowspan="2"></td><td rowspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td rowspan="2"></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td><img alt="Symbol 1" src="/files/ftp_upload/61957/61957_sym01.jpg"></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td><img alt="Symbol 2" src="/files/ftp_upload/61957/61957_sym02.jpg"></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td><img alt="Symbol 3" src="/files/ftp_upload/61957/61957_sym03.jpg"></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td><img alt="Symbol 4" src="/files/ftp_upload/61957/61957_sym04.jpg"></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table><ol><li><li><ol><li></li></ol></li><li></li><li> </li><li></ol><ol><li><ol><li></li><li></li><li> </li></ol></li><li><ol><li></li><li><ol><li></li><li></li><li></li><li></li><li></li></ol></li><li></li><li> </li></ol></li><li><ol><li><li></li><li> </li></ol></li><li><ol><li> </li><li></li><li> </li></ol></li><li><ol><li></li><li><li></li><li></li><li> </li></ol></li></ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61957/61957fig01.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61957/61957fig01large.jpg" target="_blank"></a><ol><li><ol><li> </li><li><li> </li><li><li> </li><li><li><li><li> <ol><li></li><li></ol></li></ol></li><li><ol><li> </li><li> </li><li><ol><li></li><li></ol></li><li><li></ol></li><li><ol><li><li></li><li><li></li><li></li><li></li><li></li><li></li></ol></li><li><ol><li></li><li></li><li><li><li><li><li><li></li><li><li></li></ol></li></ol>

<ol><li>Zareba, M., Raciti, M. W., Henry, M. M., Sarna, T., Burke, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+in+ARPE-19+cultures%3A+Do+melanosomes+confer+cytoprotection%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress in ARPE-19 cultures: Do melanosomes confer cytoprotection.</a> Free Radical Biology and Medicine. 40 (1), 87-100 (2006).</li>
<li>Gong, X., Draper, C. S., Allison, G. S., Marisiddaiah, R., Rubin, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+macular+carotenoid+lutein+in+human+retinal+pigment+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants%22%5BJournal%5D)">Effects of the macular carotenoid lutein in human retinal pigment epithelial cells.</a> Antioxidants. 6 (4), (2017).</li>
<li>Sacconi, R., Corbelli, E., Querques, L., Bandello, F., Querques, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Review+of+current+and+future+management+of+geographic+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">A Review of current and future management of geographic atrophy.</a> Ophthalmology and Therapy. 6, 69-77 (2017).</li>
<li>Al-Zamil, W. M., Yassin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+in+age-related+macular+degeneration%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Interventions+in+Aging%22%5BJournal%5D)">Recent developments in age-related macular degeneration: a review.</a> Clinical Interventions in Aging. 12, 1313-1330 (2017).</li>
<li>Kumar-Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+complement+membrane+attack+complex+in+dry+and+wet+AMD+-+From+hypothesis+to+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The role of complement membrane attack complex in dry and wet AMD - From hypothesis to clinical trials.</a> Experimental Eye Research. 184, 266-277 (2019).</li>
<li>Ung, L., Pattamatta, U., Carnt, N., Wilkinson-Berka, J. L., Liew, G., White, A. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+and+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Science%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress and reactive oxygen species.</a> Clinical Science. 131, 2865-2883 (2017).</li>
<li>Beatty, S., Koh, H. H., Phil, M., Henson, D., Boulton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+oxidative+stress+in+the+pathogenesis+of+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Survey+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">The role of oxidative stress in the pathogenesis of age-related macular degeneration.</a> Survey of Ophthalmology. 45 (2), 115-134 (2000).</li>
<li>Alhasani, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gypenosides+protect+retinal+pigment+epithelium+cells+from+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Food+and+Chemical+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Gypenosides protect retinal pigment epithelium cells from oxidative stress.</a> Food and Chemical Toxicology. 112, 76-85 (2018).</li>
<li>National Institute of Health. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://nei.nih.gov/learn-about-eye-health/resources-for-health-educators/eye-health-data-and-statistics/age-related-macular-degeneration-amd-data-and-statistics">https://nei.nih.gov/learn-about-eye-health/resources-for-health-educators/eye-health-data-and-statistics/age-related-macular-degeneration-amd-data-and-statistics</a> (2020).</li>
<li>Mitchell, P., Liew, G., Gopinath, B., Wong, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Age-related macular degeneration.</a> The Lancet. 392, 1147-1159 (2018).</li>
<li>He, Y., Leung, K. W., Ren, Y., Jinzhi, P., Jian, G., Tombran-Tink, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEDF+improves+mitochondrial+function+in+RPE+cells+during+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">PEDF improves mitochondrial function in RPE cells during oxidative stress.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55, 6742-6755 (2014).</li>
<li>Cao, S., Walker, G. B., Wang, X., Cui, J. Z., Matsubara, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+cytokine+profiles+of+human+retinal+pigment+epithelium%3A+Oxidant+injury+and+replicative+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Altered cytokine profiles of human retinal pigment epithelium: Oxidant injury and replicative senescence.</a> Molecular Vision. 19, 718-728 (2013).</li>
<li>Farnoodian, M., Sorenson, C. M., Sheibani, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEDF+expression+affects+the+oxidative+and+inflammatory+state+of+choroidal+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Amercian+Journal+of+Physiology+and+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">PEDF expression affects the oxidative and inflammatory state of choroidal endothelial cells.</a> Amercian Journal of Physiology and Cell Physiology. 314 (4), 456-472 (2018).</li>
<li>Polato, F., Becerra, S. P. Retinal Degenerative Diseases: Mechanisms and Experimental Therapies. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPolato%2C+F+%22Retinal+Degenerative+Diseases%22">Retinal Degenerative Diseases</a>. , Springer. 699-706 (2016).</li>
<li>Schallenberg, M., Charalambous, P., Thanos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-CSF+regulates+the+ERK1%2F2+pathways+and+protects+injured+retinal+ganglion+cells+from+induced+death%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">GM-CSF regulates the ERK1/2 pathways and protects injured retinal ganglion cells from induced death.</a> Experimental Eye Research. 89, 665-677 (2009).</li>
<li>Schallenberg, M., Charalambous, P., Thanos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-CSF+protects+rat+photoreceptors+from+death+by+activating+the+SRC-dependent+signalling+and+elevating+anti-apoptotic+factors+and+neurotrophins%5BTitle%5D)+AND+%22Graefes+Archives+for+Clinical+and+Experimental+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">GM-CSF protects rat photoreceptors from death by activating the SRC-dependent signalling and elevating anti-apoptotic factors and neurotrophins.</a> Graefes Archives for Clinical and Experimental Ophthalmology. 250, 699-712 (2012).</li>
<li>Thumann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+PEDF-expressing+primary+pigment+epithelial+cells+by+the+SB+transposon+system+delivered+by+pFAR4+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Engineering of PEDF-expressing primary pigment epithelial cells by the SB transposon system delivered by pFAR4 plasmids.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 6, 302-314 (2017).</li>
<li>Garcia-Garcia, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+PEDF+release+in+rat+iris+and+retinal+epithelial+cells+after+Sleeping+Beauty+transposon-mediated+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Long-term PEDF release in rat iris and retinal epithelial cells after Sleeping Beauty transposon-mediated gene delivery.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 9, 1-11 (2017).</li>
<li>Johnen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiangiogenic+and+neurogenic+activities+of+Sleeping+Beauty-mediated+PEDF-transfected+RPE+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Antiangiogenic and neurogenic activities of Sleeping Beauty-mediated PEDF-transfected RPE cells in vitro and in vivo.</a> BioMed Research International. 2015, (2015).</li>
<li>Weigel, A. L., Handa, J. T., Hjelmeland, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+of+H2O2-%2C+HNE-%2C+or+tBH-treated+ARPE-19+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis of H2O2-, HNE-, or tBH-treated ARPE-19 cells.</a> Free Radical Biology & Medicine. 33 (10), 1419-1432 (2002).</li>
<li>Allen, R. G., Tresini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+and+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress and gene regulation.</a> Free Radical Biology and Medicine. 28 (3), 463-499 (2000).</li>
<li>Tate, D. J., Miceli, M. V., Newsome, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis+and+H2O2+induce+catalase+and+metallothionein+gene+expression+in+human+retinal+pigment+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis and H2O2 induce catalase and metallothionein gene expression in human retinal pigment epithelial cells.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 36 (7), 1271-1279 (1995).</li>
<li>Halliwell, B., Clement, M. V., Long, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+peroxide+in+the+human+body%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Hydrogen peroxide in the human body.</a> FEBS Letters. 486 (1), 10-13 (2000).</li>
<li>Giblin, F. J., McCready, J. P., Kodama, T., Reddy, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+direct+correlation+between+the+levels+of+ascorbic+acid+and+H2O2+in+aqueous+humor%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">A direct correlation between the levels of ascorbic acid and H2O2 in aqueous humor.</a> Experimental Eye Research. 38, 87-93 (1984).</li>
<li>Geiger, R. C., Waters, C. M., Kamp, D. W., Glucksberg, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KGF+prevents+oxygen-mediated+damage+in+ARPE-19+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">KGF prevents oxygen-mediated damage in ARPE-19 cells.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 46, 3435-3442 (2005).</li>
<li>Campochiaro, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vector+gene+transfer+of+endostatin%2Fangiostatin+for+macular+degeneration+%28GEM%29+study%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vector gene transfer of endostatin/angiostatin for macular degeneration (GEM) study.</a> Human Gene Therapy. 28, 99-111 (2017).</li>
<li>Chen, X. -D., Su, M. -Y., Chen, T. -T., Hong, H. -Y., Han, A. -D., Li, W. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+affects+retinal+pigment+epithelial+cell+survival+through+epidermal+growth+factor+receptor%2FAKT+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress affects retinal pigment epithelial cell survival through epidermal growth factor receptor/AKT signaling pathway.</a> International Journal of Ophthalmology. 10 (4), 507-514 (2017).</li>
<li>Tu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allicin+attenuates+H2O2+-+induced+cytotoxicity+in+retinal+pigmented+epithelial+cells+by+regulating+the+levels+of+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine+Reports%22%5BJournal%5D)">Allicin attenuates H2O2 - induced cytotoxicity in retinal pigmented epithelial cells by regulating the levels of reactive oxygen species.</a> Molecular Medicine Reports. 13, 2320-2326 (2016).</li>
<li>Hao, Y., Liu, J., Wang, Z., Yu, L., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Piceatannol+protects+human+retinal+pigment+epithelial+cells+against+hydrogen+peroxide+induced+oxidative+stress+and+apoptosis+through+modulating%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Piceatannol protects human retinal pigment epithelial cells against hydrogen peroxide induced oxidative stress and apoptosis through modulating.</a> Nutrients. 11, 1-13 (2019).</li>
<li>Ballinger, S. W., Van Houten, B., Conklin, C. A., Jin, G. F., Godley, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+peroxide+causes+significant+mitochondrial+DNA+damage+in+human+RPE+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Hydrogen peroxide causes significant mitochondrial DNA damage in human RPE cells.</a> Experimental Eye Research. 68 (6), 765-772 (1999).</li>
<li>Ma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+overexpression+of+uncoupling+protein+2+attenuates+salt-induced+vascular+dysfunction+by+inhibition+of+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Hypertension%22%5BJournal%5D)">Transgenic overexpression of uncoupling protein 2 attenuates salt-induced vascular dysfunction by inhibition of oxidative stress.</a> American Journal of Hypertension. 27 (3), 345-354 (2014).</li>
<li>Johnen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleeping+Beauty+transposon-mediated+transfection+of+retinal+and+iris+pigment+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Sleeping Beauty transposon-mediated transfection of retinal and iris pigment epithelial cells.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (8), 4787-4796 (2012).</li>
<li>Mátés, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+evolution+of+a+novel+hyperactive+Sleeping+Beauty+transposase+enables+robust+stable+gene+transfer+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates.</a> Nature Genetics. 41 (6), 753-761 (2009).</li>
<li>Marienfeld Technical information Neubauer-improved. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.marienfeld-superior.com/information-about-our-counting-chambers.html">https://www.marienfeld-superior.com/information-about-our-counting-chambers.html</a> (2020).</li>
<li>Electron Microscopy Sciences. Neubauer Haemocytometry. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.emsdiasum.com/microscopy/technical/datasheet/68052-14.aspx">https://www.emsdiasum.com/microscopy/technical/datasheet/68052-14.aspx</a> (2020).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%5E%28-%CE%94%CE%94CT%29+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2^(-ΔΔCT) method.</a> Methods. 25 (4), San Diego, California. 402-408 (2001).</li>
<li>Bascuas, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-virally+transfected+primary+human+pigment+epithelium+cells+overexpressing+the+oxidative+stress+reduction+factors+PEDF+and+GM-CSF+to+treat+retinal+neurodegeneration+neurodegenerationl%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Non-virally transfected primary human pigment epithelium cells overexpressing the oxidative stress reduction factors PEDF and GM-CSF to treat retinal neurodegeneration neurodegenerationl.</a> Human Gene Therapy. 30 (11), (2019).</li>
<li>Zhuge, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fullerenol+protects+retinal+pigment+epithelial+cells+from+oxidative+stress-induced+premature+senescence+via+activating+SIRT1%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Fullerenol protects retinal pigment epithelial cells from oxidative stress-induced premature senescence via activating SIRT1.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (7), 4628-4638 (2014).</li>
<li>Kaczara, P., Sarna, T., Burke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+H2O2+Availability+to+ARPE-19+cultures+in+models+of+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Dynamics of H2O2 Availability to ARPE-19 cultures in models of oxidative stress.</a> Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 1068-1070 (2010).</li>
<li>Gorrini, C., Harris, I. S., Mak, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+oxidative+stress+as+an+anticancer+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Modulation of oxidative stress as an anticancer strategy.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 12, 931-947 (2013).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEDF+protects+human+retinal+pigment+epithelial+cells+against+oxidative+stress+via+upregulation+of+UCP2+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine+Reports%22%5BJournal%5D)">PEDF protects human retinal pigment epithelial cells against oxidative stress via upregulation of UCP2 expression.</a> Molecular Medicine Reports. 19 (1), 59-74 (2019).</li>
<li>Donadelli, M., Dando, I., Fiorini, C., Palmieri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UCP2%2C+a+mitochondrial+protein+regulated+at+multiple+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">UCP2, a mitochondrial protein regulated at multiple levels.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71, 1171-1190 (2014).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

ここで紹介するプロトコルは、トランスフェクトされた細胞によって産生されるPEDFおよびGM-CSFの抗酸化および保護機能を分析するアプローチを提供し、これは任意の推定有益な遺伝子をトランスフェクトした細胞に適用することができる。遺伝子組換え細胞を移植してタンパク質を組織に送達することを目的とする遺伝子治療戦略では、タンパク質発現のレベル、発現の長さ、および発現タンパク質の有効性に関する情報を得ることが重要です。我々の研究室では、ここで提示されるプロトコルは、aAMD6,7の病因において重要な要素として仮説されている酸化ストレスに対するPEDFおよびGM-CSFの有効性を定義するのに有用であった。具体的には、このプロトコルを用い、SB100X-媒介PEDF/GM-CSFトランスフェクトされた原発hRPE細胞の抗酸化効果を定義しました。いくつかの研究者は、H2O2が酸化ストレスの重大な症状を誘発するが、24時間の350 μMがヒトARPE-19および一次RPE細胞...

ここで説明するモデルは、細胞内の酸化ストレスを低減するためのバイオ医薬品の効率を評価するのに有用なアプローチを提供する。このモデルを用いて、高レベルのO2に曝露される網膜色素上皮細胞に対するH2O2-媒介酸化ストレス、可視光、光受容体外皮膜の貪食作用、活性酸素種(ROS)1に対する保護効果を調べた。 2.彼らは血管の加齢黄斑変性症(aAMD)3、4、5、6、7、8の病因に大きく貢献していると考えられている。また、RPE合成神経保護因子、特に色素上皮由来因子(PEDF)、インスリン様成長因子(IIF)、顆粒球マクロファージ-コロニー刺激因子(GM-CSF)がRPE細胞の機能不全および喪失をもたらし、続いて光受容体および網膜神経節細胞(RGC)死亡が減少している。.AMDは、代謝、機能、遺伝的、および環境因子4間の相互作用から生じる複雑な疾患である。aAMDの治療の欠如は、先進国9,10の60歳以上の患者における失明の主な原因である。PEDFおよびGM-CSFを過剰発現する遺伝子組み換えRPE細胞の遺伝子組み換え後移植による神経保護および神経原性のレチナル環境の再構成は、酸化ストレスの影響を軽減し、炎症を抑制し、細胞生存を支持することによって、レチナル変性を防ぐ可能性を秘めている11、12、13、14、15、16.細胞に遺伝子を送達するいくつかの方法論があるにもかかわらず、我々は、その安全性プロファイル、宿主細胞のゲノムへの遺伝子の統合、および以前に示したように非転写活性部位に提供された遺伝子を統合する傾向のために、PEDFおよびGM-CSF遺伝子をRPE細胞に送達する非ウイルス性多動性睡眠美容トランスポゾンシステムを選択した。 18,19.
細胞酸化ストレスは、過酸化水素(H2O2)、4-ヒドロノネナー(HNE)、テルブチルヒドロペルオキシド(tBH)、高酸素張力、可視光(全スペクトルまたはUV照射)20、21を含む、いくつかの酸化剤によってインビトロで培養された細胞において誘導され得る。高い酸素の緊張およびライトは他のシステムへの移動性を制限する特別な装置および条件を要求する。H2O2、HNE、およびtBHなどの薬剤は、分子および細胞変化と重なり合う酸化ストレスを誘発する。我々は、RPE細胞が感光体外セグメント食細胞化22中に活性酸素中間体としてRPE細胞によって産生され、生体23の眼組織に見られるため、PEDFおよびGM-CSFの抗酸化活性を試験するためにH2O2を選択した。グルタチオンの酸化は、目の中のH2O2の産生に部分的に関与する可能性があるため、我々は、H2O2誘導酸化ストレスおよび細胞21,22の再生能力に関連するGSH/グルタチオンのレベルを分析した。グルタチオンレベルの分析は、眼24における抗酸化保護機構に関与するため、特に関連性が高い。H2O2への曝露は、RPE細胞1、25、26、27、28、29、30、および加えて、酸化ストレスの「生理学的」な刺激源である、酸化ストレスの「生理学的」源であるRPE細胞の酸化ストレス感受性および抗酸化活性を調べるモデルとして頻繁に使用される。
神経保護因子の機能性と有効性を評価するために、PEDFおよびGM-CSFを過剰発現するように遺伝子組み換え細胞によって発現される成長因子の抗酸化効果を定量化する分析を可能にするインビトロモデルを開発した。ここでは、PEDFおよびGM-CSFの遺伝子にトランスフェクトされたRPE細胞は、細胞の形態、密度、生存率、グルタチオンの細胞内レベル、およびミトコンドリア非結合タンパク質2の発現によって証明されるように、非トランスフェクション対照細胞よりもH2O2の有害な影響に対してより耐性があることを示す(ROS1酸素種)。

<table><tbody><tr><td>24ウェルプレート</td><td>Corning</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>6ウェルプレート</td><td>Greiner 7657160</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96ウェル培養プレート ホワイト、透明で平底&nbsp;</td><td>Costar</td><td>3610</td><td>発光を測定する前に細胞をチェックできます(GSH-Glo Assay)</td></tr><tr><td>96ウェルプレート</td><td>Corning&nbsp;</td><td></td><td></td>353072</tr><tr><td>アクリルアミド40%</td><td>Biorad</td><td>161-0144</td><td></td></tr><tr><td>アムホテリシンB</td><td>AMIMED</td><td>4-05F00-H</td><td></td></tr><tr><td>抗体抗GMCSF</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>PA5-24184</td><td></td></tr><tr><td>抗体抗マウスIgG/IgA/IgM&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>P0260</td><td></td></tr><tr><td>抗体抗PEDF&nbsp;</td><td>Santa Cruz Biotechnology Inc</td><td>sc-390172</td><td></td></tr><tr><td>抗体抗ペンタ-His&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>34660</td><td></td></tr><tr><td>抗体抗リン酸化Akt</td><td>細胞シグナル伝達技術</td><td>9271</td><td></td></tr><tr><td>抗体抗ウサギIgG H&L-HRP</td><td>Abcam</td><td>ab6721</td><td></td></tr><tr><td>抗体ロバ抗ウサギAlexa Fluor 594&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>A11034</td><td></td></tr><tr><td>抗体ヤギ抗マウス Alexa 488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11029</td><td></td></tr><tr><td>ARPE-19 細胞株</td><td>ATCC</td><td>CRL-2302</td><td></td></tr><tr><td>BSA&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418-500G</td><td></td></tr><tr><td>チャンバー培養ガラススライド</td><td>Corning</td><td>354118</td><td></td></tr><tr><td>CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay&nbsp;</td><td>プロメガ</td><td>G9291</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>シグマ - アルドリッチ</td><td>D9542-5MG</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/ハムのF12&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8062</td><td></td></tr><tr><td>デュオセット ELISAキット</td><td>R&Dシステムズ&nbsp;</td><td>DY215-05</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>78440</td><td></td></tr><tr><td>ELISAquant キット</td><td>BioProducts MD</td><td>PED613-10-Human</td><td></td></tr><tr><td>Eyes (human)</td><td>Lions Gift of Sight Eye Bank (ミネソタ州セントポール)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS&nbsp;</td><td>Brunschwig</td><td>P40-37500</td><td></td></tr><tr><td>フルオロマウント 水性マウント ミディアム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4680-25ML</td><td></td></tr><tr><td>FLUOstar Omega プレートリーダー&nbsp;</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prismソフトウェア(バージョン8.0)</td><td>GraphPad Software, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GSH-Glo Glutathione Assay</td><td>Promega</td><td>V6912</td><td></td></tr><tr><td>hydrogen peroxide (H2O2)</td><td>Merck</td><td>107209</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software (image processing program)</td><td>W.S. Rasband, NIH, Bethesda, MD, USA; https://imagej.nih.gov/ij/; 1997&ndash;2014</td><td></td><td></td></tr><tr><td>イミダゾール&nbsp;</td><td>Axonlab</td><td>A1378.0010</td><td></td></tr><tr><td>ライカDMI4000B顕微鏡&nbsp;</td><td>ライカ マイクロシステムズ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 インストゥルメント II&nbsp;</td><td>Roche Molecular Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 SW1.5.1 software</td><td>Roche Molecular Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71376-1000</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Axonlab</td><td>3468.1000</td><td></td></tr><tr><td>ネオントランスフェクションシステム&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>のMPK5000</td><td></td></tr><tr><td>ネオントランスフェクションシステム 10 &micro;Lキット</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>MPK1096</td><td></td></tr><tr><td>ノイバウアーチャンバー</td><td>マリエンフェルト・スーペリア</td><td>640010</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA スーパーフロー&nbsp;</td><td>キアゲン</td><td>30410</td><td></td></tr><tr><td>ニトロセルロース&nbsp;</td><td>VWR</td><td>732-3197</td><td></td></tr><tr><td>Omega Lum G Gel Imaging System</td><td>Aplegen Life Science</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS 1X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781-100</td><td></td></tr><tr><td>PerfeCTa SYBR Green FastMix</td><td>Quantabio</td><td>95072-012</td><td></td></tr><tr><td>PFA&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127-100G</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay キット&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>プライマー&nbsp;</td><td>インビトロジェン&nbsp;</td><td></td><td>補足資料</td></tr><tr><td>pSB100X(250 ng/&micro;L)</td><td></td><td></td><td>M&aacute;t&eacute;Sら、2009年。Prof. Zsuzsanna Izsvak</td></tr><tr><td>pT2-CMV-GMCSF-His プラスミド DNA (250 ng/&micro;L)</td><td></td><td></td><td>Johnen, S. et al. (2012) IOVS, 53 (8), 4787-4796 で報告された既存の pT2-CMV-PEDF-EGFP プラスミドを使用して構築。</td></tr><tr><td>pT2-CMV-PEDF-HisプラスミドDNA(250 ng/&micro;L)</td><td></td><td></td><td>Johnen, S. et al. (2012) IOVS, 53 (8), 4787-4796 で報告された既存の pT2-CMV-PEDF-EGFP プラスミドを使用して構築。</td></tr><tr><td>QIAamp DNA ミニキット</td><td>QIAGEN</td><td>51304</td><td></td></tr><tr><td>組換え hGM-CSF&nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>100-11</td><td></td></tr><tr><td>組換え hPEDF&nbsp;&nbsp;</td><td>BioProductsMD</td><td>004-096</td><td></td></tr><tr><td>ReliaPrep RNA細胞 Miniprep System</td><td>Promega</td><td>Z6011</td><td></td></tr><tr><td>RIPAバッファー</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>89901</td><td></td></tr><tr><td>RNaseフリーDNaseセット</td><td>QIAGEN</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>RNeasyミニキット</td><td>QIAGEN</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Applichem</td><td>A2572</td><td></td></tr><tr><td>セミドライトランスファーWB用システム&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SuperMix qScript</td><td>Quantabio</td><td>95048-025</td><td></td></tr><tr><td>トリスバッファー生理食塩水 (TBS)&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>サイエン</td>ティフィック 15504020 <td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>AppliChem</td><td>A4975</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン/EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4174</td><td></td></tr><tr><td>Tween</td><td>AppliChem&nbsp;</td><td>A1390</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>29700</td><td></td></tr><tr><td>WesternBright ECL HRP 基質</td><td>Advansta</td><td>K-12045-D50</td><td></td></tr><tr><td>Whatman ニトロセルロース 膜</td><td>Chemie Brunschwig</td><td>MNSC04530301</td><td></td></tr></tbody></table>

睡眠美容トランスポゾントランスポゾントランスフェクトヒト網膜色素上皮細胞における酸化ストレスの誘導と分析

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

酸化ストレスは、加齢黄斑変性症(AMD)を含むいくつかの変性疾患において重要な役割を果たします。網膜色素上皮(RPE)合成神経保護因子の減少、例えば、色素上皮由来因子(PEDF)および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、RPE細胞の喪失、そして最終的には光受容体および網膜神経節細胞(RGC)死につながる。我々は、PEDFおよびGM-CSFを過剰発現するトランスフェクションRPE細胞の遺伝子導入による神経保護および神経原性のレチナル環境の再構成は、酸化ストレスの影響を緩和し、炎症を抑制し、細胞生存を支持することによって、レチナル変性を防ぐ可能性があると仮定する。眠れる森の美しさトランスポゾンシステム(SB100X)を用いて、ヒトRPE細胞はPEDFおよびGM-CSF遺伝子にトランスフェクトされ、qPCR、ウェスタンブロット、ELISA、および免疫蛍光を用いた安定した遺伝子集積、長期遺伝子発現、タンパク質分泌を示した。トランスフェクトされたRPE細胞によって分泌されるPEDFおよびGM-CSFの機能性と効力を確認するために、培養中のRPE細胞に対するH2O2誘導酸化ストレスの低減を定量化するインビトロアッセイを開発しました。細胞保護は、細胞の形態、密度、グルタチオンの細胞内レベル、UCP2遺伝子発現、および細胞生存率を分析することによって評価した。いずれも、トランスフェクトされたRPE細胞は、非トランスフェクトされたPEDFおよびGM-CSFおよび未導入の細胞および未導入の細胞(市販または遺伝子組み換え細胞から精製された)で前処理された細胞は、非治療対照と比較して有意な抗酸化細胞保護を示した。本H2O2-modelは、AMDまたは類似の神経変性疾患を治療するのに有効であり得る因子の抗酸化効果を評価するための簡便かつ有効なアプローチである。

ヒト網膜色素上皮細胞における酸化ストレスの誘導 ARPE-19および一次hRPE細胞を24時間H2O2の様々な濃度で処理し、抗酸化グルタチオンの細胞内レベルを定量化した(図2A、B)。H2O2は50μMおよび100μMでグルタチオンの産生に影響を与えなかったのに対し、350μMではARPE-19および一次hRPE細胞においてグルタチオンが有意に減少した。細胞毒性の分析は、350μMが細胞生存率の有意な低下を引き起こすH2O2の最低濃度であることを示した(図2C)。形態学的には、H2O2で処理されたARPE-19細胞は、より広がり、より丸みを帯びて見えない、H2O2濃度の増加に伴ってより明...

網膜色素上皮細胞をH2O2で処理し、細胞の形態、生存率、密度、グルタチオン、UCP-2レベルを解析することにより、酸化ストレスモデルの開発と使用に関するプロトコルを提示します。これは、トランスポゾントランスフェクション細胞によって分泌されるタンパク質の抗酸化効果を調べて神経レチンの変性を治療するのに有用なモデルです。

Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 ...

過酸化水素モデルは、加齢性黄斑変性症または類似の神経変性疾患の治療に役立つ可能性のある因子の抗酸化効果を評価するためのシンプルで効果的なアプローチです。酸化剤である過酸化水素は、1回のパルスで送達されるため、過酸化水素処理を数日間繰り返す必要があるモデルよりも迅速かつ簡単に実行できます。播種される細胞の数は治療の酸化効果に影響を与えるため、培養前に細胞を慎重に数えることが重要です。この手順を実演するのは、Gabriele Thumannの研究室のポスドクであるThais Bascuasです。馴化培地調製のために、PEDF、GM-CSF、またはその両方によるトランスフェクションの28日後に、完全な培地濃度のミリリットルあたり500, 000細胞からヒトARPE-19細胞株T-75フラスコを播種します。細胞が約80%のコンフルエンシーに達したら、上清を新鮮な完全な培地と交換し、24時間後に新しい上清を回収します。ヒスチジンタグ付きGM-CSFおよびPEDFタンパク質を精製するには、上清を遠心分離して残留する可能性のある細胞を排除し、サンプルを脇に置きます。次に、30ミリリットルのチューブに1.5マイクロリットルのニッケルNTA溶液を追加します。遠心分離後、ニッケルNTAフロースルーを廃棄し、1回の洗浄につき200マイクロリットルの1Xインキュベーションバッファーでペレットを2回洗浄します。2回目の洗浄後、ペレットを40マイクロリットルの4Xインキュベーションバッファーと900マイクロリットルの遠心分離したコンディショニング培地に再懸濁します。馴染ませた培地溶液を室温で1時間、毎分70回転でインキュベートします。インキュベーションの終了時に、サンプルを遠心分離し、1回の洗浄につき175マイクロリットルの1Xインキュベーションでペレットを2回洗浄します。2回目の洗浄後、20マイクロリットルの溶出バッファーを加え、室温で毎分70回転で20分間インキュベーションします。インキュベーションの最後に、サンプルを遠心分離します。上清を脇に置き、標準的なプロトコルに従ってBCAタンパク質アッセイによって溶出される総タンパク質を定量します。トランスフェクトされていない網膜色素上皮細胞を馴化培地と過酸化水素で処理するには、200マイクロリットルの完全培地に3000個の細胞を96ウェルプレートの各ウェルに播種し、細胞培養インキュベーターで24時間インキュベートします。翌朝、上清をウェルあたり200マイクロリットルの馴化培地と交換し、細胞を細胞培養インキュベーターに10日間戻します。培養11日目に、細胞を完全培地中の350マイクロモル過酸化水素で24時間処理します。精製または市販のPEDFおよび/またはGM-CSFによる非トランスフェクションRPE細胞の処理には、3000細胞を200マイクロリットルの完全培地に播種し、500ナノグラム/ミリリットルの組換えPEDFおよび/または50ナノグラム/ミリリットルの組換えPEDFをウェルあたりGM-CSFに添加して、細胞培養インキュベーターで48時間インキュベートします。インキュベーションの終了時に、上清を350マイクロモルの過酸化水素と500ナノグラム/ミリリットルのPEDFおよび/または50ナノグラム/1ミリリットルのGM-CSFを含む完全な培地と24時間交換します。トランスフェクトRPE細胞の過酸化水素処理のために、5, 000個のトランスフェクション細胞をウェルあたり200マイクロリットルの完全な培地で培養し、細胞培養インキュベーターで24時間、実証されたように細胞を350マイクロモルの過酸化水素で処理します。PEDFおよび/またはGM-CSFを過剰発現するトランスフェクション細胞、または過酸化水素処理後に成長因子で前処理した非トランスフェクト細胞で産生されるグルタチオンレベルを測定するには、各ウェルの上清をウェルあたり100マイクロリットルの新たに調製した1X試薬混合物に交換し、オービタルシェーカーで毎分500回転で14秒間試薬混合物と細胞を混合します。振とうした後、プレートを室温で30分間インキュベートしてから、再構成したルシフェリン検出試薬100マイクロリットルを各ウェルに加えます。溶液をシェーカーで15秒間混合し、続いて室温で15分間インキュベートします。インキュベーションの終了時に、プレートをプレートリーダーにロードし、Change Layoutを選択します。[Basic Parameters]タブで、[96-well plate]と[Top optics]を選択し、ポジショニング遅延を0.1に、[Measurement start time]をゼロに、[Measurement interval time]を1に、[Time to normalize results]をゼロに設定する必要があります。ブランク、標準試料、およびサンプルを定義し、[測定の開始]をクリックします。次に、データをスプレッドシートファイルとしてエクスポートし、標準曲線の補間により各サンプル中のグルタチオン濃度を計算します。細胞生存率を測定するには、各ウェルの上清をウェルあたり1%FBSを添加した100マイクロリットルの完全な培地に交換し、分析まで細胞を細胞培養インキュベーターに入れます。未処理のARPE-19細胞を培養物から回収した後、1%FBS濃度を添加したDMEM Hams F-12培地に1ミリリットルあたり100,000細胞で細胞を再懸濁します。次に、1%FBSを添加した200マイクロリットルの培地に7つの連続1:1希釈液を調製し、各標準液の100マイクロリットルを96ウェルプレートの適切なウェルに二重に移します。調製したばかりの試薬ミックス50マイクロリットルをすべてのウェルに加え、混合物と細胞をシェーカーで15秒間混合してから、プレートを室温で15分間インキュベートします。インキュベーションの最後に、示されているように発光を測定します。測定値が得られたら、50 マイクロリットルの溶解試薬を各ウェルに加えて室温で 15 分間インキュベーションした後、再度発光を測定し、その式を使用して生細胞の割合を計算します。50 マイクロモルおよび 100 マイクロモルの過酸化水素で 24 時間処理しても、細胞内のグルタチオン産生に影響を与えませんが、細胞を 350 〜 500 マイクロモルまたは 700 マイクロモルの過酸化水素で処理すると、グルタチオンの大幅な減少が観察されます濃度。形態学的には、過酸化水素処理された細胞は、化合物の濃度が増加すると、広がりが少なくなり、より丸みを帯びているように見えます。この効果は、過酸化水素で処理されたPEDFおよびGM-CSFトランスフェクト細胞ではあまり顕著ではありませんでした。グルタチオンのレベルは、5, 000個の細胞のみを播種した井戸での過酸化水素処理後に統計的に有意に減少したため、細胞数が過酸化水素媒介酸化ストレスに影響を与えることに注意することが重要です。PEDFおよび/またはGM-CSFを発現するように処理またはトランスフェクションされた細胞は、酸化条件下で未処理の対照細胞と比較して有意に多くのグルタチオンを産生します。さらに、PEDFおよびGM-CSFトランスフェクト細胞におけるUCP2遺伝子発現のレベルは、過酸化水素後に増加しますが、増加は統計的に有意ではありません。過酸化水素に曝露したGM-CSFトランスフェクト細胞のライセートからのリン酸化AKTのウェスタンブロット解析では、未処理の対照細胞と比較してリン酸化のわずかな減少しか示されておらず、GM-CSFが細胞を酸化ストレス損傷から保護できることを示しています。細胞を正しい密度で播種し、新鮮な過酸化水素溶液を使用し、培地に新鮮なタンパク質を添加することが重要です。過酸化水素モデルを使用して成長因子の抗酸化効果が確認されたら、酸化ストレス関連眼疾患モデルで因子を試験できます。現在の過酸化水素酸化ストレスモデルでは、さまざまな因子が持つ抗酸化効果を評価することができ、したがって、新しい遺伝子治療の開発をサポートします。

induction-analysis-oxidative-stress-sleeping-beauty-transposon

Research

JoVE Journal

Medicine

医学

酸化的細胞の環境を検出するスクリーニング法は、CM - H2DCFDAの酸化を測定することです。かつて非蛍光からの蛍光化合物に細胞、CM -...

猫のアストロサイト細胞株における酸化ストレスのためのスクリーニングアッセイ、G355 - 5

ここでは、生きているゼブラフィッシュの胚の酸化ストレスを測定するためのプロトコルを報告します。この手順により、全胚組織と単一細胞集団の両方で活性酸素種(ROS)を検出できます。このプロトコルは、定性的分析と定量的分析の両方を実現します。...

ゼブラフィッシュ胚における酸化ストレスの分析

非コヒーレントキセノン光は、狭帯域干渉フィルターと減光フィルターを通過して、さまざまな波長と強度の光を培養細胞に送達しました。このプロトコルは、in...

酸化ストレスに赤/近赤外光療法の波長および強度の範囲の効果の評価のための手法インビトロ

本稿では、異物による酸化ストレスの検討のため住セルイメージ投射の遺伝子にコードされた蛍光レポーターの使用について説明します。この実験的アプローチでは、毒性学的酸化ストレス検査に用いられる従来の欠点の多くを回避しながら比類のない時空間分解能、感度、特異性を提供しています。...

遺伝子にコードされた蛍光センサーを用いた毒性酸化ストレスの評価へのアプローチをイメージング

眠れる森の美女トランスポゾンシステムを用いた初代ヒト色素上皮細胞のエレクトロポレーションに基づく遺伝子改変

本プロトコールは、定性的イメージングおよび定量的サイトメトリーアッセイを用いて腸マウスオルガノイド中の活性酸素種(ROS)を検出する方法を記載する。この研究は、選択された化合物がROSに及ぼす影響を試験するために、他の蛍光プローブに拡張される可能性があります。...

活性酸素種感受性蛍光発生プローブを用いたマウス腸管オルガノイドの酸化ストレス解析

ここでは、ミュラーグリア細胞(MGC)中の2',7'-ジクロロフルオレセインジアセテートプローブ(DCFH-DA)を用いて細胞活性酸素種(ROS)を検出するための、体系化され、アクセス可能で再現可能なプロトコルを提案する。この方法は、フローサイトメーターを用いて全細胞ROSレベルを定量する。このプロトコルは非常に使いやすく、適切で再現性があります。...

ミュラーグリア細胞における2',7'-ジクロロフルオレセインジアセテートプローブとフローサイトメトリーを用いた活性酸素種の定量

ヒト網膜色素上皮細胞(H-RPE)の代謝状態は、その健康と機能を反映しています。ここでは、高解像度の呼吸測定を使用してH-RPEのリアルタイムの代謝フラックスを調べるための最適化されたプロトコルを紹介します。...

高分解能肺活量測定法を用いた初代ヒト網膜色素上皮細胞における生体エネルギーのリアルタイム解析

私たちは、網膜色素上皮(RPE)培養における酸素消費率(OCR)を測定するための新しいデバイスを紹介します。このデバイスは、プレートが標準細胞培養インキュベーター内にある間に、標準培地で標準細胞培養プレートで成長したRPEで一度に数週間OCRを測定できます。...

高分化型および分極した網膜色素上皮培養における酸素消費速度の長期モニタリング

公平なアプローチを用いて、発がんの未知のドライバを識別する方法が記載されている。この方法は、使用し...

の同定<em&gt;眠れる森の美女</emリンカ媒介PCRを用いた固形腫瘍&gt;トランスポゾン挿入

学ぶ過酸化水素を用いた網膜色素上皮細胞の酸化ストレスモデル構築法。PEDFやGM-CSFなどの抗酸化タンパク質効果を評価し、加齢性黄斑変性症など神経網膜変性疾患の新規治療法開発に貢献する研究手法を習得できます。

睡眠美容トランスポゾントランスポゾントランスフェクトヒト網膜色素上皮細胞における酸化ストレスの誘導と分析

さらに動画を探す