Name: イシュ血症/再灌流の豚モデルにおける脊髄微小灌流のリアルタイム評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: 学ぶ脊髄微小灌流のリアルタイム評価法。レーザードップラーフロー針型プローブを用いて、イシュ血症/再灌流条件下で豚モデルの脊髄微小循環を評価し、治療アプローチの効果を測定する最小侵襲的技術です。

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著者らは、ハノーバー医科大学動物研究所のレナ・ブリックス(V.M.D)と、ドイツのハンブルク・エペンドルフ大学医療センターの研究動物ケア施設であるジュッタ・ダムマン夫人に、術前および周産期動物ケアと動物の取り扱いに関する技術的支援を提供してくれたことに感謝したいと考えている。著者らはさらに、ルクセンブルクのオピタル・キルヒベルク血管外科のダニエル・マンゾーニ博士の技術支援に感謝したいと考えています。

コンスタンティンJ.Cトレプテは、マケの講義で名誉賞を受賞しました。他のすべての著者は、利益相反を宣言しません。この研究は、欧州麻酔学会ヤング・インカテ立探偵助成金2018によって支援されました。

脊髄虚血によって誘発されるSCIは、患者の転帰1、2、3、4、10、11、12に大きな影響を与える大動脈修復の主要な合併症である。SCIを予防し、治療するためのマイクロ循環療法が最も有望である。このプロトコルは、リアルタイムの脊髄微小循環評価のための再現可能な方法を提供し、虚血/再灌流条件下で脊髄微小循環に対する新しい治療アプローチの効果を評価する能力を提供する。
この実験モデルには、いくつかの重要な方法論的ステップがあります。動物の損失を防ぐために、研究者は麻酔技術(髄液排液挿入、大動脈暴露中のソノグラフィ血管アクセスお...

虚血/再灌流(SCI)によって引き起こされる脊髄損傷は、減らされた転帰1、2、3、4に関連する大動脈修復の最も壊滅的な合併症の1つである。SCIの現在の予防および治療オプションには、大血体力学パラメータの最適化と、脊髄灌流圧2、5、6、7、8、9を改善するための脳脊髄液圧(CSP)の正常化が含まれる。これらの操縦の実施にもかかわらず、SCIの発生率は、大動脈修復10、11、12の複雑さに応じて、まだ2%から31%の範囲です。
最近、微小循環は13,14に注目を集めている。微小循環は、細胞酸素取り込みおよび代謝交換の領域であり、したがって、臓器機能および細胞完全性13において重要な役割を果たす。微小循環血流の障害は、15,16,17,18,19の増加死亡率に関連する組織虚血の主要な決定要因である。脊髄微小循環の障害は、神経機能の低下と結果20、21、22、23に関連する。従って、SCIの治療のためのマイクロ灌流の最適化が最も有望なアプローチである。微小循環障害の持続性は、マクロ循環最適化にもかかわらず、26、27、28、29と記載されている。この血行性の一貫性の喪失は、虚血/再灌流を含む様々な条件で頻繁に起こり、直接微小循環評価および微小循環標的療法26、27、30の必要性を強調する。
これまでのところ、脊髄微小循環挙動20,31のリアルタイム評価にレーザードップラープローブを使用した研究はごくわずかである。既存の研究は、しばしば微小球注入技術を使用してきましたが、これは断続的な使用および事後分析32,33によって制限される。マイクロスフィア注入技術を用いた異なる測定の数は、波長の異なる微小球の利用可能性によって制限される。さらに、レーザードップラー技術とは対照的に、この方法では事後組織の処理と分析が必要であるため、マイクロ灌流のリアルタイム評価は不可能です。ここでは、虚血/再灌流の豚大動物モデルにおける脊髄微小循環のリアルタイム評価のための実験プロトコルを提示する。
本研究は、虚血/再灌流における微小循環に対する結晶とコロイドの影響を比較する無作為化研究と、脊髄マイクロ灌流に対する流体対バソプレッサーの影響に関する探索的無作為化研究を組み合わせた大規模な動物プロジェクトの一環であった。フロープローブ2点キャリブレーションと圧力先端カテーテルキャリブレーションは、以前に説明した34.報告されたプロトコルに加えて、蛍光微小球は脊髄微小灌流の測定に用いられ、前述のように、各動物に対して12サンプルの脊髄組織を用い、下肢脊髄35,36を表す試料1~6と7-12を有する。マイクロスフィア注入は、レーザードップラー記録及びマクロヘモ力学的評価の完了後の測定工程ごとに行った。病理学的評価は、前述の37のようにクラインマンスコアを用いて行った。

<table><tbody><tr><td>CardioMed 流量計</td><td>Medistim AS、オスロ、ノルウェー</td><td>CM4000</td><td>フロープローブ用流量計 大腿動脈</td></tr><tr><td>CardioMed フロープローブ、5mm</td><td>Medistim AS、オスロ、ノルウェー</td><td>PS100051</td><td>フロープローブ 大腿動脈</td></tr><tr><td>COnfidence プローブ,&nbsp;</td><td>Transonic Systems Inc., Ithaca, NY, USA</td><td>MA16PAU</td><td>Flow-Probe Aorta</td></tr><tr><td>16 mm liners</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DIVA Sevoflurane Vapor</td><td>Dr&auml;ger Medical, L&uuml;ベック、ドイツ</td><td></td><td>蒸気</td></tr><tr><td>ホットライン レベル 1 流体ウォーマー</td><td>Smiths Medical Germany GmbH、グラスブルン、ドイツ</td><td>HL-90-DE-230</td><td>流体ウォーマー</td></tr><tr><td>インフィニティ デルタ</td><td>Dr&auml;ger Medical, L&uuml;ベック、ドイツ</td><td></td><td>ベーシックモニタリングハードウェア</td></tr><tr><td>Infinity Hemo</td><td>Dr&auml;ger Medical, L&uuml;ベック、ドイツ</td><td></td><td>基本圧力モニタリングおよび肺熱希釈ハードウェア</td></tr><tr><td>LabChart Pro</td><td>ADInstruments Ltd.、オックスフォード、英国</td><td>v8.1.16</td><td>共時レーザードップラー、血圧、ECG、血流取得ソフトウェア</td></tr><tr><td>LiquoGuard 7</td><td>M&ouml;ller Medical GmbH, Fulda, Germany</td><td></td><td>Cerebrospinal Fluid Drainage System</td></tr><tr><td>Millar Micro-Tip Pressure Catheter (5F, Single, Curved, 120cm, PU/WD)</td><td>ADInstruments Ltd., Oxford, UK</td><td>SPR-350</td><td>Pressure-Tip Catheter Aorta</td></tr><tr><td>moor VMS LDF</td><td>moor Instruments, Devon, UK</td><td></td><td>指定レーザードップラーハードウェア</td></tr><tr><td>ムーア VMS Research Software</td><td>moor Instruments, デヴォン, イギリス</td><td></td><td>指定レーザードップラーソフトウェア</td></tr><tr>血管<td>周囲フローモジュール</td><td>Transonic Systems Inc., Ithaca, NY, USA</td><td>TS 420</td><td>Flow-Module for Flow-Probe Aorta</td></tr><tr><td>PiCCO 2, Science Version</td><td>Getinge AB, G&ouml;テボルグ、スウェーデン</td><td>v. 6.0</td><td>血圧と経心肺モニタリング ハードおよびソフトウェア</td></tr><tr><td>PiCCO 5 Fr. 20cm</td><td>Getinge AB, G&ouml;テボルグ、スウェーデン</td><td></td>の<td>サーミスタ先端の幹線&nbsp;</td></tr><tr><td>PowerLab</td><td>ADInstruments Ltd., Oxford, UK</td><td>PL 3516</td><td>Synchronic Laser-Doppler, Blood Pressure, ECG and Blood-Flow Aquisition Hardware</td></tr><tr><td>QuadBridgeAmp</td><td>ADInstruments Ltd., Oxford, UK</td><td>FE 224</td><td>Laser-Doppler and Invasive Blood Pressure Aquisition</td></tr><tr><td>Silverline</td><td>Spiegelberg, Hamburg, Germany</td><td>ELD33.010.02</td><td>脳脊髄液ドレナージ</td></tr><tr><td>SPSS統計ソフトウェアパッケージ&nbsp;</td><td>IBM SPSS Statistics Inc., Armonk, New York, USA</td><td>v. 27</td><td>Statistical Software</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Twinwarm Warming System</td><td>Moeck &Moeck GmbH、ハンブルク、ドイツ</td><td>12TW921DE</td><td>ウォーミング システム</td></tr><tr><td>ユニバーサル II ウォーミング ブランケット</td><td>Moeck &Moeck GmbH、ハンブルク、ドイツ</td><td>906</td><td>ウォーミング ブランケット</td></tr><tr><td>VP 3 プローブ、長さ 8mm (個別製造)</td><td>moor Instruments、デヴォン、英国</td><td></td><td>レーザードップラー プローブ</td></tr><tr><td>Zeus</td><td>Dr&auml;ger Medical, L&uuml;beck、ドイツ</td><td></td><td>麻酔器</td></tr></tbody></table>

イシュ血症/再灌流の豚モデルにおける脊髄微小灌流のリアルタイム評価

Real-Time Assessment of Spinal Cord Microperfusion in a Porcine Model of Ischemia/Reperfusion

脊髄損傷は大動脈修復の壊滅的な合併症です。脊髄損傷の予防および治療のための開発にもかかわらず、その発生率は依然としてかなり高く、したがって、患者の転帰に影響を与える。微小循環は組織灌流や酸素供給において重要な役割を果たし、しばしばマクロヘモダイナミクスから解離される。したがって、脊髄微小循環の直接的な評価は、微小循環療法の開発および脊髄微小循環に関する既存のアプローチの評価に不可欠である。しかし、ほとんどの方法は、脊髄微小循環のリアルタイム評価を提供しない。本研究の目的は、脊髄に直接挿入されたレーザードップラー針プローブを用いたリアルタイム脊髄微小循環評価のための標準化されたプロトコルを記述することである。私たちは、脊髄微小循環の悪化を誘発するために、虚血/再灌流のブタモデルを使用しました。また、蛍光微小球噴射技術も用いた。当初、動物は麻酔を受け、機械的に換気された。その後、レーザードップラー針プローブの挿入を行い、続いて脳脊髄液の排水の配置を行った。大動脈の大動脈の露出に対して大動脈の大動脈の露出に対して、大動脈切れの中央値を実行した。虚血/再灌流は、合計48分間の超セリアック大動脈クロスクランプによって誘発され、続いて再灌流および血行力学的安定化が行われた。レーザードップラーフラックスは、マクロヘモ力学的評価と並行して行った。さらに、脳脊髄液の排水を自動化して、安定した脳脊髄圧を維持した。プロトコルの終了後、動物を屠殺し、脊髄を組織病理学的および微小球解析のために採取した。このプロトコルは、レーザードップラープローブを用いた脊髄マイクロ灌流測定の実現可能性を明らかにし、再灌流後の回復と同様に虚血中の著しい減少を示す。結果は、蛍光微小球評価と同等の挙動を示した。結論として、この新しいプロトコルは、虚血/再灌流条件におけるリアルタイムの脊髄微小灌流評価を用いた将来の研究に有用な大型動物モデルを提供するかもしれない。

6匹の動物はすべてプロトコルが完成するまで生き残った。動物の体重は48.2±2.9 kgであった。5匹の動物が雄で、1匹が雌であった。脊髄針プローブの挿入と脊髄フラックスの測定は、すべての動物において実現可能であった。
虚血誘導のための大動脈クロスクランプ中の脳微循環および大血体的記録と組み合わせたリアルタイム脊髄微循環記録の例は、アンクランプおよび再灌流中に同様に図3Aに示されている、図3Bに示す。下降大動脈流の破壊の後に脊髄フラックスが著しく低下し、上昇大動脈の圧力が増加した(図3A)。再灌流は反対の効果につながった(図3B)。
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脊髄微小循環は脊髄損傷において極めて重要な役割を果たす。ほとんどの方法では、微小循環を標的とした治療法の開発に不可欠な脊髄微小循環のリアルタイム評価はできません。ここでは、虚血/再灌流の大型動物モデルでレーザードップラーフローニードルプローブを用いたプロトコルを提案する。

Spinal cord injury is a devastating complication of aortic repair. Despite developments for the prevention and treatment of spinal cord injury, its ...

私たちのプロトコルは、脊髄微小循環のリアルタイム評価のための再現性のある方法を提供します。脊髄の微小循環や虚血再灌流状態に対する治療アプローチを評価する能力を提供します。私たちの技術は習得が容易で、低侵襲であり、大動物モデルで脳脊髄液圧とマクロ血行動態と並行して脊髄微小灌流を評価する機会を提供します。手順を実演するのは、麻酔科の専門家であり、当研究室の科学メンバーであるクリストフ・ベヘム博士とティル・フリードハイム博士です。追加のデモ参加者は、麻酔科のレジデントであるマイケル・グレスラーです。生後3ヶ月の40kgのブタで適切な鎮静レベルを確認した後、動物を正しい側方の位置に置き、動物の背中を曲げて椎骨の間のスペースを広げます。棘突起と椎弓の準備のために傍脊椎領域を外科的に露出させ、胸椎13〜14のレベルで脊髄に血管14ゲージ末梢静脈カテーテル傍正中を配置し、2つの椎弓の間に腰椎1〜2のレベルで配置します。針をレーザードップラー針プローブと交換し、プローブを指定されたハードソフトウェアに接続して信号品質をテストします。中程度の脈動性を持つ安定した信号が観察されるべきです。プローブを縫合糸で慎重に固定し、パンニングを使用してプローブが脱臼したりねじれたりするのを防ぎます。脳脊髄圧を測定および制御するための脳脊髄液ドレナージの経皮的配置については、腰椎4〜5またはL5〜6のレベルを特定します。イントロデューサー針で皮膚と皮下腔に穴を開け、インレイ針を抜く。生理食塩水で満たされたシリンジをイントロデューサー針に置き、一定の圧力を使用して針を硬膜外腔に慎重に導入します。抵抗の喪失が感じられたら、正しい硬膜外配置を示し、インレイ針を挿入し、針を髄腔内空間に2〜3ミリメートル進めます。20センチメートルの深さまで排水路を導入します。ルアーロックアダプターを取り付け、酒を慎重に吸引して位置を確認します。次に、ドレナージを縫合糸で慎重に固定し、ドレナージを脳脊髄液ドレナージシステムに接続します。次に、左耳の後ろの頭蓋骨を露出させ、6mmドリルアタッチメントを使用して、頭蓋骨のドリル穴トレパネーションを慎重に行います。2つ目のレーザードップラープローブを直接脳に導入し、縫合糸を使用してプローブを慎重に固定します。プローブをハードとソフトウェアに接続して、信号品質をテストします。中程度の脈動性を持つ安定したシグナルが観察されるべきです。すべてのプローブを切断し、4〜5人のアシスタントの助けを借りて、プローブを邪魔しないように注意しながら、パッドを使用して動物を慎重に仰臥位に置きます。プローブを再接続し、信号品質を確認します。次に、目標圧力10ミリメートル水銀柱とドレナージ量20ミリリットル/時間で連続的な脳脊髄液ドレナージを開始します。ミニ開腹術を行った後、吸気酸素の割合を1つに増やし、パンクロニウムのキログラムあたり0.1ミリグラムを静脈内投与します。胸骨を周囲の組織からそっと解剖し、怪我を防ぐために胸骨後圧迫術を行います。換気を停止した後、振動のこぎりで骨を分割し、吸気酸素の割合を0.3に減らして換気を再開します。電気焼灼を使用して出血を減らし、骨ワックスで胸骨を密閉します。左肺の基部を慎重に動かし、横隔膜の左側部分を分割して、外科的曝露を促進します。左肺を静かに引っ込めて、下行する大動脈を腹腔幹の近位に露出させ、周囲の組織を分割します。下行大動脈の周囲にオーバーホルトを配置して適切な露出を確保し、下行胸部大動脈の周囲にフロープローブを取り付けてから、良質の信号の存在を確認し、フロープローブの遠位下行大動脈の周りに血管ループを取り付けて、大動脈クロスクランプの領域をマークします。ベースライン測定値を取得した後、ヒドロキシエチルデンプンコロイドのキログラムあたり7ミリリットルの連続した体積負荷ステップをステップあたり5分間にわたって投与します。心拍出量の増加が 15% 未満になるまで、各ステップ間で 5 分間の平衡化を行います血行動態の最適化が完了したら、測定を繰り返します。次に、大動脈上大動脈の以前にマークされた領域に大動脈クランプを配置して、虚血再灌流を1分、2分、5分、10分、および30分間隔で合計48分間誘導します。各インターバルの後、大動脈クロスクランプを続けます。最大 5 分後、または大腿動脈の流れの正常化後、下大静脈の手動流入閉塞を実行して、平均動脈圧である水銀 100 ミリリットルを超える血圧上昇を防ぎ、再灌流前の 30 分間のクランプ間隔の終わりに測定を繰り返します。測定値が得られたら、クランプを徐々に開いて血行動態の安定性を確保し、ヒドロキシエチルデンプンコロイドのキログラムあたり7ミリリットルを投与し、安定化のために10〜20マイクログラムのノルエピネフリンおよび/またはエピネフリンの追加ボーラス注射を投与します。必要に応じて、正常炭酸ガス血症を確保するために呼吸数を調整します。.1時間後、測定を繰り返します。再灌流後の測定値を取得した後、示されているようにボリュームローディングを繰り返し、別の測定値セットを取得します。虚血再灌流の誘導から4時間半後、最終的な測定値セットを取得します。ここでは、虚血誘発のための大動脈クロスクランプ中、およびアンクランプおよび再灌流中の脳微小循環およびマクロ血行動態記録と組み合わせたリアルタイムの脊髄微小循環記録の例を観察できます。下行大動脈の流れの混乱に続いて、脊髄流束が著しく減少し、上行大動脈の圧力が増加しました。再灌流は逆の効果をもたらしました。マクロ循環パラメータと微小循環パラメータの統計分析は、虚血中の脊髄フラックスの著しい減少を示しています。対照的に、脳フラックスは虚血中に著しく増加し、推定限界平均とその信頼区間によって示されます。これには、心拍数、動脈圧、全身血管抵抗の増加が伴いましたが、心拍出量と一回出量は減少しました。蛍光マイクロスフェア解析により、下部脊髄の脊髄微小循環血流の顕著な減少が明らかになりましたが、上部脊髄では有意な変化は観察されませんでした。再灌流は逆の効果をもたらしました。プロトコール終了時には心拍出量、一回拍出量、動脈圧がさらに低下したが、脊髄フラックスと脊髄微小循環血流は安定していた。脊髄針プローブの挿入には、解剖学に関する深い知識が必要です。さらに、プローブの取り扱いには非常に高い技術スキルが必要です。脊髄の損傷を防ぐためには、複数回の試みを避ける必要があり、これは方法論に影響を与える可能性があります。

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