Name: アノフェレスガンビアにおける機能遺伝学のGAL4-UASシステムの使用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: 学ぶGAL4-UASシステムをアノフェレスガンビアで用いた機能遺伝学的手法。時空間的な遺伝子発現制御により、殺虫剤耐性や遺伝的防除に関わる遺伝子の表現型解析が可能です。

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我々は、LSTMとIVCC(アドリアナ・アドルフィ)、BBSRC(新捜査官賞(AL)、MRC(BCP:MR/P016197/1への博士課程の学生シップ)、ウェルカム(LGへのヘンリー・ウェルカム博士研究員:215894/Z/19/Z)からの資金提供を感謝しています。

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

蚊の遺伝子機能を理解することは、アノフェレスを制御し、マラリア感染に影響を与える新しいアプローチを開発するために不可欠です。記載されているGAL4-UASシステムは、候補遺伝子の機能解析のための汎用性と強力なシステムであり、現在までに我々は殺虫剤耐性の遺伝的基礎を調べるためにシステムを使用しています17とキューチキュラー炭化水素生産15,23だけでなく、蛍光で異なる蚊細胞集団をタグ付けする8.これまでのところ、レスポンダーコンストラクトは、制限酵素を介してプラスミドにクローニングされ、UASの下流に複数のクローニング部位を運ぶ(図1、表1)。しかし、複数の要素(attB部位、3xP3-YFPおよびジプシー絶縁体配列)を運ぶ構造のモジュール的な性質のために、より現代的な技術は新しい応答性プラスミドを構...

二部GAL4-UASシステムは、昆虫モデルの生物ショウジョウバエメラノガスター1,2,3における遺伝子の機能的特徴付けの役馬である。GAL4-UASシステムを使用するには、トランスジェニックドライバラインは、調節配列の制御下にある酵母転写因子GAL4を発現し、GAL4によって認識される上流活性化シーケンス(UAS)によって制御される目的の遺伝子またはRNA干渉(RNAi)構築物を運ぶ応答線と交差する。この十字架の子孫は、GAL4発現を制御するプロモーターによって指示される時空間パターンにおける関心のトランスジーンを表す(図1)。ドライバー応答者十字の子孫によって表示される型のフェノタイプは、候補遺伝子の機能を解明するために評価することができる。D.メラノガスターは、他の生物から遺伝子を調べるために使用されているが4,5,6,7,, GAL4-UASシステムは、関心のある種8,9,11,12,13,14の直接分析を提供するために、医療および農業上重要の昆虫での使用に適応されています。
アフリカのマラリア蚊、アノフェレスガンビアでは、GAL4-UASシステムが最初に細胞株共トランスフェクション9によってテストされました。複数の構成体が異なる対の組み合わせで効率のためにアッセイされ、14のタンデム反復UASが小型の人工イントロン(UAS-14i)を補い、GAL4ドライバのパネルで使用すると、最も広い範囲の活性化電位を示すことがわかった。インビボ機能を実証するために、これらの構成体は、ピギーバクトトランスフォーメーション8によって2つの別々のトランスジェニックAn.ガンビアラインを作成するために使用されました:midgut特異的プロモーターによって駆動されるGAL4を運ぶドライバーラインと、UAS配列の調節下にあるルシメラーゼおよび強化された黄色蛍光タンパク質(eYFP)遺伝子の両方を含む応答線。腸特異的ルシメラーゼ活性および生前性における蛍光は、このシステムがアノフェレスで効率的であることを示した。それ以来、オエノサイト15やヘモサイト16を含むベクター容量および殺虫剤耐性に重要な他の組織におけるトランス遺伝子を発現するドライバラインが作成され、かつ、ユビキタスパターン10に近いものである。また、代謝および隔離媒介性殺虫剤耐性に関与すると考えられるアッセイ遺伝子、カチカリン炭化水素合成、および異なる細胞および組織タイプに蛍光タグを付ける測定遺伝子にも多数のUASラインが生成されている(表1)。応答線については、トランスジーンの部位指向統合が、UAS調節遺伝子のゲノムコンテキストを固定するために、ΦC31触媒再結合カセット交換17,18によって行われるようになりました。このようにして、遺伝子挿入位置に関して遺伝子導入発現が正規化され、異なる候補遺伝子の表現型効果をより正確に比較することが可能になる。
これまでに作成された応答線は、高いレベルでトランスジーンを発現するか、RNA干渉(RNAi)を介して遺伝子発現を減少させるように設計されています。 通常、cDNAクローンはUAS配列に融合して適切な発現プラスミドを生成するが、完全なゲノム配列はクローニングには大きすぎるものではないと仮定しても可能である。サイレンシング構築物を生成するために、RNAiを刺激するヘアピンdsRNAを形成する適切なタンデム逆配列を得るために3つの異なる方法を用いた。これらには、融合PCR、非対称PCRおよびヘアピン構築物の商業的合成が含まれています。各方法に共通するのは、転写安定性を提供するために反転配列間にイントロン配列を含めることである。目的の遺伝子/RNAi構築物を挿入できる応答性プラスミドが開発された15。これらのプラスミドはまた、RMCE(RCME技術を詳細に記述するJoVE紙に付随するアドルフィに記載)に必要なΦC31 attB サイトを運びます。これらのプラスミドの1つに挿入するシーケンスを過剰発現にする際に必要な重要なステップをカバーするプロトコルが、この原稿に含まれている。また、RNAiヘアピン構築物作成用の2つのプロトコルを説明し、図示する。
新しいラインを作成する際には、まれなトランスジェニックな個体の同定は、トランスジェニックコロニーを確立し維持するために繁殖するために重要です。GAL4-UASシステムにとって最も重要なことは、応答者とドライバラインを区別して十字架を確立し、両方の遺伝子を運ぶ個々の子孫を特定する必要があります。これは、ドライバと応答側カセットにリンクされた異なる支配的な選択可能マーカー遺伝子を使用することによって達成される。最も一般的には、光学フィルター(例えば、eYFP、eCFP、dsRed)を使用して明確に識別可能な蛍光マーカー遺伝子です。マーカーは、異常や汚染の識別が容易になるため、既知の信頼性の高い時空間パターンで表現することが重要です。蛍光マーカー遺伝子発現は、合成 3xP3 プロモーターによって日常的に調節され、 An.gambiae 開発19のすべての段階で眼および腹側神経節特異的発現を引き起こす。 3xP3 で制御される蛍光マーカーは、本稿に記載されているすべての形質転換プラスミドに含まれています。蛍光 アンガンバエ PUPAe GAL4-UASラインをスクリーニングするために使用される一般的な方法を詳述するプロトコルがここに含まれています。
GAL4-UAS システムの重要な要素の 1 つは、差し切れにマークされたドライバとレスポンダラインを横断する必要があります。この男性と女性を各ラインから行うには、交配前に分離する必要があります。しかし、成人は視力によって容易に区別できるが、遺伝的十字架を確立するためには、交配が起こらないように成人の出現前に男女を分離することが賢明である。男性と女性の一般的なサイズの違い アンガンビアの 子犬は、性決定の効率的で信頼性の高い方法になるにはあまりにも可変です20。代わりに、外部生殖器の明確な形態学的違いは 、An.ガンビアでのセックスのための信頼できる基礎を提供します。この記事では、適切な十字架を設定するために An.ガンビア の子犬をセックスするための信頼できる方法について説明します。
<img alt="蚊のRNAiを用いた遺伝子編集プロセス,クローニング,注射,表現型解析を網羅した図" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62131/62131fig1v3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 図1 -アノフェレスガンビアにおける二国間GAL4-UASシステムを使用するためのプロセスの図示的表現。 (A)例ベクトルの主要成分(pSL-attB-UAS14-gyp[3xp3-eYFP])が描かれ、対象遺伝子にヘアピン構造またはコード配列を挿入するのに適した複数のクローニング部位内の利用可能な制限部位(EcoRI、NheI、XhoIおよびNcoI)を詳述している。ドッキングラインの構造も描かれています。(B)交差工程は、ドライバーライン(3xP3プロモーターによって駆動される目的のプロモーターおよびeCFPによってGAL4ドライバーを運ぶ)および応答側ライン(UASプロモーターおよび3xP3プロモーターによって制御されるeYFPマーカーによって制御される関心のある遺伝子またはヘアピン構築物を運ぶ)からの雄の使用を示す図示される。(C)Bにおける十字架の子孫における目的の遺伝子のGAL4駆動発現の図示および評価される典型的な表現型の一部のリスト。略称:複数クローニング部位(MCS)、リコンビナーゼ媒介カセット交換(RMCE)、アップストリームアクチベーター配列(UAS)、強化された黄色蛍光タンパク質(eYFP)、強化シアン蛍光タンパク質(eCFP)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62131/62131fig1v2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
GAL4-UAS システムの二者間の性質を提供する十字の使用であり、より線形なアプローチよりも明確な利点があります。例えば、ドライバーとレスポンダーラインの組み合わせは、プロモーター/遺伝子の組み合わせごとに新しいトランスジェニックラインを生成して維持する必要がある場合よりも評価できます。さらに重要なことは、線形系で作成/維持することが困難な発現が摂動されたときに致死的または無菌表現型を産生する遺伝子の分析を可能にする。このような致死性表現型は、遺伝子機能および時空間的発現に応じて、すべての発達段階で現れるが、胚発生時に最も頻繁に観察される。蚊の胚の発達を視覚化するには、卵をコーティングする不透明な絨毛のクリアが必要です。Trpiš(1970)21 およびカイザーら(2014)22に記載されている方法に従って、我々は、構造的完全性を維持しながら、胚を固定するために使用するプロトコルを記述し、顕微鏡的可視化およびイメージングを可能にするエンドコリオンをクリアするために漂白する。

<table><tbody><tr><td>100 x 15 mmプラスチックペトリ皿</td><td>SLS</td><td>2175546</td><td>10</td></tr><tr><td>1000個入りパック&マイクロ;L ギルソン ピペット</td><td>ギルソン</td><td>F144059P</td><td></td></tr><tr><td>20/25 mL ユニバーサル チューブ</td><td>Starlab</td><td>E1412-3020</td><td>400 個入りパック</td></tr><tr><td>3 mL パスツールピペット</td><td>SLS</td><td>G612398</td><td>Greiner パスツールピペット 3 mL 滅菌済み 個別包装</td></tr><tr><td>50 mL ファルコン チューブ</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>11512303</td><td></td></tr><tr><td>無臭エタノール</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>BP2818-500</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>酢酸</td><td>SLS</td><td>45726-1L-F</td><td>1 L</td></tr><tr><td>ケージ</td><td>SLS</td><td>E6099</td><td>30x30x30 スクリーンポート付き</td></tr><tr><td>ファインペイントブラシ</td><td>Amazon</td><td>UKDPB66</td><td>KOLAMOON 9 個 ディテールペインティングブラシセット ミニチュアブラシ 水彩、アクリル画、油絵 (ワインレッド)</td></tr> <tr><td>魚料理</td><td>アマゾン</td><td></td><td>テトラミンフィッシュフード、健康、色、活力のためのすべての熱帯魚のための完全なフード、10リットル&nbsp;</td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド溶液</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>口内吸引器</td><td>ジョン・ホック</td><td>612</td><td></td></tr><tr><td>ポンドソルト</td><td>アマゾン</td><td></td><td>ブラッグドン ガーディアン ポンド トニックソルト、魚の健康、水質、一般的な強壮剤、pH バッファー、9.08 kg、9,092 L&nbsp;</td></tr><tr><td>蛹の鉢</td><td>Cater4you</td><td>SP8OZ</td><td>蓋付き 250 鉢</td></tr><tr><td>小さなプラスチック バケツ</td><td>アマゾン</td><td></td><td>2.5 L 白いプラスチック バケツ 白い蓋付き (10 個入り)&nbsp;</td></tr><tr><td>次亜塩素酸ナトリウム</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>S25552</td><td></td></tr></tbody></table>

アノフェレスガンビアにおける機能遺伝学のgal4-uasシステムの使用

Using the GAL4-UAS System for Functional Genetics in Anopheles gambiae

二部のGAL4-UASシステムは機能性の遺伝子解析のための多目的で強力な用具である。システムの本質は、酵母転写因子GAL4を組織特異的な方法で発現するトランスジェニックな「ドライバ」ラインを横断し、その発現がGAL4に結合する上流活性化配列(UAS)によって制御される遺伝子/RNA干渉構造の候補を運ぶトランスジェニックな「応答者」ラインである。その後の子孫では、遺伝子またはサイレンシング構築物は、このように規定された時空間的な方法で発現され、結果として生じる表現型をアッセイし、遺伝子機能を推測することを可能にする。バイナリシステムは、重度のフィットネスコストが誘発された場合でも、複数の組織特異的パターンでトランスジーン発現によって生成された表現型をスクリーニングする実験的アプローチの柔軟性を可能にする。我々は、アフリカの主要なマラリアベクター であるアノフェレス・ガンビアにこのシステムを適応させました。
この記事では、GAL4-UAS 分析で使用される一般的な手順をいくつか紹介します。我々は、すでに生成された AN.ガンビア GAL4-UASラインと、アップレギュレーションとRNAiノックダウンのための新しい応答構造のクローニングについて説明する。我々は、ドライバーと応答者の挿入をタグ付けする蛍光遺伝子マーカーの継承に従う子孫のスクリーニングを含む、遺伝的十字架を確立するための蚊の子犬のセックスのためのステップバイステップガイドを指定する。我々はまた、胚発生を研究するために An.ガンビア胚 をクリアするためのプロトコルを提示する。最後に、標的遺伝子のGAL4下流にCRISPR/Cas9を挿入してドライバラインを生成する方法の潜在的な適応を紹介する。

eYFP、dsRedおよびeCFPの3xP3発現は、アンガンビアの子犬の目と腹側神経節で発現を産生するマーカー遺伝子を有する個体の信頼性の高い、容易に区別可能な同定を提供する(図3)。男女の性器で観察される差形の形態と、識別できない子犬の例を図4に示す。子犬からすべての水を除去すると、肛門のパドルが生殖器の可視化をあいまいにするので、セックスの困難が増加します(図4D,E)。二partite GAL4-UASシステムは、応答線UAS-mCD8:mCherry10を有するユビキタス(図6A、C)およびオエノサイトドライバ(図6B、D)ラインを横断することによって...

二部類GAL4-UASシステムは 、アノフェレスガンビアで機能的な遺伝子解析を可能にする制御された時空間的な方法で遺伝子発現を修飾するための汎用性の高いツールです。このシステムを使用するために説明されている手順は、半標準化されたクローニング戦略、蛍光タンパク質マーカーおよび胚固定のための子犬の性別とスクリーニングである。

アノフェレスガンビアにおける機能遺伝学のGAL4-UASシステムの使用

The bipartite GAL4-UAS system is a versatile and powerful tool for functional genetic analysis. The essence of the system is to cross transgenic 'driver' ...

二部類GAL4-UASシステムは、時空間的に制御された方法で遺伝子発現の遺伝子改変を通じてアノフェレスガンビアの機能的遺伝子解析のための汎用性の高いツールです。このバイナリシステムは、重度のフィットネスコストが誘発された場合でも、トランスジーン発現の表現型特性を持つ実験的アプローチの柔軟性を可能にする。このシステムは、殺虫剤耐性、病原体の伝染、または遺伝的制御方法に使用されているものに関与する可能性のある遺伝子の表向きの特徴付けに使用することができる。研究技術者のフレイザー・コールマンは、ステレオ顕微鏡での使用に適した透明な平らな皿に端を切り落とした3ミリリットルのプラスチック製パスツールピペットを使用して子犬を収集することで始まるこの手順を実証するのに役立ちます。慎重に子犬の周りの水のほとんどを除去します。蛍光灯をオンにし、ウォームアップできるようにします。蛍光マーカーのスクリーニング時に予想される表現型の発現と比の色空間パターンを考えてみましょう。蛍光ステレオスコープで必要なフィルターを選択し、ステージプレートの中心に向けられた光の色のビームが見えるように確認します。白色光の下で、子犬を視野に入れ、焦点を合わせます。白色光を消し、細かい焦点を使って、目に見える蛍光パターンを持つ目的の表現型を運ぶ子犬の領域を焦点にします。細かいディテールペイントブラシを使用して、外的な生殖器を識別できるように、子犬をそっと回し、肛門のパドルを動かします。特徴的な外部生殖器に基づいて別々の子犬。オスは、肛門パドルの約半分の長さの最終的な後部セグメントから押し出す長いチューブを有する。女性の子犬の外性器はかなり短く、二分です。セックスされた子犬を水で透明な20ミリリットルのチューブで10以下のグループに分け、綿毛のボールでチューブを密封します。この移動中に成人に損傷を与えないように注意して、チューブから望ましい数の男性と女性の成人をケージまたは小さなバケツに吸引する。十字架は、授乳前に5〜7日間維持します。翌日、卵子を採取して胚の発達を研究することができる。卵子室を組み立て、慎重に10〜15の血液供給された女性をそれに導入する。卵子チャンバーを覆い、20分間放置します。50ミリリットルのポリプロピレンチューブを卵型ポットから慎重に取り外し、蚊を放出しないようにします。鍋を覆い、卵が興味のある発達段階に成熟するようにします。細かいディテールペイントブラシを使用してポットから卵を拾い、40平方ミリメートルの発掘ガラスブロックに水の上に置きます。慎重にマイクロピペットでガラスブロックから水を取り出し、FAAの500マイクロリットルで卵をカバーします。室温で軌道シェーカーで30分間静かに振動する。卵を蒸留水で15回徹底的に洗い流し、FAA溶液のすべての痕跡を取り除きます。1000マイクロピペットを使用して、追加し、その中に卵を損傷しないように注意して、一度に蒸留水の1ミリリットルを削除します。固定卵を1ミリリットルのTrpis溶液で覆い、室温で30分間インキュベートします。卵は、5分間のインキュベーションの後、最終的に白色に達すると淡いパッチを開発し始めます。卵を蒸留水で15回十分に洗い流し、Trpis溶液のすべての痕跡を取り除きます。3xP3プロモーターによって駆動される蛍光マーカーの発現は、アノフェレスガンビアの眼および腹側神経節で観察される。異なる色の蛍光マーカーを使用することで、異なるGAL4成分とUAS成分を持つ修飾者の選択とスクリーニングが可能になります。二国間GAL4-UASシステムを使用する場合、GAL4とUASの両方のコンポーネントを運ぶ子孫を獲得するために、異なる株から男性と女性を横断する必要があります。男性と女性の子犬の外性器で観察される差動形態は、セックスに使用されます。ここでは、識別できない子犬の例を紹介します。右側に示すように、子犬からすべての水を除去すると、肛門のパドルが生殖器の視覚化をあいまいにするので、セックスの難しさを増加させます。二部のGAL4-UASシステムは制御された時空間的な方法で遺伝子発現の修飾を可能にする。これは、応答線UAS-mCherryでドライバーラインを表現するオエノサイトとユビキタスGAL4 4を横断することによって視覚化することができます。二国間GAL4-UASシステムを使用することの主な利点は、胚期でも致死的表現型を研究することの容易さである。これを行うには、胚の内部形態を可視化する必要がある。胚除去プロトコルの完成後、12、24、および36時間の胚発生の異なる段階で観察された正常な形態学的特徴が見られる。この手順を通じて、子犬と卵を乾燥させることはできません。したがって、液体を取り除くときに迅速に作業することが重要です。GAL4-UAS法により、殺虫剤耐性に関与する遺伝子や、遺伝子駆動制御法に潜在的な用途を持つ遺伝子を機能的に特徴付けることができています。

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Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

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蚊胚マイクロインジェクション:ハマダラカの胚卵黄に外因性DNAを送達して生殖細胞変異を生成する技術

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このビデオの記事では、我々は大人のフルーツキイロショウジョウバエを飛んでの嗅覚に依存する食品の検索行動に空腹や満腹の効果を測定するための自動化されたアッセイを説明します。...

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RNA干渉（RNAi）は、遺伝子の機能を明らかにするための非常に貴重なツールです。しかし、成人前の段階でRNAiを使用して遺伝子を標的とする能力は、主要なヒトマラリアベクターであるAnopheles...

RNAiのトリガ配信へ<em&gt;ハマダラカ</em&gt;蛹

このプロトコルの目的は、ショウジョウバエメラノガスターにおける生体内実験の設計と性能を概説し、ヒト疾患に関連する希少遺伝子変異体の機能的影響を評価することです。...

ショウジョウバエを用した疾患関連希少ヒト変異体の生体内機能的研究

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蚊のゲノムに外因性遺伝子を導入するには、マイクロインジェクション技術が不可欠です。このプロトコルは、変換された蚊を生成するために アノフェレスガンビア 胚にDNA構築物をマイクロ注入するためにジェームズ研究所によって使用される方法を説明します。...

アノフェレスガンビア胚の微小注入法

細菌によって産生されるdsRNAの経口投与は、 カエノラブディティス・エレガンス...

成虫 のアノフェレスガンビアエ 蚊への効果的な経口RNA干渉(RNAi)投与

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ショウジョウバエにおけるトランスジェネシスのための胚マイクロインジェクション

学ぶGAL4-UASシステムをアノフェレスガンビアで用いた機能遺伝学的手法。時空間的な遺伝子発現制御により、殺虫剤耐性や遺伝的防除に関わる遺伝子の表現型解析が可能です。

アノフェレスガンビアにおける機能遺伝学のGAL4-UASシステムの使用

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