Name: 微小生理学的システムを用いたヒト乳房組織における乳癌のモデル化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: 学ぼう、微小生理学的システムを用いたヒト乳房組織の乳癌モデル化。ゼラチン溶液とASCシートで組織を長期維持し、がん細胞との相互作用を解析する革新的な方法です。

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私たちは、トゥレーンフローサイトメトリーとセルソートコアだけでなく、彼らの技術サポートのためのトゥレーン神学コアに感謝したいと思います。この研究は、南東部プラスチック再建外科医協会2019研究助成金と国立科学財団(EPSCoRトラック2 RII、OIA 1632854)によって支援されました。

すべてのヒト組織は、LSUHSCの機関審査委員会事務所によって承認されたプロトコル#9189に従って収集された。
1. 脂肪由来幹細胞(ASC)の細胞シートの播種
<ol><li>商業ソースからASCを購入するか、確立されたプロトコル8、9に従うことによって、原発性ヒト乳房組織から分離する。人間の乳房ASCを70%密度(約80,000細胞/cm2表面積)で、10%のウシ胎児血清を添加したダルベッコの修飾イーグル培地(DMEM)の6ウェル標準組織培養プレートに、1%ペニシリン/ストレプトマイシン(BC-MPSメディア)を添加します。セルシートの形成に使用するASCが、通過10より小さくなるようにしてください。<ol>
<li>発生する乳がん微小生理学的システム(BC-MPS)の各ウェルについて、1つの標準的な組織培養井戸の種子細胞と同様の大きさの1つのポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)(pNIPAAm)コーティングされた組織培養プラスチックプレート。BC-MPSの1つの6ウェルプレートは、1つの標準的な組織培養6ウェルプレート(底)と1つのpNIPAAmコーティングプレート(上)を必要とする。pNIPAAmプレートは、市販のソースから購入することも、ラボ内10、11、12をコーティングすることもできます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>培養ASCは、37°Cおよび5%CO2で組織培養インキュベーター中に含まれる。バイオセーフティキャビネットで2~3日ごとにメディアを交換してください。</li>
	<li>ASCが100%コンフルエントになるまで培養し、線状のパターンを形成します。彼らが播種された合流点に応じて、これは7-10日かかります。コンフルエント細胞シートは浮力脂肪乳房組織を固定するために必要とされる。</li>
</ol>2. BC-MPSに必要な補給品の準備
<ol><li>6ウェルプレート用のゼラチンを調製するには、蒸留したH2Oで12%ゼラチン溶液を作り、ゼラチンタイプB(ゲル強度は〜225ブルーム)と125mLのH2Oを250mLガラス培地ボトルに混ぜます。1 M NaOH の 1.6 mL を溶液に加えるし、pH を中和します。</li>
	<li>25分間液体サイクル下で溶液をオートクレーブし、溶液を殺菌します。</li>
	<li>溶液を37°Cに冷却します。 滅菌バイオセーフティキャビネットでは、溶液に16mLの無菌10xハンクスバランス塩溶液(HBSS)を加え、160mLの最終容積を得る。 注:ゼラチン溶液はすぐに使用するか、または後で使用するために室温で保存することができます。調製したゼラチンは室温で1ヶ月間安定である。ほんの数個のプランジャーが必要な場合、10 mL溶液を作り、前述の7のようにBC-MPSを作るのと同じ日に無菌でフィルタリングすることができます。<ol>
<li>フィルター滅菌法でゼラチン溶液を調製するには、10x HBSSの1mLを9 mLのH2Oで希釈し、15 mLの円錐管に1x HBSS溶液を作製した。10 mL チューブに 1 M NaOH の 100 μL を加え、0.7 g のゼラチンを溶液に加えます。ゼラチンを溶解するために溶液を激しく混ぜる。</li>
		<li>75°Cの水浴でチューブを5分ごとに20分間振ってインキュベートします。ゼラチン溶液をフィルター処理するには、10 mLシリンジと0.22 μmのシリンジフィルターを使用します。バイオセーフティキャビネットのプランジャーにゼラチン溶液を直接フィルターします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>3Dプリントまたは簡単なアクリルを使用して、セルシートを転送するために使用されるプランジャーを作ります。プランジャーが望ましいサイズの井戸にゆるやかに収まることを確認してください。標準の 3D 印刷プランジャを図 1に示します。プランジャーはTinkerCadのような標準的なコンピュータ支援設計ソフトウェアを使用して設計することができ、ポリ乳酸(PLA)13、14と互換性のあるフィラメント3Dプリンタを使用して印刷される。</li>
	<li>プランジャーを保持するためのラックを準備するには、バイオセーフティキャビネットに15 mLチューブラックを置きます。プランジャーの底面が上向きになるように、プランジャーをラックに逆さまに置きます。BC-MPSを輸送するための蓋付きのプラスチック製の箱をバイオセーフティキャビネットに入れます。箱はBC-MPSの4つの版に合うために少なくとも35.5 cmの長さx 28 cmの幅x8.25 cmの高さであることを推薦する。箱から蓋を外し、ラック、プランジャー、および70%のEtOHでボックスを吹き付けます。</li>
	<li>無菌カミソリの刃と鉗子をオートクレーブするか、バイオセーフティキャビネットに入れて70%のEtOHで洗浄して準備します。</li>
	<li>70%のEtOHでプランジャーとボックスをスプレーし、少なくとも30分間バイオセーフティキャビネットのUVライトをオンにして消耗品を殺菌します。</li>
</ol>3. ゼラチンプランジャーを準備し、上のセルシートに適用
<ol><li>ゼラチン溶液をあらかじめ調製した場合は、それを37°Cの水浴で加熱して溶融させる。</li>
	<li>5 mL または 10 mL 血清ピペットを使用して、バイオセーフティ キャビネット内のプランジャーにゼラチン溶液をピペットします。6ウェルプレートの1ウェル用プランジャーは、ゼラチンの〜2.5 mLを必要とします。</li>
	<li>ゼラチンがプランジャー(〜30〜45分)で固まったら、pNIPAAmコーティングされたASCプレートをバイオセーフティキャビネットに移動させます。ゼラチンがASCに接触するように、pNIPAAmコーティングされたASCプレートの井戸にプランジャーをそっと置きます。プランジャーに金属ワッシャー(約7.5g)を置き、ゼラチンがASC細胞シートに直接接触するようにプランジャーを計量します。ASCセルシートのプランジャーを室温で30分間放置します。</li>
	<li>プランジャー付きプレートをバイオセーフティキャビネットの滅菌箱にそっと動かし、蓋をします。箱を4°Cの冷蔵庫に30分間移動します。4°Cの冷蔵庫が利用できない場合は、30分間のバイオセーフティキャビネットのアイスバケツに氷の上にプレートを置きます。</li>
</ol>4. がん細胞株の調製
<ol><li>標準的なT75組織培養皿に癌細胞株を播種し、BC-MPSが処理される日に約80%コンフルエントになるように培養しておきます。(BC-MPS当たり20万個のがん細胞が必要になります)。正常な培地で癌細胞を成長させます。 注:がん細胞を同定して単離するには、細胞を蛍光タンパク質でトランスフェクトしてASCや乳房組織と区別することをお勧めします。BC-MPS当たりに必要ながん細胞の数は、MCF7およびMDA-MB-231細胞に対して最適化されています。他の細胞株は、さらなる最適化を必要とするかもしれない。</li>
	<li>BC-MPSが準備されている日に、癌細胞を含むフラスコをバイオセーフティキャビネットに移動させる。フラスコからメディアを吸引する。5 mLのPBSでフラスコを洗います。</li>
	<li>癌細胞を含むフラスコに1mLの細胞剥離液を加え、細胞が剥離するまでフラスコを37°Cインキュベーターでインキュベートする(〜2〜5分)。</li>
	<li>バイオセーフティキャビネットでは、9 mLのPBSをフラスコに加え、PBS内の細胞を15 mL円錐管に移し、ヘモサイトメーターを使用して細胞数を数えます。</li>
	<li>癌細胞を室温で5分間500xgで遠心分離する。</li>
	<li>2 x 106 個のセル/mL が存在するように、BC-MPS メディアのセルを再中断します。</li>
	<li>癌細胞を37°Cの水浴に入れ、ヒト組織に加える準備が整うまで入れます。</li>
</ol>5. ヒト乳房組織の加工
<ol><li>バイオセーフティキャビネットでは、ヒト乳房組織(HBT)3xを10 mLの無菌PBSで洗浄します。</li>
	<li>無菌鉗子とカミソリの刃を使用してBC-MPSを粗くミンチし、できるだけ多くの筋膜および結合組織を除去してみてください。結合組織を除去しないと、HBTを適切に固定しないASC上層が生じる可能性があります。 注:鼻隠しおよび結合組織は脂肪組織の黄色と比較して白または明確な外観によって識別することができる。</li>
	<li>結合組織が除去されたら、滅菌カミソリの刃を使用して、均質な液体の一貫性がなくなるまで組織を細かくミンチします。組織は、25 mLの血清学的先端を使用して容易にピペット加工できる場合に細かく細かく刻む。</li>
	<li>滅菌カミソリの刃を使用して、p1000ピペットチップの先端を切り落とし、ひき肉HBTをピペット化するのを助けます。</li>
	<li>1.5 mLチューブでは、細かく入ったHBT、がん細胞株、およびBC-MPS培地(6ウェルプレートの1ウェルに対して、200μLの細切りHBT、100μLのBC-MPS培地、100μLの癌細胞)を混合します。</li>
	<li>下部セルシートに使用する ASC プレートをインキュベーターからバイオセーフティ キャビネットに移動します。下部ASCプレートからメディアを吸引します。ステップ5.4から遠位端を切り取ったp1000ピペットチップを使用して、底ASCプレートのウェルの中央に混合物をピペット</li>
	<li>上部のASCプレートを含むボックスを、プランジャーを置いてバイオセーフティキャビネットに移動します。pNIPAAmコーティングプレートからゼラチンプランジャーを静かに取り出し、HBT混合物の上に置きます。ウェルにBC-MPSメディアを追加します(6ウェルプレートの1ウェルに2mLのメディアを追加します)。BC-MPS混合物とプランジャーを含む底のASCプレートを滅菌プラスチックボックスに慎重に移動させ、箱の蓋を入れ、輸送します。 注:6ウェルプレートの蓋は、プランジャーがオンになっている間はASCプレートに戻りません。文化を汚染しないように注意する必要があります。</li>
	<li>ゼラチンが溶けるまで37°Cで箱の中の底板をインキュベーターにインキュベートし、最上のASC層が底層に付着し始めた(〜30分)。</li>
	<li>プレート付きのボックスをバイオセーフティキャビネットに移動します。下のプレートからプランジャーをそっと取り出します。癌細胞を有する組織は、井戸の底に固定されます。</li>
	<li>6ウェルプレートの蓋を底板に戻し、37°Cでインキュベートしてゼラチンを完全に溶融させ、最上層を底層に完全に固定させます(〜30〜60分)。</li>
	<li>プレートをバイオセーフティキャビネットにそっと移動し、10 mL血清ピペットでメディアを吸引します。各井戸に新鮮なメディアの2 mLを追加します。組織を取り除かないように、井戸とピペットの端から井戸の端に吸引する。</li>
	<li>BC-MPSを37°C、5%CO2で所望の時間を維持し、2〜3日ごとにメディアを交換してください。</li>
</ol>6. 分析のためのBC-MPSの消化
<ol><li>BC-MPSを分析する準備ができたら、プレートをバイオセーフティキャビネットに移動します。セロロジカルピペットでメディアを除去し、偶発的な組織の脱外を避けます。</li>
	<li>各井戸にPBSの1ボリュームを追加します。</li>
	<li>血清ピペットでPBSを取り出します。</li>
	<li>各ウェルに細胞の解離液の1 mLを追加します。プレートをインキュベーターに戻し、37°Cで5分間インキュベートし、細胞を取り外します。バイオセーフティキャビネットでは、細胞スクレーパーを使用して、細胞と組織を培養プレートから完全に取り外します。</li>
	<li>血清ピペットを使用して、組織と溶液を15 mLの円錐管に移します。各ウェルに2 mLのPBSを加えて、残りの細胞を収集し、この溶液を円錐管に移します。細胞が蛍光である場合は、チューブをアルミニウム箔で包み、光から保護します。</li>
	<li>1 x g の軌道シェーカーで一定の撹拌の下で 37 °C でチューブをインキュベートし、細胞を組織から完全に解離します。</li>
	<li>バイオセーフティキャビネットでは、血清学的ピペットを使用してチューブ内の残りの細胞塊を破壊し、250 μmの組織ストレーナーを通してサンプルを新しい15 mLチューブにフィルターします。それがオーバーフローしないように、ストレーナーを通してゆっくりと溶液をピペット。</li>
	<li>ストレーナーを1 mL PBSでリンスし、ストレーナーに残っている細胞を採取します。</li>
	<li>室温で500 x g でサンプルを5分間遠心する。遠心分離後、アディポサイトは溶液の最上層に浮遊し、癌細胞とASCはチューブの下部のペレットに一緒に混合されます。</li>
	<li>アディポサイトを分離するには、新しいチューブに最上層を静かに注ぐか、代わりにp1000ピペットチップから先端を切断し、上層を新しいチューブに移します。500 x g でサンプルを 5 分間遠心分離し、シリンジと針を使用して、アディポサイトの下から溶液を除去し、アディポサイトのみが残るようにします。アディポサイトは分析の準備が整いました</li>
	<li>溶液からアディポサイトを除去した後、癌細胞が以前に蛍光タンパク質でトランスフェクションされた場合、ASCと癌細胞を互いに分離して分析する。細胞ペレットを破壊することなく、ASCおよび癌細胞を含むチューブから残りの溶液を吸引する。PBSまたはBC-MPS培地中のペレットを再懸濁し、フローサイトメトリーを使用して蛍光に基づいて細胞を選別します。</li>
</ol>

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</ol>

著者らは、競合する利益はないと宣言している。

ヒト乳癌をモデル化するための新しいシステムは、この疾患のより良い理解を開発するために必要とされる。ネイティブECMおよび間質細胞を含む疾患設定をモデル化するヒト微小生理学的システムの開発は、前臨床試験の予測力を高める。ここで示すBC-MPSモデルは、以前のモデルの限界を克服し、ネイティブHBT環境でのBCの評価を可能にする新開発のシステムです。このシステムは癌細胞株または腫瘍の外植物と共に使用することができ、少なくとも14日間は、細胞の細胞を刺傷する。BC細胞に蛍光標識することで、リアルタイムで、リアルタイムまたは特定の時点で、癌細胞運動性および細胞間相互作用、移動、生存率、または増殖をリアルタイムで可視化することが可能になる(図3 および 図5)。このモデルシステムは、がん細胞とそれらの微小環境との相互作用に関連するがん生物学に関する重要な側面を解明するために使用することができる。このシステムの尋問は、TMEの癌進行、薬物反応、および転移の開始をTMEに通知することができる。
<p class="jove_c...

毎年、40,000人以上の米国の女性が乳癌(BC)1で死亡しています。BCの研究に年間7億ドル以上が投資されているにもかかわらず、BC候補薬の97%が臨床試験2,3に失敗しています。医薬品開発パイプラインとBCの理解を深めるためには、新しいモデルが必要です。NIHマイクロ生理学(MPS)プログラムは、基礎科学を臨床成功に翻訳するための画期的なモデルに必要な機能を説明しました 4.これらには、ヒトの原発性細胞または組織の使用、4週間の培養における安定、およびネイティブ組織アーキテクチャおよび生理学的応答の包含が含まれていた。
BC細胞株の2次元培養、膜挿入共培養、三次元スフェロイドおよびオルガノイドなどの現在のインビトロBCモデルは、いずれも在来乳房組織アーキテクチャを再現しないため、NIHのMPS基準を満たしていない。細胞外マトリックス(ECM)がこれらのシステムに添加されると、乳房ECMは使用されません。代わりに、コラーゲンゲルと原膜マトリックスが使用されます。
患者由来異種移植片(PDX)などの生体外システムの電流は、同様に、マウス乳腺組織がヒトの乳房と大きく異なるため、NIHのMPS基準を満たしていない。さらに、免疫系とBCの相互作用は腫瘍の発症の鍵としてますます認識されているが、PDX腫瘍を発生させる免疫不全マウスモデルは成熟したT細胞、B細胞、およびナチュラルキラー細胞を欠いている。さらに、PDXは原発性乳房腫瘍を維持および拡張することを可能にするが、得られたPDX腫瘍は原発性マウス間質細胞およびECM5とに浸潤される。
これらの課題を克服するために、我々はNIH MPS基準を満たす新しい、ex vivo、3次元の人間の乳房MPSを開発しました。私たちの乳房MPSの基礎は、脂肪由来幹細胞(ASC)の2枚のシートの間に原発性ヒト乳房組織(HBT)を挟み込み、HBTからも分離することによって作られる(図1)。HBTを挟むためにセルシートを移すプランジャーは、3Dプリントまたはシンプルなアクリルプラスチックから作ることができます(図1H、I)。この技術は、原発性ヒト白色椎細胞組織6,7を培養するための先に述べたアプローチを適応させる。乳房MPSは、標準的なBC細胞株から原発性ヒト乳房腫瘍に至るまで、選択したBCモデルによって播種することができる。ここでは、これらのBC-MPSが数週間培養中安定していることを示します(図2)。乳腺腺細胞、ECM、内皮、免疫細胞などのHBTのネイティブ要素が含まれます (図 3);代謝クロストークなどのBCとHBTの生理学的相互作用を再現する(図4)。最後に、BC-MPSがHBT全体のBC細胞のアメーバ運動の研究を可能にすることを示す(図5)。

<table><tbody><tr><td>Accumax</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>1333</td><td>BC-MPS</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Corning</td><td>25-058-CI</td><td>細胞の継代のための細胞剥離溶液</td></tr><tr><td>BioStor Container 16oz</td><td>National Scientific Supply Co</td><td>MPCE-T016</td><td>無菌組織の輸送用</td></tr><tr><td>細胞培養 75 cm フラスコ</td><td>Corning</td><td>430641U</td><td>ASCの培養用</td></tr><tr><td>コニカルチューブ15mL&nbsp;</td><td>ThermoScientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>湾曲鉗子</td><td>ThermoScientific</td><td>1631T5</td><td>ミンチ中の組織操作用&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM 低グルコース、グルタマックス付き</td><td>Gibco</td><td>10567-014</td><td>ASCおよびBC-MPS</td></tr><tr><td>FBS培養</td>用 <td>認定 Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>ゼラチン</td><td>シグマ</td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 10x</td><td>Gibco</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>221465</td><td></td></tr><tr><td>Nunc UpCell 6ウェルプレート</td><td>ThermoScientific</td><td>174901</td><td>トップASC細胞シート</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>ペン/連鎖球菌 5,000U</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿 150 cm</td><td>フィッシャーブランド</td><td>FB0875714</td><td>ミンチしながら組織を保持するため&nbsp;</td></tr><tr><td>かみそりの刃VWR</td><td></td><td>55411-055</td><td>組織をミンチするためのシングルエッジ</td></tr><tr><td>ストレーナー 250um&nbsp;</td><td>ThermoScientific</td><td>87791</td><td>BC-MPS</td></tr><tr><td>組織培養の分離用 6 ウェルプレート</td><td>Corning</td><td>3506</td><td>ボトム ASC セル シート</td></tr><tr><td>ウェイト/ワッシャー</td><td>BCP ファスナー</td><td>BCP672</td><td>プランジャーの計量用 1/2" 内径</td></tr></tbody></table>

微小生理学的システムを用いたヒト乳房組織における乳癌のモデル化

Modeling Breast Cancer in Human Breast Tissue using a Microphysiological System

乳癌(BC)は依然として女性の主要な死因である。BCの研究に年間7億ドル以上が投資されているにもかかわらず、BC候補薬の97%が臨床試験に失敗しています。したがって、病気の理解を深めるために新しいモデルが必要です。NIHの微生理学的システム(MPS)プログラムは、基礎科学の発見の臨床翻訳を改善し、新しい治療戦略を有望にするために開発されました。ここでは、乳癌(BC-MPS)のMPSを生成する方法を提示する。このモデルは、脂肪由来幹細胞シート(ASC)sの間にWATを挟み込み、ヒト一次脂肪組織(WAT)を培養するという先に説明したアプローチを適応させる。BC-MPSの新しい側面には、BC細胞を非疾患ヒト乳房組織(HBT)に播種し、天然の細胞外マトリックス、成熟した腺細胞、常駐線維芽細胞、免疫細胞を含む。HBT由来ASCシート間でBC-HBT混和剤を挟み込む。得られたBC-MPSは、少なくとも14日間の培養ex vivoにおいて安定である。このモデルシステムは、アディポサイト、間質細胞、免疫細胞、および細胞外マトリックスを含むBCに影響を与える微小環境の複数の要素を含む。したがって、BC-MPSは、BCとその微小環境との相互作用を研究するために使用することができる。 
我々は、癌の進行と転移に影響を及ぼすと知られている2つのBC行動を研究することによって、BC-MPSの利点を実証する:1)BC運動性および2)BC-HBT代謝クロストーク。BC運動は以前、生体内イメージングを用いて実証されていましたが、BC-MPSでは数日間にわたって蛍光顕微鏡を用いた高分解能のタイムラプスイメージングが可能です。さらに、代謝クロストークは、BC細胞と未熟なアディポサイトに分化したマウス前アディポサイトを使用して以前に実証されましたが、BC-MPSモデルは、初代ヒト乳腺細胞とBC細胞の間でこのクロストークを実証した最初のシステムです。

培養の安定性 BC-MPSは、少なくとも14日間インビトロで培養することができる安定した微生理学的システムである。ASC細胞シートの明視野画像を100倍倍で撮影し、コンフルエントシートの線状パターンを表示した(図2A)。ASC細胞シートは、少なくとも4週間培養において安定である。6ウェルプレートの1ウェルで培養した14日でのBC-MPSは、浮力HBTが14日後にASC細胞シートによって引き続きウェルの底部に安定して固定されていることを示すカラーカメラで画像化した(図2B)。これは、脂肪組織を挟むために使用される細胞シートがまだそのままであることを示しています。RFPを発現するトリプルネガティブBC細胞株MDA-MB-231をHBTで14日間培養し、その後、細胞株を出したBC-MPSの安定性を少なくとも14日間に示す蛍光顕微鏡でイメージングした(図2C)。組...

このプロトコルは、貯蔵材料を使った原発性ヒト乳房組織を用いて乳癌を研究するためのインビトロ微小生理学的システムの構築を記述する。

Breast cancer (BC) remains a leading cause of death for women. Despite more than $700 million invested in BC research annually, 97% of candidate BC drugs ...

これは、ヒト乳房組織とヒト乳癌との相互作用の研究を直接可能にする、ヒト乳房組織を長期間生きて維持することを可能にする最初のプロトコルである。この技術の主な利点は、乳房アディポサイト、免疫細胞、血管構造、管構造および細胞外マトリックスを含むヒト乳房組織の巨視的な部分を生き続けることを可能にすることである。この技術は、個別化医療、医薬品開発、腫瘍開始の病態生理学、線維症や細胞外マトリックスリモデリングなどの遅い乳癌プロセスを含む乳癌研究のいくつかの分野に大きな影響を与えます。この手順を実証するには、トゥレーン大学院生のキャサリン・ヘバートと、私の研究室のトゥレーン医学生のラケシュ・グララです。まず、調製したゼラチン溶液を摂氏37度の水浴で溶かします。5または10ミリリットルの血清学的ピペットを使用して、この溶液の2.5ミリリットルを6つのウェルプレートの井戸のプランジャーに分配します。ゼラチンが固まったら、pNIPAAmコード化されたASCプレートをバイオセーフティキャビネットに移動します。ゼラチンがASCに接触するように、これらのプレートの井戸に慎重に突っ込みを置きます。プランジャーに金属ワッシャーを置き、ゼラチンが室温で30分間ASCシートに直接接触するように計量します。プランジャー付きのプレートをバイオセーフティキャビネットの滅菌箱にそっと動かし、蓋をします。箱を4度冷蔵庫に移動するか、プレートを氷の上に置き、バイオセーフティキャビネットにアイスバケツを30分間置きます。バイオセーフティキャビネットでは、ヒト乳房組織を10ミリリットルの無菌PBSで3回洗浄します。無菌鉗子とカミソリの刃を使用してBC-MPSを粗くミンチし、できるだけ多くの筋膜および結合組織を除去してみてください。結合組織が除去されたら、滅菌カミソリの刃を使用して、均質な液体の一貫性が保たれるまで組織を最終的にミンチします。P1000ピペットチップの先端を切り、ひき肉をピペット化します。1.5ミリリットルチューブで、テキスト原稿に記載されているようにミンチ組織、癌細胞株およびBC-MPS培地を組み合わせる。底部のセルシートに使用するACSプレートをインキュベーターからバイオセーフティキャビネットに移動し、プレートからメディアを吸引します。作製した乳房組織混合物をカットピペットチップを使用して底部ACSプレートのウェルの中央にピペットし、プランジャー付き上部ACSプレートを含むボックスをバイオセーフティキャビネットに移動させる。pNIPAAmコーティングされたプレートからゼラチンプランジャーを静かに取り出し、組織混合物の上に置きます。BC-MPSメディアをウェルに追加し、BC-MPS混合物とプランジャーを使用して底部のACSプレートを滅菌プラスチックボックスに慎重に移動します。輸送のために箱の蓋を置き、培養物の汚染を避けるように注意してください。底板を箱に入れ、ゼラチンが溶けて最上のACS層が底層に付着し始めるまで、37°Cのインキュベーターをインキュベートします。その後、プレートと一緒に箱をバイオセーフティキャビネットに移動させ、下のプレートからプランジャーを静かに取り外し、癌細胞を井戸の底に固定した組織を観察します。6ウェルプレートの蓋を底板に戻し、37度でインキュベートしてゼラチンを完全に溶かし、最上層を底層に固定させます。プレートをバイオセーフティキャビネットにそっと移動し、10ミリリットルの血清ピペットで井戸の端からメディアを吸引します。組織を取り出さないように、各井戸の端に新鮮な培地を2ミリリットル加えます。BC-MPSを摂氏37度、二酸化炭素を5%の二酸化炭素で所望の時間維持します。2~3日ごとにメディアを交換する。BC-MPSを分析する準備ができたら、プレートをバイオセーフティキャビネットに移動します。セロロジカルピペットでメディアを除去し、偶発的な組織の脱外を避けます。各井戸にPBSの1つのボリュームを追加します。その後、血清ピペットでPBSを取り除く。各ウェルに1ミリリットルの細胞解離液を加え、プレートをインキュベーターに5分間戻して、この細胞を取り外します。インキュベーション後、細胞スクレーパーを使用して、細胞および組織をバイオセーフティキャビネット内の培養プレートから完全に剥離します。組織と一緒に溶液を15ミリリットルの円錐管に移し、2ミリリットルのPBSを加えて残りの細胞を採取する。細胞が蛍光性の場合は、チューブをアルミホイルで包みます。1回Gで一定の攪拌下で37度のチューブを10〜20分間インキュベートし、組織から細胞を完全に解離する。バイオセーフティキャビネットでは、血清学的ピペットを使用して、チューブ内の細胞の残りの塊を破壊します。そして、250マイクロメートルのティッシュのストレーナーを通して新しい15ミリリットルの管にサンプルをフィルターする。残りの細胞を収集するためにPBSの1ミリリットルでストレーナーをすすいでください。サンプルを室温で500倍にして5分間遠心し、最上層に浮遊するアディポサイトを癌細胞とASCとペレットに混ぜ合わせて分離する。鈍い切りピペットの先端を使用して新しい管にアディポサイト層を移す。サンプルを再び遠心分離し、シリンジと針を使用して、残りの溶液を葉分の下から取り除きます。細胞ペレットを破壊することなく、ASCおよび癌細胞を含むチューブから残りの溶液を吸引する。PBSまたはBC-MPS培地中のペレットを再懸濁し、フローサイトメトリーを使用して蛍光に基づいて細胞を選別します。コンフルエントASCシートのストリエイドパターンがここに示されています。浮力のあるヒト乳房組織は、14日間培養した後も、ASC細胞シートによってウェルの底に固定された安定であった。蛍光顕微鏡画像は、14日後にRFP細胞株を発現し、少なくとも6日間はトリプルネガティブ腫瘍外植PDXを有するMDA-MB-231を用いたBC-MPSの安定性を示す。乳房組織を含むBC-MPSを14日間インビトロで培養し、染色および画像を100Xおよび20倍倍で組織のネイティブ要素を実証した。マクロファージマーカーの染色は、培養中の3日および7日後の主要マクロファージの保存を示すために使用した。14日後にボディス染色MDA-MB-231細胞のフローサイトメトリー分析は、2D培養および広範な脂質蓄積およびBC-MPSにおける最小限の脂質蓄積を示す。脂質陽性MDA-MB-231細胞の割合は、2D培養よりもBC-MPSにおいて26.2倍大きかった。表示されたBC-MPSで培養した細胞は、標準2D培養で培養した細胞と比較して脂質滴を増加させる。MDA-MB-231細胞を有するBC-MPSと標識されたRFPのタイムラプス画像は、擬似ポッドおよび高運動性を有する231細胞のアメーバ運動を示した。乳房組織は十分に小さく細かく刻み、井戸の底部に分布するのに十分分離されなければならない。乳房組織は非常に浮力があり、破片が大きすぎるか、あまりにも密接に一緒にクラスター化されている場合、ASC細胞シートは乳房組織を井戸の底に固定することはできません。得られた乳房組織癌構築物は、特定の細胞タイプの関心を単離するために酵素消化を受けることができる。これにより、乳房組織の癌細胞が従来の2D培養やオルガノイドと比較して化学療法にどのように反応するかなどの重要な質問に答えが可能になります。

modeling-breast-cancer-human-breast-tissue-using-microphysiological

Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

我々は、コラーゲンベースを開発している...

光学投影トモグラフィを用いたヒト乳癌検体とその分析の長期培養

標準的な培養法では、細胞は、それらの生理的環境から採取し、皿のプラスチック表面上に成長した。初代ヒト骨髄細胞の挙動を研究するために、我々は、細胞が組織の天然の微小環境をrecapitulating条件下で増殖される3-D培養系を作成した。...

初代ヒト骨髄およびその悪性腫瘍を研究する三次元組織培養モデル

癌は、腫瘍の周囲の組織だけでなく、ローカルプロ - および抗炎症性メディエーターによって影響される複雑な疾患である。したがって、むしろ皮下モデルより異方性注入モデルは、方法をより良く模倣するヒト病理における癌の進行を研究するために有用であり得る。...

腫瘍増殖を研究するためにマウスの乳房脂肪パッド中に乳癌細胞の同所注入。

私たちは、ヒト乳癌におけるホルモン作用を研究するための新規のex vivoモデルを開発した。これは、組織構造、細胞間相互作用、およびパラクリンシグナル伝達を維持する外科乳房組織標本から単離された組織の微細構造に基づいている。...

アン<em&gt;エクスビボ</emヒト乳癌でホルモンの作用を研究するために&gt;モデル

プロトコルは、ヒト骨組織外植片モデル系において乳癌細胞の移動、増殖およびコロニー形成を研究するために記載されている。...

培養ヒト大腿骨組織外植するための方法は、転移性ニッチの乳癌細胞コロニー形成を研究する

生理学的に関連するモデルにおける卵巣腫瘍の進行を研究するために、多細胞スフェロイドは、シミュレートされた流体の流れの下でのマイクロデバイスで培養しました。このダイナミックな3Dモデルは、卵巣癌転移が起こる細胞および機械部品を腹腔内環境をエミュレートします。...

ダイナミックな3D腹膜のマイクロデバイスに卵巣癌多細胞スフェロイドの挙動のモデル化

ここでは、侵襲性、ハンドル簡単方法は、以下の単純な乳腺の脂肪パッドに乳がん細胞を注入するためのプロトコルを提案して適切な乳腺脂肪パッド環境とこのマウス実験乳房のがんモデルはの様々...

マウス乳腺の脂肪パッドに乳癌細胞の同所性同種注入

このプロトコルの目的は、マウス乳腺へのクレ発現アデノウイルスの誘導注射に基づく新しい乳癌モデリングアプローチを記述することです。このアプローチにより、細胞型と臓器特異的の両方の発生イベントを一時的に制御した方法で操作できます。...

マウス乳腺へのクレオンゲンデノウイルスの誘導注射による乳癌のモデル化

乳腺上皮細胞と内皮細胞との間のクロストークは、乳癌の進行、腫瘍の増殖、転移に重要な貢献をする。本研究では、スフェロイドは、血管および/またはリンパ内皮細胞と共に乳癌細胞から作られ、乳癌研究のための インビトロ...

乳がん研究のための潜在的機能 インビトロ モデルとしての乳腺上皮および内皮細胞スフェロイド

このプロトコルは、ハイスループットの基礎およびトランスレーショナルヒトがん研究を実行し、薬物スクリーニング、疾患モデリング、および個別化医療アプローチを進歩させるための生理学的に関連性のある腫瘍オンチップモデルを提示し、ローディング、メンテナンス、および評価手順を説明します。...

がん研究のための生理学的ヒト血管新生微小腫瘍モデルの確立

本プロトコルは、制御された三次元培養システムにおいて乳腺形態形成の重要な特徴を再再現するヒト乳房オルガノイドを生成する定義されたハイドロゲルを用いた方法を記述しています。...

乳腺形態形成を再現する三次元ヒト乳房オルガノイドを生成する定義されたハイドロゲルベースの方法

学ぼう、微小生理学的システムを用いたヒト乳房組織の乳癌モデル化。ゼラチン溶液とASCシートで組織を長期維持し、がん細胞との相互作用を解析する革新的な方法です。

微小生理学的システムを用いたヒト乳房組織における乳癌のモデル化

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