Name: 自動画像解析を用いたげっ歯類モデルのサブスタチングニグラにおけるドーパミン作動性ニューロン密度の半定量的決定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
Description: 学ぶ 自動画像解析を用いたげっ歯類モデルのサブスタチアニグラにおけるドーパミン作動性ニューロン密度の半定量的決定法。従来のステレオロジーと比較して時間と労力を大幅に削減し、パーキンソン病研究における神経変性の評価を効率化します。

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著者らは、大学保健ネットワークの先端光学顕微鏡施設(AOMF)のスタッフの皆さんに、このプロトコルの開発に時間と支援をしてくれたことに感謝したいと考えています。

すべての手順は、大学医療ネットワーク動物ケア委員会によって承認され、動物ケアに関するカナダの評議会によって設定されたガイドラインと規制に従って行われました.
1. 定位注射
<ol><li>ペアハウスの成人女性スプレイグ・ドーリーラット(250-280 g)は、木製の寝具と食べ物と水へのアドリブアクセスを備えたケージに入っています。一定の温度と湿度で定期的に12時間の明暗サイクル(06:30のライト)で動物のコロニーを維持します。</li>
	<li>前に説明した8,10のように脳の右側のSNpcに直接AAVの一方的な定位注射を行う(各ラボの好みに応じて、右または左側)。3.4 x 1012ゲノム粒子/mLの最終用の引き込みで、AAV1/2の2 μLを注入します。</li>
</ol>2. 脳切除・免疫検査(IHC)
<ol><li>3分間麻酔室に入れることで、5%イソファランでラットを麻酔します。他の承認された方法は、適切な制度的レビューの後、このステップのために使用することができます.</li>
	<li>ラットが深部麻酔の外科面に達したら、壊死表にしっかりと貼られた鼻コーンに移す。テープを使用してラットの前足を固定し、つま先のピンチ応答法を使用して麻酔の深さを決定します。続行する前に、動物が応答しない必要があります。</li>
	<li>胸骨の下に横切りを行い、胸膜腔を露出させるために、胸部ケージの全長に沿って横隔膜を切断します。胸骨を止め、頭の上に置きます。</li>
	<li>鉗子を使用して心臓をクランプし、左心室の後端に灌流ポンプに接続された蝶の針を挿入します。ラットを150mLのヘパリン化食ラインで経皮的に、または目と皮膚が透明になるまでパーフューズする。4%パラホルムアルデヒド(PFA)による灌流は、生理食動物の代わりに、ある種の抗体またはシンナー脳切血で免疫染色を容易にすることが好ましい。</li>
	<li>灌流が完了したら、ギロチンで切断し、脳を脳マトリックスに抽出し、腹側表面を上に向けます。</li>
	<li>新鮮なカミソリの刃を使用して、コロナ平面2 mmのロストラルを光学チアズムにカットします。スライスしながら脳をゆがめないように、ブレードを左右にスライドさせます。</li>
	<li>脳の後部を、4%PFAの約20mLを含む前ラベル付きバイアルに浸し、48時間の後固定を室温で行います。脳の前部は、−80°Cで保存する前に−42°Cに冷やした2−メチルブタンでフラッシュ冷凍されてもよい。</li>
	<li>48時間後、リン酸緩衝生理食塩液(PBS)に30%スクロースを含む標識されたバイアルに固定脳を移し、沈むまで4°Cで保存します(48-72時間)。</li>
	<li>試料ステージのトラフにドライアイスを入れ、その後100%エタノールを入れてミクロトームを準備します。ステージが冷却されたら、最適な切断温度(OCT)化合物をステージに絞り、直径2cm、厚さ0.5cmの円を形成します。部分的に凍結したら、慎重にOCTのマウンドに脳を下げ、線条体切断面がステージと平行に保たれます。</li>
	<li>脳が凍結するのを助けるためにステージに多くのドライアイスを追加します。脳がクリーム色になったら、ドライアイスの段階をクリアします。</li>
	<li>右半球と左半球を区別するために25G針で脳の右側に穴を開けます。目的の解剖学的構造を通して針を渡さないで注意してください。</li>
	<li>ブレグマ-3.8から始まり、ブレグマ-6.8で終わるコロナ平面の40 μmのセクションを連続的に切断した。</li>
	<li>凍結防止液(40%PBS、30%2-エトキシエタノール、30%グリセロール)を用いたラベルチューブに6シリーズを保管してください。各シリーズは、12の脳のセクションを含む必要があります。</li>
	<li>免疫ヒストケミカル染色用のセクションを1セット選択し、0.2%PBS-Tで3 x 10分洗浄で凍結防止液を洗い流します。</li>
	<li>ブロッキング溶液(10%正常ヤギ血清(NGS)、2%ウシ血清アルブミン(BSA)0.2%PBS-T)で穏やかな栄養を伴うRTで1時間ブロックする。ウサギ抗チロシンヒドロキシラーゼ(TH)抗体(1:500)およびマウス抗α-syn抗体(1:500)を室温で一晩0.2%PBS-Tで2%NGSでインキュベーションしてこれに従ってください。</li>
	<li>0.2%PBS-Tで3 x 5分洗浄で一次抗体を洗い流し、続いてヤギ抗ウサギアレクサフルオール488二次抗体(1:500)とヤギ抗マウスアレクサフルオール555二次抗体を2%NGSで0.2%PBS-Tで1時間インキュベーションします。セクションが光から保護され、優しく栄養を取り除かれるようにします。</li>
	<li>0.2%PBS-Tで3 x 5分洗浄で二次抗体を洗い流し、狭いペイントブラシを使用して光とほこりから保護されたスライドにセクションの完全なセットを取り付けます。蛍光実装媒体と透明な爪のニスとシールカバースリップ。</li>
</ol>3. 共焦点顕微鏡と画像取得
<ol><li>10倍の倍率でコンフォーカル顕微鏡に結合されたソフトウェアを使用してIHC画像をキャプチャします。ピンホールを1.5 AUに開き、合計1.5μmの広い平面をキャプチャし、脳の注入側に焦点を当てます。</li>
	<li>[ 取得 ]タブで、[ タイルスキャン イメージング]オプションをオンにして、寸法を10 x 4に設定します。</li>
	<li>取得モードパネルで、ズームを 1.1 に設定します。これにより、タイル スキャン イメージ間の明白なステッチ マークを回避できます。</li>
	<li>高品質の画像取得を確実にするため、 フレーム サイズ を 1024 x 1024 ピクセルに設定し 、平均 を 2 に設定します。</li>
	<li>チャンネルパネルでトラック1をAlexa488に、トラック2をAlexa555に設定します。</li>
	<li>ステージにスライドをロードし、強いTH染色のセクションを選択します。[取得]パネルで[ライブ]をクリックします。</li>
	<li>チャンネルパネルで、信号を最大化し、バックグラウンドからのノイズを制限するレベルにレーザー強度とゲインを設定します。範囲インジケータを使用して、信号が露出過多にならないようにします(濃い赤色のオーバーレイで示されます)。</li>
	<li>複数のスライドで上記の手順を繰り返して、スライド間のレーザー強度/ゲインを調整できないため、スライド間で一貫した染色を行います。</li>
	<li>[ 取得 ] タブで、[ 職位] ボックスをオンにします。</li>
	<li>この時点で、イメージングを開始する準備が整いました。接眼レンズを使用して、正のTH染色を示す最初のセクションを選択し、目的のポイント(すなわち、SNpc)に焦点を当て、その後、セクションの中線にステージを移動します。これにより、x、y、z 軸の位置が保存され、セクション全体をキャプチャするタイル スキャンがイメージ化されます。</li>
	<li>SNpc 全体のすべてのセクションに対して上記の手順を繰り返し、SNpc の画像の完全なセットを提供します。未注入側の詳細な分析が必要な場合は、非注入側にフォーカスを設定してステップ3.10から3.11を繰り返す必要があります。</li>
</ol>4. 画像解析と定量
<ol><li>適切なソフトウェアを使用して画像ファイルを分離し、画像ファイルを自動画像解析ソフトウェアにインポートします。</li>
	<li>ペン注釈ツールを選択して、SNpc の周囲に注釈を描画して、関心のある領域を定義します。 注:ドーパミン作動性ニューロンの損失が多いセクションでは、一時的に放出/吸収を増加させることで、SNpcを明確に定義するのに役立ちます(図2)。</li>
	<li>[分析] タブに移動し、ドロップダウンメニューから [リアルタイムチューニング] を選択します。これにより、セクションイメージに別のウィンドウが開き、解析パラメータをリアルタイムで変更できます(図3)。</li>
	<li>[ 解析倍率 ]セクションで、適切な画像ズームを選択します。</li>
	<li>[ 細胞検出 ]セクションで、TH染色に使用する色素として核色素を選択します(Alexa Fluor 488)。</li>
	<li>リアルタイムチューニングウィンドウを注意深く見ながら、 核コントラストしきい値、 最小核強度、 核セグメンテーション攻撃性、 核サイズ の設定を調整します。 注: 個々のセルを[リアルタイム チューニング]ウィンドウ内の 1 つのセルとして正確に表現することは、正確性にとって重要です。これらの設定は、使用するソフトウェアによって任意のスケールになりますが、ソフトウェアが個々のセルを正確に区別し、セルと背景を正確に区別するには、正しい調整が必要です(図3)。</li>
	<li>このプロセスを少なくとも 10 個の別々のサンプルで繰り返し、異なるセクション間でセルを構成するものの一様な一致を確認します。 注: 分析タブのマーカー 1 またはマーカー 2 セクションを使用して、同じ解析プラットフォーム内で(α-syn または NeuN など)セルマーカーを追加で識別できます。</li>
	<li>適切な数の画像をサンプリングし、リアルタイムチューニングを調整したら、[ 設定アクション] ドロップダウンメニューで分析設定を保存します。</li>
	<li>分析するすべての画像を選択し、[ 分析] をクリックします。</li>
	<li>保存した解析設定を選択し、[ 解析領域 ] ウィンドウで [アノテーション レイヤー] チェックボックスをオンにします。次に、 レイヤ 1 を チェックして、[ 解析] をクリックします。 注:単一の脳の場合、分析は通常約5分かかります。完成した結果は、セルとしてカウントされた各項目を明確に示します (図 4)。</li>
	<li>完了したら、すべてのセクションのサマリー分析データをエクスポートします。 オブジェクト分析データをエクスポートするオプションがあり、検出された個々のセルのセルサイズを含む詳細なデータを提供します。このデータセットは、毒素/治療に応答して細胞サイズの変化を調べるために使用することができます。</li>
	<li>動物ごとに分析された各セクションの合計セルと、分析された領域の合計 (mm2)を追加します。分析したセルの総数を分析した領域の合計で割って、各ラットの SNpc 内のセル/mm2 の数を計算します。</li>
</ol>

<ol><li>Kalia, L. V., Lang, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease.</a> Lancet. 386 (9996), 896-912 (2015).</li>
<li>West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+stereological+estimation+of+the+total+number+of+neurons+in+thesubdivisions+of+the+rat+hippocampus+using+the+optical+fractionator%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in thesubdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator.</a> The Anatomical Record. 231 (4), 482-497 (1991).</li>
<li>Nair-Roberts, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereological+estimates+of+dopaminergic%2C+GABAergic+and+glutamatergic+neurons+in+the+ventral+tegmental+area%2C+substantia+nigra+and+retrorubral+field+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Stereological estimates of dopaminergic, GABAergic and glutamatergic neurons in the ventral tegmental area, substantia nigra and retrorubral field in the rat.</a> Neuroscience. 152 (4), 1024-1031 (2008).</li>
<li>Golub, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurostereology+protocol+for+unbiased+quantification+of+neuronal+injury+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Aging+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurostereology protocol for unbiased quantification of neuronal injury and neurodegeneration.</a> Frontiers in Aging Neuroscience. 7, 196(2015).</li>
<li>Schmitz, C., Hof, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design-based+stereology+in+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Design-based stereology in neuroscience.</a> Neuroscience. 130 (4), 813-831 (2005).</li>
<li>Penttinen, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementation+of+deep+neural+networks+to+count+dopamine+neurons+in+substantia+nigra%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Implementation of deep neural networks to count dopamine neurons in substantia nigra.</a> European Journal of Neuroscience. 48 (6), 2354-2361 (2018).</li>
<li>Yousef, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuron+loss+and+degeneration+in+the+progression+of+TDP-43+in+frontotemporal+lobar+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Neuron loss and degeneration in the progression of TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration.</a> Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 68(2017).</li>
<li>Koprich, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+human+A53T+alpha-synuclein+in+the+rat+substantia+nigra+using+a+novel+AAV1%2F2+vector+produces+a+rapidly+evolving+pathology+with+protein+aggregation%2C+dystrophic+neurite+architecture+and+nigrostriatal+degeneration+with+potential+to+model+the+pathology+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">Expression of human A53T alpha-synuclein in the rat substantia nigra using a novel AAV1/2 vector produces a rapidly evolving pathology with protein aggregation, dystrophic neurite architecture and nigrostriatal degeneration with potential to model the pathology of Parkinson's disease.</a> Molecular Neurodegeneration. 5, 43(2010).</li>
<li>Koprich, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+neurodegeneration+or+endogenous+compensation+in+an+animal+model+of+Parkinson%27s+disease+produced+by+decreasing+doses+of+alpha-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Progressive neurodegeneration or endogenous compensation in an animal model of Parkinson's disease produced by decreasing doses of alpha-synuclein.</a> PLoS One. 6 (3), 17698(2011).</li>
<li>McKinnon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early-onset+impairment+of+the+ubiquitin-proteasome+system+in+dopaminergic+neurons+caused+by+alpha-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Early-onset impairment of the ubiquitin-proteasome system in dopaminergic neurons caused by alpha-synuclein.</a> Acta Neuropathologica Communications. 8 (1), 17(2020).</li>
<li>Henderson, M. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spread+of+alpha-synuclein+pathology+through+the+brain+connectome+is+modulated+by+selective+vulnerability+and+predicted+by+network+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spread of alpha-synuclein pathology through the brain connectome is modulated by selective vulnerability and predicted by network analysis.</a> Nature Neuroscience. 22 (8), 1248-1257 (2019).</li>
<li>Ip, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV1%2F2-induced+overexpression+of+A53T-alpha-synuclein+in+the+substantia+nigra+results+in+degeneration+of+the+nigrostriatal+system+with+Lewy-like+pathology+and+motor+impairment%3A+a+new+mouse+model+for+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">AAV1/2-induced overexpression of A53T-alpha-synuclein in the substantia nigra results in degeneration of the nigrostriatal system with Lewy-like pathology and motor impairment: a new mouse model for Parkinson's disease.</a> Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 11(2017).</li>
<li>Webster, J. D., Dunstan, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-slide+imaging+and+automated+image+analysis%3A+considerations+and+opportunities+in+the+practice+of+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Pathology%22%5BJournal%5D)">Whole-slide imaging and automated image analysis: considerations and opportunities in the practice of pathology.</a> Veterinary Pathology. 51 (1), 211-223 (2014).</li>
</ol>

著者らは競合する利益を報告していない。

PDの前臨床モデルにおけるドーパミン作動系の完全性の信頼性の高い評価は、潜在的な疾患修飾療法の有効性を決定するために重要である。したがって、組織病理学的データの信頼性と再現性を低下させる可能性のある交点を制御し、最小限に抑えることが重要です。慎重な定量的結果は、定性的または半定量的な記述だけではより多くの情報を提供することができます。同時に、時間と資源の制約は、病理学的変化や細胞の喪失を定量化するために公平なステレオロジカルカウントを実行することが困難になる可能性があることを認識する必要があります。しかし、最近の進歩により、これらの基準の多くは、コンピュータ化された自動イメージングプラットフォーム6を使用して満たすことができます。
このプロトコルは、げっ歯類の脳におけるドーパミン作動性ニューロン/mm2 の立体的推定を決定する上で重要なステップの数を記述する。我々は、任意の治療の効果を決定するために、これらのウイルスの正確な配信を重要視するSNpcにAAVを提供するために定位注射を使用することに留意すべきです。我...

パーキンソン病(PD)は、α-シヌクレイン(α-syn)を含むタンパク質凝集体の存在と、実質的なニグラパルス・パルス・スプカ(SNpc)におけるドーパミン作動性ニューロンの優等喪失を特徴とする一般的な神経変性運動障害である。ドーパミン作動性ニューロン数の定量化は、結合トリアティアル系の完全性の評価を可能にするため、PD研究の重要な部分であり、したがって、潜在的な疾患修飾療法の有効性を評価する重要なエンドポイントを提供する。現在、細胞数の定量化基準は、組織の2次元(2D)断面を利用して、3次元(3D)構造における容積物特徴を2、3、4に推定する非バイアス的な立体数計数である。現代の設計ベースのステレオロジー手法は、包括的なランダムサンプリング手順を採用し、潜在的なアーティファクトと系統的エラーを回避するためにカウントプロトコル(プローブと呼ばれる)を適用し、動物間変動5よりもわずかに大きい差の信頼性の高い検出を可能にする。ステテロロジーは生体組織学的研究のための強力な分析ツールを提供するが、それは時間のかかる、均一な標本の準備を前提とし、臨床前の翻訳調査にますます必要とされる効率に影響を与えることができるいくつかのステップで検証を必要とします。
デジタル科学の最近の技術進歩により、非偏型ステレロジーの代理としての必要性を満たしながら、実体顕微鏡なしで病理学のより効率的な評価のための新しいアプリケーションを採用することが可能になりました。これらの方法は、速度を向上させ、人為的ミスを減らし、立体技術6,7の再現性を向上させる。HALOは、デジタル病理における定量的組織分析用の画像解析プラットフォームの1つです。それはさまざまなモジュールで構成され、パターン認識アルゴリズムを使用して組織のセクション全体の細胞ごとに形態学的および多重化された発現データを報告する。細胞核FLモジュールは、核または細胞質中の蛍光マーカーの免疫蛍光陽性を測定する。これにより、各マーカーの正のセル数と、各セルの強度スコアを報告できます。このモジュールは、個々の細胞サイズおよび強度測定を提供するように適合することができるが、この特徴はドーパミン作動性ニューロンの定量化に必要ではない。
本研究の目的は、ニグラル神経変性8、9、10の以前に検証されたウイルスベクターベースのα-synラットモデルを用いてこの方法を検証することである。このモデルでは、ヒト変異体A53T α-synは、アデノ関連ウイルスハイブリッド血清型1/2(AAV1/2)の立体的注射によりSNpcで発現し、6週間にわたって有意な神経変性をもたらす。逆側未注入SNpcは、いくつかの研究において、注入された側の内部統制として役立つかもしれない。より一般的には、動物のコントロールコホートにおけるAAV-空ベクトル(AAV-EV)の注入は、陰性対照として使用される。自動画像解析ソフトウェアを使用して、注入されたSNpcに残っているドーパミン作動性ニューロンの密度を6週間後に推定するためのステップバイステップガイドを提示する(図1)。

<table><tbody><tr><td>A-Syn 抗体</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>32-8100</td><td></td></tr><tr><td>ABC Elite</td><td>Vector Labs</td><td>PK-6102</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 二次抗体</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 二次抗体</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-28180</td><td></td></tr><tr><td>アルカリホスファターゼ標識抗ウサギ igG</td><td>JacksonImmuno</td><td>111-055-144</td><td></td></tr><tr><td>ビオチン化抗マウスIgG</td><td>Vector Labs</td><td>BA-9200</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>DAKO 蛍光ミューティング培地</td><td>Agilent</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>HALO&trade;</td><td>Indica Labs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Histo-Clear II</td><td>Diamed</td><td>HS202</td><td></td></tr><tr><td>ImmPACT DAB ペルオキシダーゼ基質</td><td>Vector Labs</td><td>SK-4105</td><td></td></tr><tr><td>LSM880 共焦点顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NeuN 抗体</td><td>ミリポア</td><td>MAB377</td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat Serum</td><td>Vector Labs</td><td>S-1000-20</td><td></td></tr><tr><td>OCT</td><td>Tissue-Tek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>BioShop</td><td>PAR070.1</td><td></td></tr><tr><td>スライド式ミクロトーム</td><td>ライカ</td><td>SM2010 R</td><td></td></tr><tr><td>Stereo Investigator</td><td>MBF Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>BioShop</td><td>SUC700</td><td></td></tr><tr><td>TH 抗体</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P21962</td><td></td></tr><tr><td>VectaMount 封入剤</td><td>Vector Labs</td><td>H-5000</td><td></td></tr><tr><td>Vector Blue アルカリホスファターゼ基板</td><td>Vector Labs</td><td>SK-5300</td><td></td></tr><tr><td>Zen Black Software</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zen Blue Software</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

自動画像解析を用いたげっ歯類モデルのサブスタチングニグラにおけるドーパミン作動性ニューロン密度の半定量的決定

Semi-Quantitative Determination of Dopaminergic Neuron Density in the Substantia Nigra of Rodent Models using Automated Image Analysis

立体ニグラにおけるドーパミン作動性ニューロンの数の推定は、前臨床パーキンソン病研究における重要な方法である。現在、公平な立体的なカウントは、これらの細胞の定量化のための標準ですが、それは、すべてのプロジェクトのために実現可能ではないかもしれない、面倒で時間のかかるプロセスのままです。ここでは、あらかじめ定義された対象領域におけるラベル付き細胞の量を正確に推定できる画像解析プラットフォームの使用について説明する。我々は、ラット脳におけるこの分析方法のステップバイステップのプロトコルを説明し、実質的なニグラにおける変異型αシヌクレインの発現によるチロシンヒドロキシラーゼ陽性ニューロンの有意な減少を同定できることを実証する。我々は、この方法論を、公平なステレロジーによって得られた結果と比較することによって検証した。この方法を組み合わせると、ドーパミン作動性ニューロン数の変化を検出するための時間効率と正確なプロセスを提供し、したがって、細胞生存に対する介入の効果を効率的に決定するのに適している。

上記の方法をAAV注射の6週間後に採取した脳組織に適用することにより、ラット脳のSNpcにおけるAAV発現変異体A53T α-syn(AAV-A53T)の立体的注射は、コントロールとしての空のベクターAAV(AAV-EV)の注入と比較してドーパミン作動性ニューロンの密度の有意な減少を生じることを実証した(図5A、B)。AAV-EVを注射したラットのSNpcにおけるTH陽性ニューロン/mm2の平均数は276.2±34.7であり、AAV-A53Tを注射したラットのSNpcは41.2±17(P= 0.0003)であった。 SNpcにおけるドーパミン作動性ニューロン/mm2の数の定量化は、以前に公表されたレポート10,11と同様である。ここで説明する方法について、動物ごとに4つの逐次セクションを分析した。これまでの研究では、わずか3つのセクションで有意な違いが示されていますが...

ここでは、ラットの実質的なニグラ・パルス・コンパクでのドーパミン作動性ニューロン数の半定量的決定のための自動化された方法を提示する。

Estimation of the number of dopaminergic neurons in the substantia nigra is a key method in pre-clinical Parkinson's disease research. Currently, unbiased ...

実質的なニグラにおけるドーパミン作動性ニューロン数の推定は、パーキンソン病研究における重要な結果尺度である。このプロトコルは、ニューロン数の推定に必要な作業負荷を大幅に短縮します。この方法は、ドーパミン作動性ニューロン数の変化を検出するための時間効率の良い正確なプロセスを提供し、細胞生存に対する介入の影響を決定するのに適している。この方法は、従来のステレオロジー方法よりもコストと時間の利点を維持しながら、異なる脳領域のニューロンの正確なカウントを提供するために簡単に適応することができます。IHC画像をキャプチャするには、ソフトウェアを10倍倍で共焦点顕微鏡に結合します。ピンホールを1.5の面積単位に開き、合計1.5マイクロメートルの広い平面を捕獲し、脳の注入された側面に焦点を当てます。取得タブで、タイル スキャン イメージング オプションをオンにし、寸法を 10 ずつ 4 に設定します。取得モードパネルでは、タイルスキャン画像間のステッチマークを避けるために、ズームを1.1に設定します。フレームサイズを1024 x 1024ピクセルに設定し、平均を2に設定して、高品質の画像取得を確実にします。チャンネルパネルでは、Alexa 488にトラック1を設定し、Alexa 555に2をトラックします。ステージにスライドをロードし、強いTH染色のセクションを選択します。取得パネルでライブをクリックします。チャンネルパネルで、レーザー強度とゲインを信号を最大化し、バックグラウンドノイズを制限するレベルに設定します。範囲インジケータを使用して、シグナルが過度に露出しないようにします。複数のスライドでこの操作を繰り返します。取得タブで、ポジションボックスをオンにします。イメージングを開始するには、アイピースを使用し、正のTH染色を示す最初のセクションを選択します。次に、対象のポイントにフォーカスを設定し、ステージをセクションの中線に移動します。これにより、X、Y、Z 軸の位置が保存され、セクション全体をキャプチャするタイル スキャンがイメージ化されます。この手順は、挿入されていないサイトを含む他のすべてのスライドに対して繰り返します。適切なソフトウェアを使用して画像ファイルを分離し、それらを自動画像解析ソフトウェアにインポートします。ペン注釈ツールを選択して、実質的なニグラパースコンプッサの周りに注釈を描画することで、対象領域を定義します。[解析] タブに移動し、ドロップダウン分析メニューからリアルタイムチューニングを選択します。これにより、断面イメージ上に別のウィンドウが開き、解析パラメータをリアルタイムで変更できます。解析の倍率セクションで、適切な画像ズームを選択します。細胞検出部の下でTH染色に使用する色素として核染料を選択します。タイムチューニングウィンドウを注意深く見ながら、核コントラストの閾値、最小核強度、核セグメンテーションの攻撃性、核サイズの設定を調整します。このプロセスを複数のサンプルで繰り返します。適切な数の画像をサンプリングし、リアルタイムチューニングを調整したら、設定アクションドロップダウンメニューの分析設定を保存します。分析するすべての画像を選択し、分析をクリックします。保存した解析設定を選択し、解析ウィンドウの領域で[アノテーション レイヤー]ボックスをオンにして、レイヤー 1 をオンにして[解析]をクリックします。オブジェクト分析データをエクスポートするオプションを選択して、すべてのセクションのサマリー分析データをエクスポートします。このデータセットは、毒素または治療に応答して細胞サイズの変化を調べるために使用することができる。アデノ関連ウイルスまたはAAV注射の6週間後、ラット脳内の実質的なニグラに変異体A53T αシヌクレインを発現するAAVの定位注射はドーパミン作動性ニューロンの密度の有意な減少をもたらした。AAV-A35Tを注射したラットの実質的なニグラで2乗当たりのTH陽性ニューロンの数は、AAV空のベクターを注射したラットのそれと比較して有意に減少した。同様の観察は、公平なステレロジーを用いて行われた。このプロトコルを試みるとき、ソフトウェアは、それが訓練されているのと同じくらい有用であることを覚えておいてください。したがって、単一のセルが単一のセルとして識別されるように、時間と注意を払う必要があります。このソフトウェアは、α-シヌクレインなどの興味のある他のタンパク質の蛍光強度を測定し、治療がタンパク質レベルを調節できるかどうかを判断するように調整することができます。この技術は、ドーパミン作動性ニューロン密度に対する複数の潜在的な治療の効果をテストするときの効率を高くすることができました.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

ドーパミンは、はっきりとドーパミンニューロンの細胞体と樹状突起を含む脳核、で規制されています。ここでは黒質（SN）とげっ歯類では腹側被蓋野（VTA）の中​​脳核のドーパミン調節では、結果を最大化するために解剖し、サンプル処理のアプローチを説明し、その結果、結論と洞察力。...

黒質や腹側被蓋野のドーパミン規制の包括的なプロファイリング

出典: Olesen, M. V., et al.電気けいれん療法のラットモデルにおける細胞数を推定する光学分画器技術. J. Vis. Exp. (2017).

光分画器技術を用いたラット脳組織における新規生成ニューロンの定量化

このプロトコルは、成体マウスの適応行動と脳修復の根底にある環境誘発性の脳変化を研究するための、2つの異なる環境操作と同時脳注入プロトコルを説明しています。...

成体マウスにおける中脳ドーパミンニューロンの数の環境モジュレーション

シナプトソーム ドーパミンやドーパミン ・ トランスポーターの機能と線条体組織中ドパミンのレベルを評価することによりマウスにおけるドーパミン恒常性を調査するため高速液体クロマトグラフィー分析を表す実験ツールそれぞれ。ここでドーパミン組織量を測定、ドーパミン ・ トランスポーターの機能を評価するプロトコルを提案する.

高速液体クロマトグラフィー分析とシナプトソーム ドーパミンによるマウスにおけるドーパミン作動性恒常性の評価

この作品には、標準的な顕微鏡装置 (すなわち、光学顕微鏡 (x、y、z のモーターを備えられたオブジェクト テーブルを使用してマウス中脳ドーパミン作動性神経細胞数の公平な薬剤推定手順プロトコル平面)、およびデジタル画像解析のためのパブリック ドメイン...

光分留と標準的な顕微鏡装置を用いたマウス中脳のドーパミン作動性ニューロン数の薬剤の評価

側坐核ドーパミン D1-アルファ受容体の同定は、中枢神経系疾患の中に D1 受容体の機能不全を明らかにするため重要です。特定の脳領域の RNA 分子を可視化する交配アッセイの in situ新規 RNA...

検出技術その場で革新的な RNA 側坐齧歯動物の核内ドーパミン D1-アルファ受容体の同定

ここでは、一次マウスドーパミンニューロンにおけるニューロンα-シヌクレイン蓄積を研究するための詳細なプロトコルを提示する。リン酸化されたα-シヌクレイン凝集体は、ニューロン内で、あらかじめ形成されたα-シヌクレイン線維で誘導される。免疫蛍光標識細胞の自動イメージングと偏りのない画像解析により、この堅牢なプロトコルは、α-シヌクレイン蓄積を阻害する薬剤の中~高スループットスクリーニングに適しています。...

原発性胚マウス中脳ドーパミンニューロンにおける前形成線維誘導α-シヌクレイン蓄積の研究

このプロトコルは、黒質のニューロメラニン感受性磁気共鳴画像データを取得する方法を示しています。...

黒質のニューロメラニン感受性磁気共鳴イメージングのための標準化されたデータ取得

この研究は、パーキンソン病の前臨床モデルにおける神経炎症、神経変性、および運動障害を誘発するのに必要なベクター用量および曝露時間を解析する。ヒトα−シヌクレインをコードするこれらのベクターは、パーキンソン病に関連するシヌクレイン病理を再現するために黒質に送達される。...

ヒトα-シヌクレインをコードするアデノ随伴ウイルスベクターにより誘導されるパーキンソン病マウスモデルの解析

神経突起伸長アッセイは、再生ニューロンプロセスに関する定量的な値を提供します。この半自動ソフトウェアの利点は、マスクを作成することで細胞体と神経突起を別々にセグメント化し、神経突起の長さ、分岐点の数、細胞体クラスター面積、細胞クラスター数などのさまざまなパラメータを測定できることです。...

神経突起伸長測定のための新しい半自動ソフトウェアの標準化 

学ぶ 自動画像解析を用いたげっ歯類モデルのサブスタチアニグラにおけるドーパミン作動性ニューロン密度の半定量的決定法。従来のステレオロジーと比較して時間と労力を大幅に削減し、パーキンソン病研究における神経変性の評価を効率化します。

自動画像解析を用いたげっ歯類モデルのサブスタチングニグラにおけるドーパミン作動性ニューロン密度の半定量的決定

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