Name: 制限エンドヌクレアーゼ媒介性DNA切断の1分子滞留時間解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: 学ぶ制限エンドヌクレアーゼの1分子滞留時間解析法。量子ドット標識DNAと全反射蛍光顕微鏡を用いて、数百個の酵素の触媒サイクルを同時観測し、DNA切断メカニズムの解明に貢献します。

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この研究は、National Institute of General Medical SciencesからCMEへのAward Number K12GM074869によって支援されました。内容は著者の責任であり、必ずしも国立総合医科学研究所または国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。

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<li>Winkler, F. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+crystal-structure+of+Ecorv+endonuclease+and+of+Its+complexes+with+cognate+and+non-cognate+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">The crystal-structure of Ecorv endonuclease and of Its complexes with cognate and non-cognate DNA fragments.</a> EMBO Journal. 12 (5), 1781-1795 (1993).</li>
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</ol>

著者には、競合する金銭的利益やその他の利益相反はありません

このアッセイのDNA基質は、sulfo-SMCCを用いた2段階の反応スキームを用いて量子ドットで標識されています。この二官能性架橋剤は、第一級アミンと反応できるNHSエステル部分と、スルフヒドリル基と反応できるマレイミド部分で構成されています20。基質の調製に使用されるチオール化オリゴヌクレオチドは、酸化された形で出荷されます。カップリング手順を進める前に、説明したようにそれらを還元および精製することが重要であり、さもなければカップリング反応の効率が低下するであろう。使用直前に新鮮なDTTおよびスルホ-SMCC溶液を調製することが重要です。これらの分子は水溶液中で急速に加水分解します。透析装置に溶液を出し入れするときは注意してください-ピペットの先端がメンブレンに触れると破裂し、サンプルが失われます。サンプルの損失を避けるために、セクション2のすべてのステップを中断することなく完了することが理想的です。
量子ドット標識オリゴヌクレオチドの生成に使用されるカップリング反応は非効率的です。量子ドット標識オリゴヌクレオチドをビオチン化オリゴ...

制限エンドヌクレアーゼ(REase)は、DNAの配列特異的な二本鎖切断に影響を与える酵素です。1970年代のREasesの発見は、組換えDNA技術の開発につながり、現在では遺伝子組換えや遺伝子操作に欠かせない実験ツールとなっています1。II型REaseは、認識配列内または認識配列付近の固定位置でDNAを切断するため、このクラスで最も広く使用されている酵素です。しかし、タイプIIのREasesには大きなバリエーションがあり、進化的関係によって分類されるのではなく、特定の酵素特性に基づいていくつかのサブタイプに分類されます。各サブタイプの中には、分類スキームに例外が頻繁にあり、多くの酵素は複数のサブタイプ2に属しています。何千ものType II REaseが同定されており、そのうちの数百が市販されています。
しかし、Type II REasesの多様性にもかかわらず、詳細に研究されたREaseはほとんどありません。1975年にリチャード・ロバーツ卿によって設立された制限酵素データベースであるREBASEによると、これらの酵素のうち公開された動態データは20未満しか入手できません。さらに、一部のREaseは、その認識配列4,5,6,7に遭遇して結合する前にDNAに沿って拡散しながら、単一分子レベルで直接観察されていますが、その切断反応速度に関する単一分子の研究はほとんどありません。既存の研究は、単一の切断事象が発生する時間の変化を詳細に分析するための適切な統計を報告していないか8,9,10、または切断時間11の完全な分布を捕捉することができない。この種の解析により、比較的長寿命の運動学的中間体の存在が明らかになり、REaseを介したDNA切断のメカニズムの理解を深めることができる可能性があります。
単一分子レベルでは、生化学的プロセスは確率的であり、プロセスの単一のインスタンスが発生するまでの待ち時間τは変動します。ただし、τの多くの測定値は、発生しているプロセスの種類を示す確率分布p(τ)に従うことが期待できます。たとえば、酵素から生成物分子を放出するなどのシングルステッププロセスはポアソン統計に従い、p(τ)は負の指数分布の形を取ります。
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62112/62112eq1v3.png">
ここで、 β は平均待ち時間です。プロセスの速度 k は、平均待機時間の逆数である 1/β に等しくなることに注意してください。複数のステップを必要とするプロセスの場合、 p(τ) は、個々のステップごとに 1 つの指数分布の畳み込みになります。平均待ち時間が同一の N 個の単一指数関数減衰関数の畳み込み ( β) の一般的な解は、ガンマ確率分布です。
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62112/62112eq2v3.png">
ここで、Γ(N) はガンマ関数で、N-1 の階乗と N の非整数値への補間を表します。この一般的な解は、個々のステップの平均待ち時間が類似している場合の近似値として使用できますが、比較的速いステップの存在は、待ち時間が大幅に長いステップによって隠されることを理解する必要があります。つまり、N の値はステップ12 の数の下限を表します。待機時間測定の数が適切であれば、イベントをビン化してガンマ分布を結果のヒストグラムに適合させるか、最尤推定アプローチを使用して、パラメーター β と N を推定できます。したがって、このタイプの分析は、アンサンブルアッセイでは容易に解決できず、パラメータを正確に推定するために多数の観察を必要とする速度論的ステップの存在を明らかにすることができる12,13。
この論文では、量子ドット標識DNAと全反射蛍光(TIRF)顕微鏡を使用して、REaseを介した数百の個々のDNA切断イベントを並行して観察する方法について説明します。このアッセイの設計により、複数の実験結果をプールすることが可能になり、数千のイベントを含む滞留時間分布を作成することができます。量子ドットの高い光安定性と輝度により、実験開始から数分後でも発生する切断イベントを観察する能力を犠牲にすることなく、10Hzの時間分解能が可能になります。優れた時間分解能と広いダイナミックレンジ、および大規模なデータセットを収集する能力を組み合わせることで、滞留時間分布の正確な特性評価が可能になり、ターンオーバー率が1分-1 の範囲にあるREaseの切断経路に複数の運動学的ステップが存在することが明らかになります。EcoRVの場合、3つの速度論的ステップを解決でき、そのすべてが他の手段によって特定されており、アッセイがそのようなステップの存在に対して敏感であることが確認されています。
目的の認識配列を含む二本鎖DNA基質は、ビオチン化オリゴヌクレオチドを、共有結合した単一の半導体ナノ結晶量子ドットで標識された相補鎖にアニーリングすることによって生成されます。これらの基板は、ガラスカバーガラスの上に構築された流路に導入され、その表面に高分子量ポリエチレングリコール(PEG)分子が共有結合して芝生に付着しています。DNA基質は、ビオチン-ストレプトアビジン-ビオチン結合を介して、自由末端にビオチンを持つPEG分子の一部によって捕捉されます。TIRF顕微鏡では、ガラスと液体の界面からの距離とともに指数関数的に減衰するエバネッセント波が照明を提供します。透過深度は、使用する光の波長のオーダーです。これらの条件下では、機能化されたガラス表面に捕捉されたDNA分子によって表面につながれた量子ドットのみが励起されます。溶液中で遊離している量子ドットは、照らされた領域内に制約されないため、発光しません。量子ドットを表面につなぎとめているDNAが切断されると、その量子ドットは表面から自由に拡散し、蛍光画像から消えます。
多くのII型REaseはマグネシウムの非存在下でDNAに結合することが知られているが14、すべてのREaseはDNA切断を媒介するためにマグネシウムを必要とする15。これらのREaseは、マグネシウムの非存在下で表面に固定化されたDNAに結合することができます。マグネシウム含有バッファーをDNAにプレバインディングしたREaseのチャネルに流すと、量子ドットの消失が示すように、すぐに切断が始まります。REase分子を事前に結合し、マグネシウムを導入してDNA切断を開始することで同期化を達成することで、実験で観察された酵素集団の各分子について、DNA切断が完了するまでのタイムラグを独立して測定することができます。フルオレセインは、マグネシウムが視野に到着することを示すために、マグネシウム含有緩衝液にトレーサー色素として含まれています。マグネシウム含有バッファーには酵素が含まれていないため、マグネシウム含有バッファーの到着から各量子ドットが消失するまでのタイムラグは、DNAにすでに結合しているREaseがDNAを切断し、ガラス表面から量子ドットを放出するのにかかる時間を示しています。量子ドットの消失は迅速に起こり、強度の軌跡が急激に減少するため、特定のDNA分子が切断される時間を明確に示します。イベント時間の決定は、強度軌道の数学的分析によって行われ、一般的な実験では、何百もの識別可能な切断イベントが得られます。複数の実験の結果をプールして、非線形最小二乗分析または最尤分析によってパラメーター N と β を推定できる適切な統計を提供できます。

<table><tbody><tr><td>3-アミノプロピルトリエトキシシラン(APTS)</td><td>シグマAldrich</td><td>440140-100ML</td><td>乾燥器ボックス5</td></tr><tr><td>分エポキシ</td><td>Devcon</td><td>20845</td><td>のマイクロ流体デバイスのシールのための使用</td></tr>アセ<tr><td>トン</td><td>Pharmco</td><td>329000ACS</td><td>は、カバースリップ</td></tr><tr><td>バス超音波処理器</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>CPXHモデル2800</td><td>カタログ番号15-337-410</td></tr><tr><td>をシールするための使用ビーカー、ガラス、100mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>卓上遠心分離機</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ビオチン-PEG-吉草酸エスクリンイミジル(MW 5,000)</td><td>Laysan Bio</td><td>BIO-SVA-5K</td><td>吉草酸エスクリンイミジルは、炭酸スクシンイミジル</td></tr>ビ<tr><td>オチン化オリゴヌクレオチド</td>よりも半減期が長い <td>Integrated DNA Technologies</td><td>カスタム - 設計上の考慮事項については、プロトコルを参照してください</td><td>リクエスト5 'ビオチン修飾とHPLC精製</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン(BSA)</td><td>VWR</td><td>0903-5G</td><td>は、10 mg / mL溶液(aq)を調製し、95°Cに加熱します。</td></tr><tr><td>Centri-Spin-10 Size Exclusion Spin Columns</td><td>Princeton Separations</td><td>CS-100 または CS-101</td> を使用して、<td>ジスルフィド結合を還元した後にチオール化オリゴヌクレオチドを精製</td></tr><tr><td>遠心分離チューブ 1.5. mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>カバースリップ、1 インチ角ガラス</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>カバースリップホルダー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ダイヤモンドポイントホイール</td><td>ドレメル</td><td>7134</td><td>石英フローセルトッパー</td></tr><tr><td>ジチオスレイトール (DTT)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>A39255</td><td>無重量フォーマット、7.7 mg/バイアル</td></tr><tr><td>ドリルプレス回転工具ワークステーションスタンド</td><td>ドレメル</td><td>220-01</td><td>は、石英掘削</td></tr><tr><td>を容易にします EcoRV (REase はサンプルデータの生成に使用されます)</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>R0195T または R0195M</td><td>100,000単位/ mLのストックを使用して、過剰なグリセロールの追加を避けるため、他のREasesエタノールの供給者のためのREBASEを確認してください</td></tr><tr><td></td><td>変</td><td></td><td>性または95%は許容され、カバースリップのクリーニングに使用</td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸(EDTA)</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>EDS</td><td>BioUltra、無水、乾燥器ボックスに保存</td></tr><tr><td>ノミマイクロスピンバー</td><td>フィッシャーブランド</td><td>14-513-65</td><td>カバースリップラックの下に収まる3 mm x 10 mmサイズ</td></tr><tr><td>フルオレセイン</td><td>Acros Organics</td><td>17324</td><td>実験バッファーを作るために使用</td></tr><tr><td>重力対流オーブン</td><td>バインダー</td><td>9010-0131</td><td></td></tr><tr><td>ハンドヘルドロータリーマルチツール</td><td>ドレメル</td><td>8220</td><td>石英フローセルトッパーの穴あけに使用</td></tr><tr><td>ImagEM X2 EM-CCD カメラ</td><td>浜松</td><td>C9100-23B</td><td>この実験には空冷が適しており、HCImageソフトウェアなどを使用して、</td></tr><tr><td>イメージングスペーサー、両面、接着</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ジャー、スクリューキャップ付きガラス、(直径約50mm×高さ50mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム六水和物</td>フィ<td>ッシャーバイオ試薬</td><td>BP214-500</td><td>を使用して、マグネシウム</td></tr><tr><td>MATLABソフトウェア</td><td></td><td>で実験用バッファーを作成します</td><td>データ分析</td></tr>金属<tr><td>ピンセット</td><td>フィッシャーブランド</td><td>16-100-110</td><td></td></tr><tr><td>メトキシ-PEG-吉草酸エスクシンイミジル (MW 5,000)</td><td>Laysan Bio</td><td>M-SVA-5K</td><td>両方のPEGは、反応速度が一貫しているように同じNHSエステルを持つ必要があります</td></tr><tr><td>微量遠心分離</td>機 <td>エッペンドルフ</td><td>5424</td><td></td></tr>マルチ<tr><td>ポジションマグネチックスターラーVWR</td><td></td><td>12621-022</td><td></td></tr><tr><td>N-シクロヘキシル-2-アミノエタンスルホン酸(CHES)</td><td>Acros Organics</td><td>AC20818</td><td>CAS 103-47-9、</td></tr><tr><td>微量遠心チューブ用のCHESバッファーオービタルシェーカーおよびヒーター</td>の製造に使用 <td>Q Instruments</td><td>1808-0506</td>、<td>24 x 2.0 mLまたは15 x 0.5 mLチューブ用の1808-1061アダプター付き</td></tr> パラ<tr><td>フィルム</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE60ポリエチレンチューブ(内径0.76 mm、外径1.22 mm)</td><td>Intramedic</td><td>6258917</td><td>22 Gの鈍い針は、このチューブサイズに適しています</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水(PBS) 10x</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7059</td><td>1倍の強度で使用</td></tr><tr><td>水酸化カリウム</td><td>VWRケミカルズ BDH</td><td>BDH9262</td><td>1M溶液を使用してカバースリップを洗浄します</td></tr><tr><td>Qdot 655 ITK アミノ (PEG) 量子ドット</td><td>Invitrogen</td><td>Q21521MP</td><td></td></tr><tr><td>クォーツスライド、1インチ四方、厚さ1mm</td>の<td>電子顕微鏡科学</td><td>72250-10</td>穴<td>は、入口と出口のチューブ挿入強化プラスチックピンセットのコーナーにドリルで開ける必要があります</td></tr><tr><td></td><td>Rubis</td><td>K35a</td><td>は、カバースリップの取り扱いとマイクロ流体デバイスの構築に使用します</td></tr><tr><td>SecureSeal接着シート</td><td>Grace Biolabs</td><td>SA-S-1L</td>は、<td>マイクロ流体デバイス用のスペーサーを形成するためにカット</td></tr>されます <tr><td>マイクロ流体用シングルチャネルシリンジポンプ</td><td>新時代のポンプシステム</td><td>NE-1002X-US</td> には <td>50 mL シリンジと 22 G の鈍針</td></tr>が取り付けられています <tr><td>Slide-a-Lyzer MINI 透析装置、10 kDa MWCO、0.1 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>69570 または 69572</td> は、DNA 重炭酸ナトリウム EMD Millipore SX0320 <td>への量子ドット結合時のバッファー交換に使用されます</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>。表面官能基化用のバッファーを作製するために使用、100 mM、pH 8</td></tr><tr><td>塩化</td>ナトリウム <td>Macron</td><td>7581-12</td><td>実験緩衝液リン酸</td></tr><tr><td>ナトリウム二塩基性溶液(BioUltra、水中0.5M)</td><td>シグマAldrich</td><td>94046</td><td>は、100 mMリン酸ナトリウム緩衝液</td></tr>リン酸<tr><td>ナトリウム一塩基性溶液(BioUltra、水中5M)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>74092</td><td>100 mMリン酸ナトリウム緩衝液</td></tr><tr><td>StreptavidinのpHを調整するために使用します<>Streptomyces avidinii</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S4762</td><td>1 mg/mL で溶解し、25 mL aliqouts を -20 ?</td></tr><tr><td>スルホスクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート(スルホ-SMCC)</td><td>Thermo Scientific</td><td>A39268</td><td>No-Weigh Format、2 mg/バイアル</td></tr><tr><td>シリンジ、鈍い 21 G ニードル</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>シリンジポンプ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>チオレートオリゴヌクレオチド</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>カスタム - 設計上の考慮事項</td><td>についてはプロトコルを参照してくださいリクエスト5 'チオール修飾子C6 S-SおよびHPLC精製</td></tr><tr><td>TIRFイメージングシステム、488 nmレーザー照明、</td><td>さまざまな</td><td></td><td>カスタムビルド</td></tr><tr><td>のTris-HCl</td><td>研究製品インターナショナル</td><td>T60050</td><td>を使用して実験バッファーを作成</td></tr><tr><td>Trisベース</td><td>JTベイ</td><td>カー4101</td><td>を使用して実験</td>バッファーTween-20</tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>P7949</td>を使用して<td>ブロッキングを行いますバッファー</td></tr><tr><td>超純水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ボルテックス</td><td>ミキサーVWR</td><td>10153-842</td><td></td></tr><tr><td>Wash-N-Dry Coverslip Rack</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70366-16</td><td>カバースリップの表面機能化に使用されます</td></tr></tbody></table>

制限エンドヌクレアーゼ媒介性dna切断の1分子滞留時間解析

Single-Molecule Dwell-Time Analysis of Restriction Endonuclease-Mediated DNA Cleavage

この新しい全反射蛍光顕微鏡ベースのアッセイは、1回の実験で数百の個々の制限エンドヌクレアーゼ(REase)分子の触媒サイクルの長さを同時に測定することを容易にします。このアッセイはタンパク質の標識を必要とせず、単一のイメージングチャネルで実施できます。さらに、複数の個別の実験の結果をプールして、十分に入力された滞留時間分布を生成できます。その結果得られた滞留時間分布を解析することで、直接観察できない速度論的ステップの存在を明らかにすることで、DNA切断メカニズムの解明に役立てることができます。このアッセイとよく研究されているREaseを用いて収集されたデータの例、EcoRV(回文配列GAT↓ATC(↓は切断部位)を切断する二量体IIP型制限エンドヌクレアーゼ)は、先行研究と一致しています。これらの結果は、EcoRVがDNAに結合した後にマグネシウムを導入することによって開始されるDNA切断への経路には少なくとも3つのステップがあり、各ステップで平均0.17 s-1 の割合があることを示唆しています。

フローセルは、レーザー照明を備えた倒立顕微鏡の高開口油浸倍率60倍対物レンズに直接結合され、対物レンズTIRFイメージングを実現します(図5A)。DNA基質を導入し、余分なDNAと量子ドットを洗い流した後、通常、視野内には数千の個々の量子ドットがあります(図5B)。これらの量子ドットはガラス表面に安定して付着しており、実験の時間スケールで目立った減光や大幅な漂白を受けることはありません。しかし、マグネシウムと適切なREaseの両方を含むバッファーを流路に流すと、通常の4分間の観察時間の終わりには、実験開始時に存在していた量子ドットの少なくとも30%が視野から消えていることになります。マグネシウムの必要量を確認すると、マグネシウムが存在しない状態でREaseをチャネルに流すと、実験開始時に存在していた量子ドットの少なくとも95%が観察期間の終了時にも確認できる(図5C)。しかし、マグネシウム非存在下でREaseが表面結合DNAに結合した直後にマグネシウム含有バッ...

量子ドット標識DNAと全反射蛍光顕微鏡を用いて、非標識タンパク質を用いた制限エンドヌクレアーゼの反応機構を調べることができます。この単一分子技術により、個々のタンパク質-DNA相互作用の大規模な多重化観察が可能になり、データをプールして、十分に蓄積された滞留時間分布を生成できます。

制限エンドヌクレアーゼ媒介性DNA切断の1分子滞留時間解析

This novel total internal reflection fluorescence microscopy-based assay facilitates the simultaneous measurement of the length of the catalytic cycle for ...

このプロトコールでは、制限エンドヌクレアーゼによる部位特異的なDNA切断を1分子レベルで直接観察することができます。私たちのマルチプレックスアプローチにより、何百もの個々のREaseが触媒サイクルを完了するのにかかる時間を測定することができます。マルチプレックス化により、切断までの十分な滞留時間を生成することができ、それをガンマ確率分布に適合させてDNA切断のメカニズムに関する洞察を得ることができます。まず、50 μLのオリゴヌクレオチドと50 μLの新たに調製したDTT溶液で各チューブに再懸濁したオリゴヌクレオチド用の新しいチューブを調製し、ピペットで上下に動かして混合し、室温で30分間インキュベートします。各サンプル混合物の全容量を調製したカラムに静かにピペットで移動し、750Gで2分間遠心分離します。遠心分離後、すぐに使用しないサンプルは、チオール基の酸化やジスルフィド結合の形成を防ぐために、摂氏20度で保存してください。50マイクロリットルの量子ドットストックの1アリコートを、作るコンストラクトごとに透析装置にピペットで入れ、ピペットの先端でメンブレンに触れないように注意してください。サンプル量の少なくとも1, 000倍であるCHES緩衝液の量に対して、100RPMで15分間攪拌して透析します。ピペッターを使用して、懸濁した量子ドットを透析装置から慎重に取り出し、等量の新しく調製したSulfo-SMCC溶液を含む新しいチューブに移し、ピペッティングで上下に動かして混合します。1, 000 RPMで振とうしながら室温で1時間インキュベートし、Sulfo-SMCCが量子ドット上の第一級アミンと反応できるようにします。次に、ピペッターを使用して、各サンプルを新鮮な透析装置に慎重に移します。過剰なスルホ-SMCCを除去するには、透析装置に含まれる容量の少なくとも1, 000倍のCHES緩衝液に対して、15分間攪拌しながら透析します。バッファーを2回交換し、新しいCHESバッファーで合計3回透析を行い、各バッファー交換後15分間透析を進行させます。その後、PBSで透析を繰り返します。ピペッターを使用して、透析装置から量子ドットを含む溶液を慎重に回収し、各サンプルをPBSで希釈した等モル量の拡張オリゴヌクレオチドを含む新しいチューブに移します。1, 000 RPMで振とうしながら室温で2時間インキュベートします。各サンプルにBSAを添加して、最終濃度を0.5ミリグラム/ミリリットルにします。次に、ピペッターを使用して各サンプルを新しい透析装置に慎重に移し、保存バッファーに対して透析します。透析後、各サンプルを慎重に回収し、新しいチューブに入れます。サンプルは摂氏4度で保存します。量子ドット標識オリゴヌクレオチドのサンプルを、10倍モル過剰のビオチン化オリゴヌクレオチドと組み合わせます。ヒートブロック内の混合物を摂氏75度に加熱し、その温度で5分間保持します。次に、ヒートブロックをオフにし、混合物をゆっくりと冷まします。完成したコンストラクトを摂氏4度で保管します テーパーダイヤモンドポイントホイールビットが取り付けられたハンドヘルドロータリーマルチツールを使用して、クォーツスライドの反対側のコーナーに2つの穴を開けて、入口と出口として機能します。スライドを所定の位置に固定し、ビットに注油し、穴を開けながら常に水でスライドしてください。各実験の後、使用したデバイスをアセトンに浸して接着剤とエポキシを溶解することにより、準備した石英スライドを回収します。残りのコンポーネントは廃棄します。25マイクロリットルのストレプトアビジン溶液を80マイクロリットルのPBSおよび20マイクロリットルのブロッキングバッファーと組み合わせます。PEG処理したカバースリップにこの混合物をコーティングし、湿度の高い環境で30分間インキュベートします。カバースリップのインキュベーション中に、イメージングスペーサーを準備して流路を作成します。1インチ四方のイメージングスペーサー材料をカットし、クォーツスライドに開けられた穴の端に位置合わせして幅2ミリメートルのチャネルに印を付けます。メスでスペーサー素材からチャネルを切り取ります。クォーツスライドをアセトンで完全に洗浄し、以前の実験で残った接着剤を取り除きます。イメージスペーサーの裏地の片側をはがし、入口と出口の穴を覆わないように注意しながら、クォーツスライドに慎重に置きます。カバースリップを水で洗い、圧縮空気で乾かします。イメージングスペーサーから裏地の反対側を取り外し、プラスチックピンセットを使用してクォーツスライドと官能基性ストレプトアビジンコーティングカバースリップの間に挟み込み、アセンブリを一緒に押し付けて接着剤から気泡を取り除きます。チューブの端を斜めに切断して、溶液が自由に流れるようにします。次に、長さ30センチメートルのポリエチレンチューブをクォーツスライドの各穴に挿入します。チューブをチューブラックで所定の位置に保持し、エポキシを使用してチューブを所定の位置にシールし、組み立てたデバイスの端をシールします。エポキシ樹脂をセットしたら、空のシリンジに鈍い針をデバイスの出口チューブに挿入し、入口チューブの端をブロッキングバッファーで満たされた容器に浸します。.シリンジプランジャーを引き戻して、デバイスにブロッキングバッファーを充填します。その後、使用前に少なくとも30分間デバイスをインキュベートします。マイクロ流体デバイスを顕微鏡ステージプレートにテープで取り付けます。対物レンズをデバイスの底部に接触させ、視野がマイクロ流体チャネル内に収まるように対物レンズを配置します。アウトレットチューブをシリンジポンプに接続した後、シリンジプランジャーを引き戻して、マイクロ流体チャネルを新しいブロッキングバッファーで洗い流します。チューブやチャネルに気泡が溜まっていないことを確認してください。調製したDNA基質1マイクロリットルを1ミリリットルのブロッキングバッファーに希釈します。インレットチューブを希釈したDNA基質に入れ、800マイクロリットルの基質溶液をチャネルに毎分200マイクロリットルの速度で流します。DNA溶液をチャネル内でインキュベートし、流れが止まった後15分間待ちます。インキュベーション後、少なくとも800マイクロリットルのブロッキングバッファーを毎分200マイクロリットルの速度でチャネルに流し、結合していないDNAをチャネルから洗い流します。表面につながれた量子ドットがはっきりと見えるように顕微鏡の焦点を調整します。マイクロ流体デバイスをマグネシウムを含まない800マイクロリットルの実験用バッファーで毎分200マイクロリットルの流量で洗い流します。マグネシウムを含まない実験用バッファーのアリコートにREaseを加え、ピペッティングで穏やかに混合します。EcoRVのミリリットルあたり400ユニットの800マイクロリットルを毎分200マイクロリットルの流量でチャネルに流します。マグネシウムとフルオレセインを含む実験用緩衝液を毎分200マイクロリットルの流量で流すことから実験を開始します。シリンジポンプを始動した直後にデータのキャプチャを開始します。800マイクロリットルのバッファーを流した後、データ取得を停止します。DNA基質をフローセルに導入し、余分なDNAと量子ドットを洗い流した後、通常、視野内には数千の個々の量子ドットがあります。それらはガラス表面に安定して取り付けられており、実験全体を通して目立った調光や大幅な漂白を受けません。マグネシウムが存在しない状態でREaseがチャネルを流れた場合、実験の開始時に存在していた量子ドットの少なくとも95%は、観測期間の終了時にも見ることができます。しかし、REaseの直後にマグネシウム含有バッファーを流すと、REaseとマグネシウムを一緒にチャネルに流した場合と同様に、観測期間の終わりまでに最大で量子ドットが消失します。量子ドットの消失は迅速に起こり、強度の軌跡が急激に減少するため、特定のDNA分子が切断される時間を明確に示します。この実験は、よく研究されているタイプII P REase EcoRVで行われました。非線形最小二乗曲線フィッティングと最尤パラメータ推定の両方を使用して、データからnとbetaの値を抽出しました。2つのパラメータ推定方法は一致していました。非線形最小二乗近似を使用すると、n は 3.52 秒、ベータは 5.78 秒でした。最尤推定を使用すると、n は 3.41 秒、ベータは 6.06 秒でした。このアッセイは、切断経路に沿った中間ステップの存在の証拠を提供することができます。変化する反応条件下でこのアッセイを実施することで、直接観察できない反応中間体の性質を確立するのに役立ちます。

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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制限エンドヌクレアーゼ媒介性DNA切断の1分子滞留時間解析

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