Name: 蛍光タグ付きサルコメアタンパク質を用いた多能性幹細胞由来心筋細胞のサルコメア短縮 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: 学ぶ蛍光タグ付きサルコメアタンパク質を用いた多能性幹細胞由来心筋細胞のサルコメア短縮評価法。AAV導入により患者由来iPS細胞への応用が可能で、心筋症治療開発に貢献する。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jichi医科大学再生医療部門のラボメンバーの皆さん、有益な議論と技術支援を受けたい。本研究は、日本医療研究開発機構(AMED)の助成金により支援されました。日本学術振興会(JSPS;日本循環学会(基礎研究助成)をH.U.に

<ol><li>Mensah, G. A., Roth, G. A., Fuster, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Global+Burden+of+Cardiovascular+Diseases+and+Risk+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">The Global Burden of Cardiovascular Diseases and Risk Factors.</a> Journal of the American College of Cardiology. 74 (20), 2529-2532 (2019).</li>
<li>Wexler, R. K., Elton, T., Pleister, A., Feldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyopathy%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22American+Family+Physician%22%5BJournal%5D)">Cardiomyopathy: an overview.</a> American Family Physician. 79 (9), 778-784 (2009).</li>
<li>Parrotta, E. I., Lucchino, V., Scaramuzzino, L., Scalise, S., Cuda, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Cardiac+Disease+Mechanisms+Using+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes%3A+Progress%2C+Promises+and+Challenges%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Modeling Cardiac Disease Mechanisms Using Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes: Progress, Promises and Challenges.</a> International Journal of Molecular Sciences. , 30(2020).</li>
<li>Carvajal-Vergara, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell-derived+models+of+LEOPARD+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome.</a> Nature. 465 (7299), 808-812 (2010).</li>
<li>Lan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+calcium+handling+properties+underlie+familial+hypertrophic+cardiomyopathy+pathology+in+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).</li>
<li>Kim, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+arrhythmogenic+right+ventricular+dysplasia+with+patient-specific+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs.</a> Nature. 494 (7435), 105-110 (2013).</li>
<li>Gramlich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antisense-mediated+exon+skipping%3A+a+therapeutic+strategy+for+titin-based+dilated+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Antisense-mediated exon skipping: a therapeutic strategy for titin-based dilated cardiomyopathy.</a> EMBO Molecular Medicine. 7 (5), 562-576 (2015).</li>
<li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+the+mitochondrial+cardiomyopathy+of+Barth+syndrome+with+induced+pluripotent+stem+cell+and+heart-on-chip+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Modeling the mitochondrial cardiomyopathy of Barth syndrome with induced pluripotent stem cell and heart-on-chip technologies.</a> Nature Medicine. 20 (6), 616-623 (2014).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Dysfunctions+Contribute+to+Hypertrophic+Cardiomyopathy+in+Patient+iPSC-Derived+Cardiomyocytes+with+MT-RNR2+Mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Dysfunctions Contribute to Hypertrophic Cardiomyopathy in Patient iPSC-Derived Cardiomyocytes with MT-RNR2 Mutation.</a> Stem Cell Reports. 10 (3), 808-821 (2018).</li>
<li>Cho, G. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+Transplantation+Confers+Maturation+of+PSC-Derived+Cardiomyocytes+Conducive+to+Modeling+Cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Neonatal Transplantation Confers Maturation of PSC-Derived Cardiomyocytes Conducive to Modeling Cardiomyopathy.</a> Cell Reports. 18 (2), 571-582 (2017).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tri-iodo-l-thyronine+promotes+the+maturation+of+human+cardiomyocytes-derived+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Tri-iodo-l-thyronine promotes the maturation of human cardiomyocytes-derived from induced pluripotent stem cells.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 72, 296-304 (2014).</li>
<li>Ribeiro, A. J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-Imaging+Method+to+Assay+the+Contractile+Mechanical+Output+of+Micropatterned+Human+iPSC-Derived+Cardiac+Myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Multi-Imaging Method to Assay the Contractile Mechanical Output of Micropatterned Human iPSC-Derived Cardiac Myocytes.</a> Circulation Research. 120 (10), 1572-1583 (2017).</li>
<li>Sewanan, L. R., Campbell, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+sarcomeric+cardiomyopathies+with+human+cardiomyocytes+derived+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Modelling sarcomeric cardiomyopathies with human cardiomyocytes derived from induced pluripotent stem cells.</a> The Journal of Physiology. 598 (14), 2909-2922 (2020).</li>
<li>Kopljar, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+drug-induced+effects+on+contractile+motion+properties+and+cardiac+biomarkers+in+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Chronic drug-induced effects on contractile motion properties and cardiac biomarkers in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> British Journal of Pharmacology. 174 (21), 3766-3779 (2017).</li>
<li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifeact%3A+a+versatile+marker+to+visualize+F-actin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin.</a> Nature Methods. 5 (7), 605-607 (2008).</li>
<li>Ribeiro, A. J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractility+of+single+cardiomyocytes+differentiated+from+pluripotent+stem+cells+depends+on+physiological+shape+and+substrate+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Contractility of single cardiomyocytes differentiated from pluripotent stem cells depends on physiological shape and substrate stiffness.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (41), 12705-12710 (2015).</li>
<li>Roberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+Gene+Tagging+of+Transcriptionally+Silent+Genes+in+hiPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Fluorescent Gene Tagging of Transcriptionally Silent Genes in hiPSCs.</a> Stem Cell Reports. 12 (5), 1145-1158 (2019).</li>
<li>Chanthra, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Fluorescent+Reporter+System+Identifies+Laminin-511%2F521+as+Potent+Regulators+of+Cardiomyocyte+Maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A Novel Fluorescent Reporter System Identifies Laminin-511/521 as Potent Regulators of Cardiomyocyte Maturation.</a> Scientific Reports. 10 (1), 4249(2020).</li>
<li>Ribeiro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cardiomyocyte+show+of+force%3A+A+fluorescent+alpha-actinin+reporter+line+sheds+light+on+human+cardiomyocyte+contractility+versus+substrate+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">A cardiomyocyte show of force: A fluorescent alpha-actinin reporter line sheds light on human cardiomyocyte contractility versus substrate stiffness.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 141, 54-64 (2020).</li>
<li>Yamanaka, S., Zahanich, I., Wersto, R. P., Boheler, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Proliferation+of+Monolayer+Cultures+of+Embryonic+Stem+%28ES%29+Cell-Derived+Cardiomyocytes+Following+Acute+Loss+of+Retinoblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Enhanced Proliferation of Monolayer Cultures of Embryonic Stem (ES) Cell-Derived Cardiomyocytes Following Acute Loss of Retinoblastoma.</a> PLoS ONE. 3 (12), 3896(2008).</li>
<li>Miyazaki, T., Isobe, T., Nakatsuji, N., Suemori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Adhesion+Culture+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells+Using+Laminin+Fragments+in+an+Uncoated+Manner%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Efficient Adhesion Culture of Human Pluripotent Stem Cells Using Laminin Fragments in an Uncoated Manner.</a> Scientific Reports. 7 (1), 41165(2017).</li>
<li>Prasad, K. -M. R., Xu, Y., Yang, Z., Acton, S. T., French, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+cardiomyocyte-specific+gene+expression+following+systemic+injection+of+AAV%3A+in+vivo+gene+delivery+follows+a+Poisson+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Robust cardiomyocyte-specific gene expression following systemic injection of AAV: in vivo gene delivery follows a Poisson distribution.</a> Gene Therapy. 18 (1), 43-52 (2011).</li>
<li>Arakawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+evolution+by+hypermutation+and+selection+in+the+B+cell+line+DT40%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Protein evolution by hypermutation and selection in the B cell line DT40.</a> Nucleic Acids Research. 36 (1), e1(2007).</li>
<li>Konno, A., Hirai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+whole+brain+transduction+by+systemic+infusion+of+minimally+purified+AAV-PHP.eB%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Efficient whole brain transduction by systemic infusion of minimally purified AAV-PHP.eB.</a> Journal of Neuroscience Methods. 346, 108914(2020).</li>
<li>Anzai, T., et al. Generation of Efficient Knock-in Mouse and Human Pluripotent Stem Cells Using CRISPR-Cas9. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAnzai%2C+T+%22Methods+of+Molecular+Biology%22">Methods of Molecular Biology</a>. Yoshida, Y., et al. , (2020).</li>
<li>Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Brief+Review+of+Current+Maturation+Methods+for+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells-Derived+Cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">A Brief Review of Current Maturation Methods for Human Induced Pluripotent Stem Cells-Derived Cardiomyocytes.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178(2020).</li>
<li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell+models+for+long-QT+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome.</a> The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).</li>
<li>Flores, L. R., Keeling, M. C., Zhang, X., Sliogeryte, K., Gavara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifeact-GFP+alters+F-actin+organization%2C+cellular+morphology+and+biophysical+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Lifeact-GFP alters F-actin organization, cellular morphology and biophysical behaviour.</a> Scientific Reports. 9 (1), 3241(2019).</li>
<li>Sparrow, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+Myofilament-Localized+Calcium+Dynamics+in+Adult+Cardiomyocytes+and+the+Effect+of+Hypertrophic+Cardiomyopathy+Mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Measurement of Myofilament-Localized Calcium Dynamics in Adult Cardiomyocytes and the Effect of Hypertrophic Cardiomyopathy Mutations.</a> Circulation Research. 124 (8), 1228-1239 (2019).</li>
</ol>

H.U.はこの原稿に関する特許を出願しています。

PSC-CMは、心臓病をモデル化し、薬物の効果をテストするためのインビトロプラットフォームとして利用される大きな可能性を秘めています。ただし、PSC-CM 関数を評価する正確で統一された方法を最初に確立する必要があります。機能検査の大部分はPSC-CMで働き、例えば、電気生理学、カルシウム過渡性、および代謝26、および最初の患者由来のPSC-CM試験の1つは、長いQT症候群27についてであった。しかし、心筋細胞の最も重要な機能の1つである収縮性は、まだ評価が困難である。成体心筋細胞では、サルコメアの短縮が広く使用されています。対照的に、PSC-CMの未発達で組織化されていないサルコメアのために、サルコメア短縮のための標準的な方法はこれらの細胞では機能しません。そこで、蛍光性サルコメアタンパク質を用いたPSC-CMのサルコメア短縮を調べる代替方法を発表しました。実証されているように、蛍光タンパク質と融合したMライン(MYOM2)またはZ線(ACTN2、TCAP、およびPDLIM3)に局在するタンパク質を使用することができます。...

心血管疾患は、世界的に死亡率の主な原因である1と心筋症は、心臓関連死の第三の原因を表す2.心筋症は、心臓の筋肉に影響を与える疾患の集合群です。近年のiPS細胞の誘導多能性幹細胞の開発と、iPS細胞の心筋細胞(PSC-CM)に向けた指向分化が開かれて、心筋症のインビトロモデルとして患者ゲノムを用いた心筋細胞を研究する扉が開かれています。これらの細胞は、心疾患の病態生理を理解し、その分子機構を解明し、異なる治療候補3を試験するために使用することができる。多大な関心があり、したがって、患者由来のiPS細胞が生成されている(例えば、肥大性心筋症[HCM]4、5、不整脈性右心室心筋症[ARVC]6、拡張型心筋症[DCM]7、およびミトコンドリア関連心筋症8、9)。心筋症の特徴の1つはサルコメアの機能不全と破壊であるため、サルコメア機能を均一に測定する有効なツールが必要です。
サルコメア短縮は、サルコメア機能および動物モデルおよびヒトに由来する成体心筋細胞の収縮性を評価するために最も広く使用されている技術である。サルコメア短縮を行うためには、位相コントラスト下で見えるよく発達したサルコメアが必要である。しかしながら、インビトロディスプレイ培養されたPSC-CMは、未発達で組織化されていないサルコメアを培養し、したがって、サルコメア短縮10を適切に測定するために使用することができない。PSC-CMの収縮性を適切に評価するこの難しさは、インビトロで心臓機能を評価するためのプラットフォームとしての使用を妨げる。PSC-CMの収縮性を間接的に評価するために、原子間力顕微鏡、マイクロポストアレイ、トラクションフォース顕微鏡、およびインピーダンス測定が、これらの細胞がそれらの周囲に及ぼす運動の影響を測定するために使用されてきた。実際の細胞運動のより洗練された、より侵襲性の低いビデオ顕微鏡記録(例えば、SONYからのSI8000)は、それらの収縮性を評価するために使用することができるが、しかし、この方法はサルコメア運動または力発生動態14を直接測定しない。
PSC-CMのサルコメア運動を直接測定するために、サルコメアタンパク質への蛍光タグ付けなどの新しいアプローチが出現しています。例えば、Lifeactは、サルコメア運動15,16を測定するために糸状アクチン(F-actin)にラベルを付けるために使用される。遺伝子組み換えiPS細胞は、サルコメアタンパク質(例えば、αアクチニン[ACTN2]およびミオメシン-2[MYOM2])を蛍光タンパク質17、18、19によってタグ付けするためのもう一つの選択肢である。
本論文では、Myom2-TagRFP(マウス胚性幹細胞[ES]細胞)およびACTN2-mCherry(ヒトiPS細胞)を用いてサルコメア短縮を測定するためのタイムラプスイメージングを行う方法について述べた。我々はまた、パターン化された文化がサルコメアのアライメントを促進することを示す。さらに、患者由来のiPS細胞に広く応用できるアデノ関連ウイルス(AAV)を用いたサルコメア標識の代替方法について述べています。

<table><tbody><tr><td>1-チオグリセロール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6145-25</td><td></td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール (55mM)</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィック</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン (MPC) ポリマー、</td><td>日油</td><td>LIPIDURE-CM5206</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>富士フイルム和光</td><td>166-04836</td><td></td></tr><tr><td>ポリマーカバースリップ付き35-mmイメージングディッシュ (&micro;-ディッシュ35 mm、高)</td><td>同上</td><td>81156</td><td></td></tr><tr><td>AAVproR Helper Free System (AAV6) (vectors; pHelper, pRC6, pAAV-CMV-Vector)</td><td>宝</td><td>6651</td><td></td></tr><tr><td>ACTN2-mCherry (AR12, AR21) hiPSCs</td><td>N.A.</td><td></td><td>610B1 hiPSC系統のACTN2の終止コドンの周りのTNNT2遺伝子座とmCherryの3'UTRにIRES-ピュロマイシン耐性カセットを挿入しました。これは、他の場所に記載されている方法に従って(安西、Methods Mol Biol、印刷中)</td></tr><tr><td>B-27サプリメント(50X)、無血清</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>B-27サプリメント、インスリンを差し引いた</td>サー<td>モフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A18956-01</td><td></td></tr><tr><td>B27サプリメント(50X)、ビタミンAを差し引いた</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>ベンゾナーゼ (25 U/&micro;L)</td><td>メルクミリポア</td><td>70746</td><td></td></tr><tr><td>ブラストサイジンS塩酸塩</td>富士<td>フイルム和光</td><td>029-18701</td><td></td></tr><tr><td>BMP-4、ヒト、組換え体、</td><td>R&Dシステムズ株式会社</td><td>314-BP-010</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503-100g</td><td></td></tr><tr><td>C59, Wnt Antagonist (WntC59)</td><td>abcam</td><td>ab142216</td><td></td></tr><tr><td>CAD 描画ソフトウェア,</td><td>Robert McNeel and Associates, WA, USA</td><td>Rhinoceros 6.0</td><td></td></tr><tr><td>遠心限外ろ過ユニット (100k MWCO), Vivaspin-20</td><td>Sartorius</td><td>VS2042</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>ケイマン</td><td>13122</td><td></td></tr><tr><td>クロムエッチング液</td><td>日本化学産業(株)</td><td>N14B</td><td></td></tr><tr><td>クロムマスク コーティング AZP1350</td><td>クリーンサーフェステクノロジー(株)</td><td>CBL2506Bu-AZP</td><td></td></tr><tr><td>Dr. GenTLE 沈殿担体 (グリコーゲン 20mg/mL、酢酸ナトリウム 3 M (pH 5.2))</td><td>タカラ</td><td>9094</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコのモディファイドイーグル」s ミディアム (DMEM) - 高グルコース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6429-500</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'のモディファイドイーグル」s Medium (DMEM) - 高グルコース、ピルビン酸ナトリウムなし</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>エタノール (99.5)</td><td>富士フイルム 和光</td><td>057-00456</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>モアゲート</td><td>59301104</td><td></td></tr><tr><td>FGF-10, ヒト, 組換え,</td><td>R&Dシステムズ株式会社</td><td>345-FG-025</td><td></td></tr><tr><td>線維芽細胞成長因子(基本)、ヒト、組換え</td><td>富士フイルム和光</td><td>060-04543</td><td></td></tr><tr><td>ブタ皮粉末ゼラチン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890-100g</td><td></td></tr><tr><td>グラスゴー最小必須培地 (GMEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5154-500</td><td></td></tr><tr><td>ガラス底培養プレート</td><td>MatTek</td><td>P24G-1.5-13-F/H</td><td></td></tr><tr><td>ハム&RSQUO;s F-12</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>11765-062</td><td></td></tr><tr><td>イスコーブ変性ダルベッコ培地 (IMDM)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>12440-061</td><td></td></tr><tr><td>L-アラニン-L-グルタミン (GlutaMAX Supplement, 200mM)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>L(+)-アスコルビン酸ナトリウム塩</td><td>富士フイルム和光</td><td>196-01252</td><td></td></tr><tr><td>ラミニン-511 E8 フラグメント (LN511-E8, iMatrix-511)</td><td>日乳</td><td>892012</td><td></td></tr><tr><td>マスクアライナー</td><td>ユニオンオプティカル(株)、日本</td><td>PEM-800</td><td></td></tr><tr><td>マスクレス露光装置</td><td>ナノシステムソリューションズ(株)、日本</td><td>D-Light DL-1000</td><td></td></tr><tr><td>MEM 非必須アミノ酸溶液 (100X)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Millex-HV シリンジフィルターユニット 0.45 & マイクロ;m、PVDF(0.45-&micro;mフィルター)</td><td>メルクミリポア</td><td>SLHVR33RS</td><td></td></tr><tr><td>Myom2-RFP(SMM18)</td><td>N.A.</td><td></td><td>前回の論文(Chanthra, Sci Rep, 2020)で開発:</td></tr><tr><td>N-2 Supplement (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>ORCA-Flash4.0 V3 digital CMOS camera</td><td>Hamamatsu</td><td>C13440-20CU</td><td></td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Stemgent</td><td>04-0006-10</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿</td><td>三省メディカル株式会社</td><td>01-004</td><td></td></tr><tr><td>フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール (25:24:1)</td><td>Nippon Gene</td><td>311-90151</td><td></td></tr><tr><td>ポリジメチルシロキサン (PDMS) エラストマー</td><td>ダウコーニング社 MI, USA</td><td>SILPOT 184</td><td></td></tr><tr><td>ポリエチレンイミンMAX (MW. 40,000)</td><td>ポリサイエンス</td><td>24765-1</td><td></td></tr><tr><td>ポジ型フォトレジスト現像剤</td><td>東京応化工業株式会社(株)</td>日本 <td>NMD-3</td><td></td></tr><tr><td>PowerUp SYBR グリーンマスターミックス</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A25742</td><td></td></tr><tr><td>プロテイナーゼ K</td><td>宝</td><td>9034</td><td></td></tr><tr><td>ピュロマイシン 二塩酸塩</td><td>富士フイルム 和光</td><td>166-23153</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒト/マウス/ラットアクチビンAタンパク質</td><td>R&Dシステムズ株式会社</td><td>338-AC-050</td><td></td></tr>組<tr><td>換えトリプシン様プロテアーゼ(rTrypsin;TrypLE express)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>12604-039</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640 中</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>11875-119</td><td></td></tr><tr><td>シリコンウエハー</td>ス <td>松崎製作所(株)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム (100 mM)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>スピンコーター</td><td>ミカサ</td>株式会社 <td>MS-A100</td><td></td></tr><tr><td>スピニン共焦点顕微鏡</td><td>オックスフォード・インスツルメンツ</td><td>アンドール トンボ スピニングディスクシステム</td><td></td></tr><tr><td>StemSure LIF, マウス, 組換え, 溶液 (10^6U)</td><td>富士フイルム和光</td><td>195-16053</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 3010</td><td>Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USA</td><td>SU-8 3010</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 developer</td><td>Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USA</td><td>SU-8 developer</td><td></td></tr><tr><td>Tris-EDTA</td><td>Nippon Gene</td><td>314-90021</td><td></td></tr><tr><td>Vascular Endothelial Growth Factor-A165(VEGF), Human, recombinant</td><td>富士フイルム 和光</td><td>226-01781</td><td></td></tr></tbody></table>

蛍光タグ付きサルコメアタンパク質を用いた多能性幹細胞由来心筋細胞のサルコメア短縮

Sarcomere Shortening of Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes using Fluorescent-Tagged Sarcomere Proteins.

多能性幹細胞由来心筋細胞(PSC-CM)は、胚性幹細胞および誘導多能性幹細胞(ES/iPS)細胞の両方から生成することができる。これらの細胞は、心疾患のモデリングのための有望な情報源を提供する。心筋症のサルコメア短縮は、成人型心筋細胞と共に疾患の型を調べるために使用される標準的な生理学的評価の1つである。しかし、これらの細胞は位相対比顕微鏡では見えないサルコメアを未発達にしているので、利用可能な方法はPSC-CMの収縮性を評価するのに適切ではない。この問題に対処し、PSC-CMでサルコメア短縮を行うために、蛍光タグ付きサルコメアタンパク質および蛍光ライブイメージングを使用した。細いZ線とM線は、それぞれ両端とサルコメアの中心に存在する。z-ラインタンパク質は、αアクチニン(ACTN2)、テレトニン(TCAP)、アクチン関連LIMタンパク質(PDLIM3)、および1つのM線タンパク質であるミオメシン-2(Myom2))を蛍光タンパク質でタグ付けしました。これらのタグ付きタンパク質は、内因性対立アレスからノックインまたはアデノ関連ウイルス(AAV)から発現することができる。ここでは、マウスとヒト多能性幹細胞を心筋細胞に分化し、AAVを産生し、ライブイメージングを行い、分析する方法を紹介します。また、PSC-CMのパターン培養用ポリジメチルシロキサン(PDMS)スタンプの製造方法についても説明し、蛍光タグ付きタンパク質によるサルコメア短縮の解析を容易にします。サルコメアの短縮を評価するために、拍動細胞のタイムラプス画像を電気刺激(0.5〜1Hz)下で高フレームレート(毎秒50〜100フレーム)で記録した。細胞収縮の過程でサルコメアの長さを分析するために、記録されたタイムラプス画像はImageJ / FijiのプラグインであるSarcOptiMに施されました。我々の戦略は、PSC-CMにおける心疾患のフェノタイプを調査するための簡単なプラットフォームを提供する。

ノックインPSC-CMレポーターラインを使用したサルコメア短縮測定。サルコメアラベルPSC-CMはサルコメア短縮を測定するために使用されました。ラインは内在性の場所からMyom2-RFPとACTN2-mCherryを表現します。TagRFPはMyom2に挿入され、M線に局地化するMタンパク質をコーディングし、mCherryはACTN2にノックインされ、αアクチニンをコーディングし、Z線18、25に局地する。タイムラプス画像を取得し、図1と2とムービー1-3に示すようにサルコメア短縮を決定するために使用されました。
PSC-CMの組織化されていないサルコメアを克服するた...

この方法は、蛍光タグ付きサルコメアタンパク質を有する多能性幹細胞由来心筋細胞を用いてサルコメア短縮を調べるために使用することができる。

Pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (PSC-CMs) can be produced from both embryonic and induced pluripotent stem (ES/iPS) cells. These cells ...

未発達で組織化されていないサルコメアによる多能性幹細胞由来心筋細胞におけるサルコメア機能の評価は困難である。蛍光タグ付きサルコメアタンパク質を使用して、サルコメアの短縮にアクセスできるようになりました。サルコメアを可視化し、幹細胞由来の心筋細胞と蛍光タグ付きサルコメアタンパク質を使用してインビトロで機能を評価することができます。AAVベースの伝達を用いて、患者由来の人工多能性幹細胞にこの方法を拡大することができます。この方法は、体外症療法の開発に拡大することができ、それは直接にインビトロで疾患関連サルコメア機能不全を評価するために使用することができる。この方法は、小児心臓病学研究を含む心臓病学分野で有用である。しかし、筋症などの骨格筋機能障害の研究にも応用できる。分化誘導の日から4つを引いた日に、PBSで希釈したラミニン-511 E8の平方センチメートルあたり0.5マイクログラムの6ウェルプレートをコーティングし、摂氏37度と5%の二酸化炭素で30分のインキュベーションを行います。インキュベーションの終わりに近づいて、人間が誘発する多能性幹細胞を摂氏37度で3分間組み換えトリプシンで治療する。細胞が剥離したら、細胞を10%FBSで補って計数し、遠心分離後にラミニン-511 E8とROCK阻害剤を添加したAK02N培地の2ミリリットル当たり1.25倍から5番目の細胞に細胞を再懸濁する。次に、6ウェルプレートの各ウェルからコーティング溶液を吸引し、各ウェルに2ミリリットルの細胞を播種する。プレートを細胞培養インキュベーターに戻します。4日後、細胞は80%の合流に達する。分化を誘導するためにGSK-3阻害剤を添加したインスリン培地なしで、各ウェルの上清を2ミリリットルのRPMIプラスB27に置き換えます。分化の2日後、 穏やかに 1 ウェルあたりヤマアラシ阻害剤を補充するインスリン培地なしで RPMI プラス B27 の 2 ミリリットルで培地を交換します。.細胞は100%の合流に達しているはずです。分化の4日目に、上清を2ミリリットルのRPMIとB27に優しく交換します。細胞は高密度のままで、一部は浮き始めている可能性があります。分化の7日目と9日目に、各ウェルの上清を、選択的多能性幹細胞由来心筋細胞培養のためにプロマイシンを補充したインスリンで、RPMIとB27の2ミリリットルに置き換えます。この時点で、細胞を叩く細胞は培養内で観察されるべきである。パターン化された多能性幹細胞由来の心筋細胞培養を行う場合は、まず、修理テープを使用して、カスタムメイドのPDMSスタンプの表面からほこりを取り除き、スタンプを70%エタノールに簡単に沈めます。エアーダスターを使用して、スタンプ表面からエタノールを取り除き、0.5%MPCポリマーとエタノールの5〜10マイクロリットルで表面を処理します。ポリマーが完全に乾燥したら、35ミリメートルのイメージング皿の中のポリマーカバースリップにスタンプを置き、スタンプに重みを置きます。10分後、軽い顕微鏡を使用してパターンがカバースリップに移されたことを確認し、PBSで皿とカバースリップを2回洗います。2回目の洗浄後、カバースリップにラミニン-511 E8の1平方センチメートルあたり0.5〜1マイクログラムをコーティングし、0.1%ゼラチンで希釈し、室温で2〜4時間のインキュベーションを行います。分化の10日目に、PBSで細胞を2回洗浄し、続いて摂氏37度で3〜5分間、1回の組換えトリプシンを1回ずつ処理する。カウント後、RPMIとB27のミリリットル当たり5番目の細胞に2.5〜5倍の細胞をピューロマイシン濃度で補充し、1ミリリットルの細胞をプレートに播種して摂氏37度で一晩培養します。翌朝、上清を新鮮なRPMIプラスB27にピューロマイシンを添加したインスリンで置き換え、細胞を培養インキュベーターに戻し、イメージングのために週21〜28日まで培地を2〜3回リフレッシュする。PCCSM培養におけるサルコメア短縮のタイムラプスイメージングのために、蛍光共焦点顕微鏡の100倍の対物レンズに油を塗布し、関連ソフトウェアでライブイメージング条件を選択します。良好な代表データを得るためには、最も高いフレームレートを選択し、シャッターを開くように設定し、取得領域の作物に4対4のビニングを適用して、タイムラプスイメージング中の画像間の最短間隔を達成します。細胞の拍動率が低い場合は、電界刺激によって細胞を呼び起こし、タイムラプス記録を開始し、画像化中に画像フィールドが焦点を当てたままであることを注意してください。イメージング期間の終了時に、タイムラプス画像を適切なフォルダに保存します。タイムラプス画像を解析するには、一連のタイムラプス画像をImageJに開き、サルコメアパターンが明確に観察されるまで画像の明るさとコントラストを調整します。[その他のツール] メニューで SarcOptiM を選択し、コントロール Shift P キーとツールバーの 1 ミクロン ボタンを押して、プログラムの調整手順を使用します。次に、サルコメアの領域を横切ってサルコメアの短縮を測定し、単一セルAVIをクリックしてサルコメア短縮解析を開始します。サルコメア標識されたパターン多能性幹細胞由来心筋細胞のタイムラプスイメージングは、異なる時点でのサルコメア短縮を測定するために使用することができる。パターン化された多能性幹細胞由来心筋細胞培養で典型的に認められるサルコメアの解体を克服するために、特定のPDMSスタンプは、ストライプパターンでパターン化された多能性幹細胞由来心筋細胞を培養するために使用することができ、これは、非パターン領域で培養された細胞と比較して、細長い細胞形状およびより組織化されたサルコメアパターンを促進する。パターン化培養はまた、より良い細胞収縮を促進し、非パターン培養細胞と比較して滑らかなサルコメア長さのプロファイルを提供する。AAVトランスデューセドパターン多能性幹細胞由来の心筋細胞は、パターン化された多能性幹細胞由来心筋細胞に沿って肉体GFPシグナルを早くも3日後に発現させ、サルコメア収縮プロファイルの測定にも使用できる。また、トランスダクション時にブラストシジン耐性遺伝子を添加することで、90%以上の純度にパターン化された多能性幹細胞由来の心筋細胞選択を容易にして、より容易かつ高品質な画像解析を容易にするために、直線的に移動するサルコメアを有する領域を同定し、最高フレームレートで画像を得ることが不可欠である。この方法を用いて、肉腫タンパク質における成熟の役割を評価し、疾患特異的な患者由来のiPS細胞に由来するラボ心筋細胞におけるサルコメア機能障害を研究することができる。

sarcomere-shortening-pluripotent-stem-cell-derived-cardiomyocytes

Research

JoVE Journal

Medicine

医学

成人心筋細胞は動物の心臓から分離し、数日間培養することができる主要な細胞である。この培養期間内にアデノウイルス遺伝子導入は、遺伝的に符号化されたバイオセンサー（GEBs）または蛍光融合タンパク質を発現させることができる。両方のアプローチは、共焦点顕微鏡による細胞の調査を許可する。...

共焦点イメージングのための成人心筋細胞の単離と遺伝子操作

多能性幹細胞は、胚又は人工多能性幹細胞（iPS細胞）のいずれかで、心筋細胞を含むヒト分化細胞の貴重な情報源を構成する。ここでは、胚様体ベースのプロトコルを介して機能的なヒト心筋細胞を得るためにそれらを使用する方法を示す、iPS細胞の心筋誘導に焦点を当てます。...

ヒト心筋細胞の生成：フィーダーフリーヒト人工多能性幹細胞からの分化プロトコル

物品を効率よく選択的に集団の均質性および同一性を評価するための基準マーカーのフローサイトメトリー分析を行っWnt経路を変調することにより、心筋細胞へのヒト多能性幹細胞を分化するための詳細な方法論を記載している。...

フローサイトメトリーによる高効率心筋細胞へのヒト多能性幹細胞の分化と特性

&gt;jove_content&lt;先天性心疾患を引き起こす突然変異は、発生中の心臓構造のin...

胚性マウスの心臓に免疫蛍光を用いて、心筋細胞の開発の分析

心筋細胞の細胞分裂と細胞周期の変動を区別するために、私たちは2つのトランスジェニックマウス系統を使用したプロトコルを提示します:Myh6-H2B-mChトランスジェニックマウスは、心筋細胞の核を明確に識別し、CAG-eGFP-アニリンマウスは細胞分裂と細胞周期の変動を区別するためのものです。...

生後心筋細胞における細胞周期変化の可視化と核の決意

この原稿は、レトロウイルスが媒介するGata4、Hand2、Mef2c、およびTbx5の送達を使用して、多様な再プログラムされた心臓サブタイプの生成と定量化のための段階的なプロトコルを説明しています。...

マウス胚線維芽細胞の転写因子媒介リプログラミングに続いて心筋細胞のサブタイプを評価します

細胞内カルシウム リサイクル心筋収縮および拡張機能の調節に重要な役割を果たしています。ここでは、カルシウム イメージング システムにより筋小胞体 Ca2...

分離の心室心筋の筋小胞体カルシウム拡張予備能と細胞内のカルシウム除去の評価

ここで具体的には心室のような誘導多能性幹細胞由来心筋細胞イメージ活動電位光学的方法を提案する.メソッドは、電位感受性蛍光タンパク質のプロモーターに駆動される式に基づいています。...

人間のサブタイプに固有の光の活動電位記録誘導多能性幹細胞由来の心室心筋細胞

適切なサルコメアネットワークの形成は、iPSC由来心筋細胞の成熟にとって重要である。我々は、心臓の発達を促進する培養条件を改善するために、幹細胞由来心筋細胞の構造成熟の定量的評価を可能にする超解像ベースのアプローチを提示する。...

一分子局在顕微鏡を用いたヒトiPSC由来心筋細胞におけるαアクチニンネットワークの解析

ここでは、高速モジュラーフォトメトリーシステムを用いた誘導多能性幹細胞由来心筋細胞からの作用電位の光学的獲得および特性評価について述べている。...

ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞における単細胞光学作用電位測定

ここでは、光学系プラットフォームを用いてヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞において収縮性およびカルシウム測定を行う確立された方法について説明する。このプラットフォームにより、研究者は突然変異の影響とさまざまな刺激に対する応答を迅速かつ再現性のある方法で研究できます。...

ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞におけるカルシウムおよび収縮性パラメータのリアルタイム測定

学ぶ蛍光タグ付きサルコメアタンパク質を用いた多能性幹細胞由来心筋細胞のサルコメア短縮評価法。AAV導入により患者由来iPS細胞への応用が可能で、心筋症治療開発に貢献する。

蛍光タグ付きサルコメアタンパク質を用いた多能性幹細胞由来心筋細胞のサルコメア短縮

さらに動画を探す