単一の卵母細胞レポーターアッセイを用いたインビトロ成熟時の母体母体翻訳プログラムの定義
2021年6月16日
このプロトコルは、 インビトロ 成熟時の単一卵母細胞におけるmRNA翻訳の調節を研究するためのレポーターアッセイを記述する。
この方法は、卵母細胞成熟時に翻訳を制御する調節要素を識別し、特徴付けるために使用することができる。我々は、インビトロ卵母細胞成熟を通じてレポーターの蓄積を評価するためにタイムラプス顕微鏡を適用した。これは、卵母細胞の成熟中に翻訳活性化または抑圧が行われる時間を正確に特定します。
まず、26ゲージ針で卵胞壁に小さな切り傷を入れ、角包を慎重に開けます。口操作ガラスピペットを使用して、cumulus細胞のいくつかの層を持つ無傷のCOCを分離します。より小さなピペットを使用し、繰り返しピペット処理を行うことによってCOCを機械的に脱裸にします。
裸卵母細胞を吸引し、クロスターミドの1ミクロモルを補った成熟培地を含むシャーレに入れます。卵母細胞が卵胞からの分離によって引き起こされるストレスから回復できるように、皿を2時間保育器に入れます。長さ10センチメートルのホウケイ酸ガラスキャピラリーチューブをメカニカルプーラーに入れ、注射針を準備します。
最適な注入のために熱されたフィラメントを使用して45度の角度で針先を曲げてください。ポリスチレン皿に基本的な卵母細胞採取培地の20マイクロリットルの液滴を入れ、軽いミネラルオイルで液滴を覆います。Ypet UTRとmCherryのマイクロリットル当たり12.5マイクログラムをそれぞれ追加して、より大きな量のレポーターミックスを準備します。
これらのアリコートをマイナス80度で保管してください。解凍すると、20,000倍Gで2分間アリコートを遠心分離し、新しいマイクロ遠心分離管に移します。注射針に約0.5マイクロリットルのレポーターミックスを積み込みます。
保持ピペットと注射針をホルダーに入れ、卵母細胞採取培地の液滴に入れる。注入針を、保持ピペットにそっと叩いて開きます。卵母細胞を基本採取培地の液滴に入れ、レポーターミックスの5〜10ピコリターを注入する。
卵母細胞と成熟培地を1マイクロモルクロスターミドで16時間インキュベートし、mCherry信号を高原にします。タイムラプス顕微鏡の場合は、注入されたレポーターごとに20マイクロリットルの成熟培地のペトリ皿、制御プロフェーズI逮捕卵母細胞のための1つの小臼歯シロスターミドを含む1滴、および成熟卵細胞のためのクロスタミドなしの1滴を準備する。軽いミネラルオイルで液滴を覆い、インキュベーターに入れます。
インキュベーション後、注入した卵母細胞をインキュベーターから取り出し、シロスターミドなしで成熟培地で4回洗浄します。一つのミクロモルシロスタミドを熟成I卵子対照群として成熟培地に入れる。注入された卵母細胞を、以前に調製したタイムラプス顕微鏡皿のそれぞれの液滴に移す。
閉じたガラスピペットで卵母細胞をクラスター化して、記録中の動きを防ぎます。テキスト原稿に記載されているパラメータを使用して、発光ダイオード除去システムと37°Cと5%の二酸化炭素で維持された環境室を装備した電動ステージを備えた顕微鏡の下に皿を置きます。[アプリ]をクリックし、[多次元取得]をクリックして、タイムラプス実験に適した設定を入力します。
最初のタブを選択して、タイムラプス、複数のステージ位置、および複数の波長を選択します。[保存]タブを選択して、実験を保存する場所を入力します。次に、タブ Time-Lapse を選択して、時間ポイント数、期間、および時間間隔を入力します。
タブステージを選択し、明視野をオンにし、新しいウィンドウを開いて取得、取得、およびライブを表示を選択して、卵母細胞の位置を見つけます。卵母細胞が見つかったら、多次元取得ウィンドウに戻り、プラスを押して卵母細胞の位置を設定します。「波長」タブを選択し、明視野、YFP、および mCherry の 3 つの異なる波長を設定します。
Ypet と mCherry の露出を調整し、取得をクリックしてタイムラプス実験を開始します。Ypet 3素数UTR翻訳の解析では、卵母細胞、卵母細胞自体、楕円領域をクリックして、卵母細胞を取り巻く小さな領域を矩形領域をクリックして、2つの領域測定を行います。[ログを開く] をクリックし、[ログ データ] をクリックして、地域の測定データをスプレッドシートにエクスポートします。
個々の卵母細胞と測定された時間ポイントごとに、YFPとmCherry波長について、卵母細胞領域測定からバックグラウンド領域測定値を別々に差し引きます。分相Iと成熟卵母細胞におけるmCherryとYFPの発現は39個の卵母細胞に記録され、そのうち30個が成熟し、9人が陰性対照としてプロフェイズIで逮捕された。I逮捕および成熟卵母細胞のシグナルに対する個々のYFP対mCherry比は、YFP信号をフェーズI逮捕および成熟卵母細胞の最後の10時点の平均mCherry信号で割ることによって、注入された体積について修正された。
レポーターYFPの翻訳速度は、線形回帰を用いたシロスターミド放出の後、プロフェイズIおよび成熟卵母細胞におけるYFP対mCherry比を曲線で測定した。レポーターの蓄積は、ゼロ〜2時間と8〜10時間の間の翻訳速度の有意な差によって示されるように線形パターンに従わない、卵母細胞筋細胞成熟中にインターロイキン7翻訳の活性化を示す。このプロトコルを試す場合は、記録の開始時に露出時間が十分であることを確認してください。
卵母細胞の再開中に翻訳が活性化された場合、信号は時間経過中に飽和する可能性があることを覚えておいてください。MRMAの安定性は、PCRにより、YFP用プライマーを用いて確認することができる。翻訳の変化を確認するには、V5技術に対する抗体を用いてウェスタンブロッティングを使用することができます。
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概要
このプロトコルは、in vitro での成熟中の単一の卵細胞におけるmRNA翻訳の調節を研究するためのレポーターアッセイを説明しています。この方法により、このプロセス中の翻訳を制御する調節要素の同定と特徴付けが可能になります。
主要な研究要素
科学分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 発生生物学
背景
- mRNAの翻訳の理解は、発生過程にとって重要です。
- 卵細胞の成熟は、生殖生物学における重要な段階です。
- 調節要素は翻訳制御において重要な役割を果たします。
- タイムラプス顕微鏡は、動的な生物学的プロセスへの洞察を提供できます。
研究の目的
- 卵細胞の成熟中の翻訳活性化または抑制のタイミングを評価すること。
- mRNA翻訳制御を研究するためのレポーターアッセイを利用すること。
- 卵細胞の発達を支配する分子メカニズムの理解を深めること。
使用された方法
- レポーターの蓄積をモニターするためのタイムラプス顕微鏡。
- 卵胞腔卵胞からの完全な冠状細胞-卵細胞複合体（COCs）の分離。
- ピペッティング技術を用いたCOCsの機械的脱皮。
- in vitro 成熟中の翻訳制御の評価。
主要な結果
- 翻訳制御の重要なタイムポイントの同定。
- 翻訳に影響を与える調節要素の特徴付け。
- 卵細胞研究におけるレポーターアッセイの成功した応用。
- 成熟中のmRNA翻訳のダイナミクスへの洞察。
結論
- レポーターアッセイは卵細胞のmRNA翻訳を研究するのに効果的です。
- タイムラプス顕微鏡は翻訳制御に関する貴重なデータを提供します。
- この研究結果は卵細胞の成熟プロセスの理解に貢献します。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Understanding maternal mRNA translation dynamics during oocyte maturation provides critical insights into developmental competence and early embryogenesis, which are foundational for reproductive toxicology and fertility-related drug discovery. This single-oocyte reporter assay enables precise temporal mapping of translational activation or repression, supporting mechanistic de-risking in preclinical models of gametogenesis and embryo viability. The approach offers a scalable, quantitative framework for evaluating how small molecules or genetic perturbations influence post-transcriptional gene regulation in a physiologically relevant germ cell system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking specific 3' UTR elements to translational control during a defined developmental window.
- Operational Value: Supports functional target validation through direct measurement of mRNA translation rates in individual oocytes, reducing reliance on indirect transcriptional readouts.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates normalized, ratiometric readouts (YFP/mCherry) that correct for injection variability, enabling robust compound screening in oocytes.
- Operational Value: Establishes a standardized, time-lapse-based workflow for assessing translational kinetics across multiple conditions and time points.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects molecular mechanisms of translational regulation to functional outcomes in oocyte maturation, supporting disease-relevant system modeling.
- Operational Value: Facilitates continuity from discovery through preclinical validation by providing a conserved readout of post-transcriptional regulation applicable across mammalian models.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery biology phase, where it supports hypothesis testing of RNA-binding proteins or regulatory non-coding elements influencing maternal mRNA fate, and feeds into lead identification by identifying modulators of translation with potential impact on developmental endpoints.
- Discovery Biology: Enables mechanistic de-risking by pinpointing when and how specific mRNAs are translationally activated or repressed during meiotic maturation.
- Screening: Delivers quantitative, normalized translation rates that allow comparison of test conditions against controls using linear regression of ratiometric signals.
- Analytics: Provides time-resolved, background-subtracted fluorescence measurements that support statistical comparison of translational dynamics across experimental groups.
- Translational Research: Offers a conserved assay format to assess whether identified regulatory elements translate across species, supporting preclinical model relevance.
- Enterprise Reuse: The core reporter strategy (fluorescent protein fused to target 3' UTR with co-injected control) is adaptable to other mRNAs and species, promoting platform-level application.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in post-transcriptional regulation by providing direct, real-time visualization of translation in single cells.
- Operational Value: Ensures reproducibility through internal normalization (mCherry) and standardized oocyte handling, minimizing technical noise.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions in fertility-related programs by offering early insight into compounds that disrupt essential translational programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on their influence on oocyte developmental competence via mRNA translation control.
Implementation Considerations
- Requires expertise in oocyte handling, micromanipulation, and fluorescence microscopy.
- Dependent on microinjection systems, time-lapse capable microscopes with environmental control, and image analysis tools for region-based quantification.
- Necessitates standardization across laboratories for oocyte collection, injection volume control, and background subtraction protocols.
- Adaptation to other model systems may require optimization of reporter construct stability and injection parameters.
- Signal saturation and phototoxicity must be managed during prolonged time-lapse imaging, particularly when translation is strongly activated.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:38
Aspiration of Denuded Oocyte and its Microinjection
3:18
Time-lapse Microscopy and Analysis of Ypet-3 UTR Translation
6:00
Results: Statistical Analysis of the Expression for Reporter-YFP and mCherry in Prophase I and Maturing Oocytes
7:19
Conclusion
