Name: 非ウイルス遺伝子治療のための哺乳動物一次色素上皮細胞の単離、培養、遺伝子工学 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: 学ぶ、マウス・ラット・ウサギ・ブタ・ウシの一次虹彩・網膜色素上皮細胞の単離・培養・非ウイルスSB100Xトランスポソン系を用いた遺伝子導入法。高い細胞生存率と導入効率を持つ眼遺伝子治療研究のための柔軟なプロトコルです。

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グレッグ・シーリーとアリン・コンティの優れた技術支援に感謝します。この研究は、第7枠組みプログラム、スイス国立科学財団、シュミーダー・ボーリッシュ財団の文脈で欧州委員会によって支援されました。Z.I.は、フルブライト・リサーチ・グラントとスイス政府優秀奨学金から、欧州研究評議会、ERCアドバンス[ERC-2011-ADG 294742]、B.M.W.から資金を受け取りました。

動物が関与したプロトコルは、認定された人員によって行われ、カントナル・デ・ラ・セクリテ、ド・ランプロイ・エ・ド・ラ・サンテ(DSES)、スイスのジュネーブのドメーヌ・ド・ラルエクスペリメンテーション動物、およびオフタルム・ビジョン研究における動物の使用に関するARVO声明(承認なし)によって承認された。GE/94/17)。成人の健康なブラウンノルウェーラット、C57BL/6マウス、ニュージーランドの白いウサギは、0.9%NaClに希釈したペントバルビタール(150mg/kg)の過剰摂取によって安楽死させ、犠牲の直後に目を欠核化した。ブタとウシの目は、犠牲の6時間以内に地元の食肉処理場から得られ、氷の上の実験室に運ばれました。
1. 準備前
<ol><li>完全な培地(DMEM/ハムのF12は10%胎児ウシ血清(FBS)、80 U/mLペニシリン/80 μg/mLストレプトマイシン、2.5 μg/mLアンホテリシンBを補充します。37°Cの水浴で、培地、1x PBS、0.25%のトリプシン(必要に応じて)を熱します。</li>
	<li>無菌の作業場所を準備するためにフードに無菌ドレープを入れてください。フード内に必要なすべての滅菌器具と材料を導入します。 注:目の核分裂と残りの筋肉組織および皮膚の洗浄のみがフードの外側で行われる処置であり、残りのステップはフードの内部で行われなければならない。</li>
</ol>2. ラット/マウス PE 細胞の分離
<ol><li>湾曲したはさみと大腸菌の鉗子を使用して、動物を安楽死させた後に目を引き起めます。残りの筋肉組織と皮膚をハサミや鉗子(非無菌)で目からきれいにします。 注:眼の核化と洗浄に使用されるはさみと鉗子の大きさは、種によって異なります(例えば、ラットとマウスの場合、器具は豚や牛に使用されるものよりも小さくなります) ( 図S1を参照)。<ol>
<li>無菌PBSで満たされた50 mLチューブに目を集め、チューブを層流フードに移します。ヨウ素ベースの溶液中に2分間水没して目を消毒し、滅菌PBSを充填したペトリ皿に移します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>電球の開口部<ol>
<li>無菌ペトリ皿に目を移した後、大腸菌または尖った鉗子で視神経の近くにしっかりと1つを保持します。虹彩の限界付近に穴を開け(パープラナとオラセラタの間)に18Gの針を入れます。穴に小さなはさみを挿入し、虹彩の周りにカットします。前セグメント(角膜、レンズ、アイリス)を取り除き、ペトリ皿に入れます。RPE細胞が分離されるまで、球根にガラス膜を残します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>IPE細胞の分離<ol>
<li>レンズを取り外し、細かい鉗子でIPE細胞を含む虹彩を繊細に引き出します。ペトリ皿に虹彩を入れ、滅菌PBSで洗い、より多くの虹彩が準備されるまでPBSに残します。</li>
		<li>その日に準備するすべての目のためにステップ2.2.1から2.3.1を繰り返します。</li>
		<li>虹彩あたり0.25%のトリプシンを50μL加え、37°Cで10分間インキュベートします。 トリプシンを取り外し、虹彩あたり150μLの完全な媒体を加え、平らな火で磨かれたパスツールピペットでIPEを繊細に削ります。組織を固定するために細かい鉗子を使用してください。細胞懸濁液を回収し、1.5mLチューブに入れます。細胞懸濁液の10 μLを1:3にトリパンブルーで希釈して、ノイバウアーチャンバー34,35内の細胞を数えます。</li>
		<li>すぐにトランスフェクションしない場合、24ウェルプレート(100,000細胞/cm2)に200,000個の細胞/ウェルを完全培地の1mL(10%FBS)で播種(シード用表1参照)。プレートをインキュベーターに入れ、37°C、5%CO2で培養します。 注: シード処理に十分なセルを持つには、いくつかの目をプールする必要があります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>RPE細胞の分離<ol>
<li>薄い鉗子の後部の区分からビトレウスのユーモアおよび無神経を取除く。網膜色素上皮に損傷を与えないようにしてください。</li>
		<li>地球を完全に開いて、滅菌PBSで洗浄するために#10メスでセグメントを半分にカットします。</li>
		<li>1眼あたり0.25%のトリプシンを50μL加え、37°Cで10分間インキュベートします。 トリプシンを取り外し、1球当たり150μLの完全な培地を加え、丸いメスでRPE細胞を繊細に削ります。組織を固定するために細かい鉗子を使用してください。細胞懸濁液を回収し、1.5mLチューブに入れます。細胞懸濁液を10μLとします。1:4をトリパンブルーで希釈し、ノイバウアー室の細胞を数えます。</li>
		<li>ステップ 2.3.4 を参照してください。 注: シード処理に十分なセルを持つには、いくつかの目をプールする必要があります。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. ウサギPE細胞の分離
<ol><li>手順 2.1 ~ 2.1.1 の手順で説明されているように、クリーニングと消毒を実行します。</li>
	<li>滅菌ガーゼの圧縮に片目を置き、視神経の近くにしっかりと保持します。メス#11で目を開け、手足の下に約2mmのはさみがあります。前セグメント(角膜、レンズ、アイリス)を取り除き、ペトリ皿に入れます。RPE細胞が分離されるまで、球根にガラス膜を残します。</li>
	<li>IPE細胞の分離<ol>
<li>ステップ 2.3.1 を実行します。メス#10で切断することにより、虹彩から毛様体を取り除きます。</li>
		<li>2アイリスの調製後、1mLの0.25%トリプシンを37°Cで10分間インキュベートします。この間、RPE細胞は単離することができます(ステップ3.4を参照)。トリプシンを取り除き、虹彩に1mL完全な媒体を加え、平らな火で磨かれたパスツールピペットで慎重に引っ掻いて細胞を分離します。ピペット処理により細胞を慎重に再懸濁し、細胞懸濁液を1.5mLチューブに移します。細胞懸濁液を10μLとし、トリパンブルーで1:3を希釈してノイバウアーチャンバー内の細胞を数えます。</li>
		<li>ステップ 2.3.4 を参照してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>RPE細胞の分離<ol>
<li>ステップ 2.4.1 を実行します。</li>
		<li>12ウェルプレートに滅菌ガーゼを入れ、ガーゼの上に電球を置きます。</li>
		<li>PBSで洗浄し、ステップ2.4.3を実行します。 注:湾曲した火磨きパスツールピペットを使用してください。</li>
		<li>細胞を120×gで10分遠心分離する。</li>
		<li>ステップ 2.3.4 を参照してください。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 豚PE細胞の単離
<ol><li>ステップ2.1の説明に従ってクリーニングを行います。PBSで洗浄し、ヨウ素ベースの溶液中に2分間水没して目を消毒し、PBSで洗い流します。ステップ 3.2 に進みます。</li>
	<li>IPE細胞の分離<ol>
<li>ステップ 3.3.1 を実行します。2アイリスの調製後、完全な培地の1 mLを加え、平らな火磨きパスツールピペットで慎重に掻いて細胞を分離します。細胞懸濁液を1.5mLチューブに移します。細胞懸濁液を10μLとし、トリパンブルーで1:4を希釈してノイバウアーチャンバー内の細胞を数えます。</li>
		<li>ステップ 2.3.4 を参照してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>RPE細胞の分離<ol>
<li>ステップ 2.4.1 を実行します。ペトリ皿に電球を入れ、PBSで洗います。1 mL 完全な培地で電球を満たします。</li>
		<li>湾曲した火で磨かれたパスツールピペットを使用して、RPE細胞を慎重に除去します。チョロイド・ブルッフの膜複合体の滑り落ちを避けるために、下から上に削るようにしてください。1,000 μL ピペットを使用して電球内のセル懸濁液を回収し、1.5 mL チューブに移して再懸濁します。細胞懸濁液を10μLとし、トリパンブルーで1:8を希釈してノイバウアーチャンバー内の細胞を数えます。</li>
		<li>ステップ 2.3.4 を参照してください。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. ウシPE細胞の単離
<ol><li>ステップ2.1の説明に従ってクリーニングを行います。PBSで洗浄し、ヨウ素ベースの溶液中に2分間水没して目を消毒し、PBSで洗い流します。ステップ 3.2 に進みます。</li>
	<li>IPE細胞の分離<ol>
<li>ステップ 3.3.1 を実行します。2つのアイリスを調製した後、37°Cで0.25%トリプシンの2 mLで10分間インキュベートします。この間、RPEセルは単離することができます(ステップ5.3を参照)。</li>
		<li>トリプシンを取り除き、虹彩に2mL完全な媒体を加え、平らな火で磨かれたパスツールピペットで慎重に引っ掻いて細胞を分離します。細胞懸濁液を15mLチューブに移します。細胞を120×gで10分遠心分離する。細胞懸濁液を10μLとし、トリパンブルーで1:4を希釈してノイバウアーチャンバー内の細胞を数えます。</li>
		<li>すぐにトランスフェクションしない場合、完全培地(10%FBS)の3mLで6ウェルプレートに320,000個の細胞/ウェルをシードする(シードについては表1参照)。プレートをインキュベーターに入れ、37°C、5%CO2で培養します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>RPE細胞の分離<ol>
<li>ステップ 2.4.1 に従ってください。ペトリ皿に電球を入れ、PBSで洗います。2目を準備した後、トリプシンで約3/4の電球を充填し、球根の上にペトリ皿の蓋を37°Cで25分間インキュベートします。</li>
		<li>トリプシンを取り外し、1 mL完全な培地を追加します。ステップ 4.3.2 を実行します。細胞を120×gで10分遠心分離する。</li>
		<li>ステップ 5.2.3 を参照してください。</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 栽培 - 中程度の変化
<ol><li>DMEM/HamのF12で細胞を培養し、10%FBS、80 U/mLペニシリン/80μg/mLストレプトマイシン、2.5 μg/mLアンホテリシンBを加湿インキュベーターで37°C、5%CO2で培養します。3-4日後にピペットを上下にして非接着細胞を収集し、ボリュームの半分を別の井戸に入れます。完全な媒体で1 mLまで満たします。 注: これにより、すべてのセルが接続して出力を最大化するのに十分な大きさのサーフェスを使用できます。</li>
	<li>さらに3〜4日後に細胞の採取を繰り返しますが、今回は2つのウェルから1つのウェル(例えば、C1のA1+B1)に非接着細胞をプールすることによって。すべての井戸にミディアムを追加します。細胞を観察し、週に2回培地を変更します(6ウェルプレートと24ウェルプレートで3mL/wellを使用)。細胞が合流に達したら、1%FBSで培地を完成するか、実験(例えば、トランスフェクション)のために細胞を使用する。 注:RPE細胞とIPE細胞は、それぞれ3-4後、および4〜5週間後にコンフルエントです。細胞培養純度を、Johnenたちの研究グループ36が述べたように細胞形態(色素細胞)および特異的マーカーを確認して裏付けた。</li>
</ol>7. 一次PE細胞のエレクトロポレーション
<ol><li>1,37の前に説明したようにエレクトロポレーションを行う。</li>
	<li>トランスフェクトされた細胞の数に応じて、抗生物質や抗ミコティックを使用せずに培地に細胞を播種するために6-、24-または48ウェルプレート( 表2を参照)を使用します。次の2週間はペニシリン(80 U/mL)、ストレプトマイシン(80 μg/mL)、アンホテリシンB(2.5 μg/mL)を含む培地を週2回添加します。トランスフェクション後2週間で培地を完全に交換する。</li>
	<li>細胞増殖、トランスフェクション効率、タンパク質分泌を判定するには、顕微鏡で細胞を週1回監視し、ウェスタンブロットで細胞培養上清を分析します。培養終了前に、ELISAによるタンパク質分泌を定量化し、細胞を数え、画像ベースのサイトメトリー (Venus-トランスフェクト細胞の場合)による蛍光を測定し、製造者の指示に従って細胞ペレットを回収し、RT-qPCRベースの遺伝子発現解析用 の細胞ペレットを採取します。 注: これらの方法は、細胞の分析を詳細に説明する目的ではなく、むしろその分離を説明する目的であるため、本論文には含まれていません。細胞の播種密度は全ての種(10万個の細胞/cm2)で同じであるが、単離された細胞の数が異なるため、異なるプレートを用いた。また、マウス、ラット、ウサギの場合、播種に十分な細胞を持つために2〜3個の目をプールする必要があるかもしれません。</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>種</td>
			<td>トリプシン治療</td>
			<td>N° IPE セル</td>
			<td>N° RPE細胞</td>
			<td>播種用プレート(100,000細胞/cm2)</td>
		</tr>
<tr>
<td>マウス/ラット</td>
			<td>はい</td>
			<td>~50,000</td>
			<td>~150,000</td>
			<td>24ウェルプレート</td>
		</tr>
<tr>
<td>兎</td>
			<td>はい</td>
			<td>~350,000</td>
			<td>~2,500,000</td>
			<td>24ウェルプレート</td>
		</tr>
<tr>
<td>豚</td>
			<td>いいえ</td>
			<td>~1,000,000</td>
			<td>~3,000,000</td>
			<td>24ウェルプレート</td>
		</tr>
<tr>
<td>牛</td>
			<td>はい</td>
			<td>~1,700,000</td>
			<td>~5,000,000</td>
			<td>6ウェルプレート</td>
		</tr>
</tbody></table>表1:異種の眼から単離された一次PE細胞の数。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>名前</td>
			<td>面積</td>
			<td>ボリュームメディア</td>
			<td>トリプシン</td>
			<td>トリプシンの動作を停止するボリューム媒体</td>
			<td>シード密度</td>
		</tr>
<tr>
<td>6ウェルプレート</td>
			<td>9.6 cm²</td>
			<td>3.0 mL</td>
			<td>0.5 mL</td>
			<td>1.0 mL</td>
			<td>3x105
</td>
		</tr>
<tr>
<td>24ウェルプレート</td>
			<td>2.0 cm²</td>
			<td>1.0 mL</td>
			<td>0.2 mL</td>
			<td>0.8 mL</td>
			<td>5x104
</td>
		</tr>
<tr>
<td>48ウェルプレート</td>
			<td>1.1 cm²</td>
			<td>0.5 mL</td>
			<td>0.1 mL</td>
			<td>0.4 mL</td>
			<td>0.5-1x104
</td>
		</tr>
</tbody></table>表2:細胞培養量と播種密度

著者らは開示するものは何もない。

PE細胞を単離し培養するための標準化された方法を持つことは、レチン性変性疾患に対する新しい治療法の開発の基本です。ここで提示されるプロトコルでは、PE細胞は異なる種から正常に分離され、長期間培養することができます(これまで、最長の培養は2年間1、38年維持されていました)。典型的なPE細胞形態、色素沈着および機能が観察された(図1、図2)。特に純粋なRPE培養では、神経の細胞との汚染を避けるために完全にレティナを抽出することが重要であることに注意してください。IPE細胞の場合、毛様体は、プロトコルで説明されているように虹彩から除去されるべきである。細胞の合流は比較的短時間(〜21日)で達成され、その後、細胞は治療遺伝子でトランスフェクションしたり、他の実験で使用したり(例えば、毒性物質、タンパク質への暴露)する準備が整う。さらに、プロトコルは、前臨床インビトロおよびインビボ</...

我々のグループは、RPEおよびIPEベースの非ウイルス遺伝子治療による神経レチン系変性、すなわちAMDを治療するための再生アプローチの開発に焦点を当てている。このような治療法の前臨床確立は、ヒトに移管可能な 体外モデルで 必要とされる。したがって、ここで示す研究の目的は、一次RPEおよびIPE細胞の分離、培養、および遺伝子工学のためのプロトコルを提供することです。複数の種からPE細胞を単離する根拠は、アプローチの安全性と効率を強固に確認し、その再現性と移動性を高めることです。利用可能なヒトRPE細胞株ARPE-19は、一次細胞とは異なり(例えば、それらは、あまり色素沈着性)であり、したがって、臨床前の分析のための限られた値の1。さらに、非ヒト哺乳類細胞は、より少ないコストで、より大きな量で購入することができます。ヒトドナー組織は様々なアイバンクから得ることができますが、入手可能性は限られており、高価です。最後に、新しい先端治療薬品(ATMP、すなわち、細胞、組織、または遺伝子治療薬品)は、患者で試験される前に少なくとも2つの異なる種で適用する必要があり、これらの インビボ 研究は、同種細胞移植の準備を要求する。
網膜神経変性疾患は、AMDのような一般的な疾患だけでなく、網膜細胞死が最終的に失明につながる網膜色素変性症のような稀な疾患を含む先進国の失明の主な原因である。RPE細胞、光受容体、およびRetinal神経節細胞(RGC)の損傷は、場合によっては遅くなる可能性がありますが、現在のところ治療法はありません。ATMPは、遺伝子欠損を修正したり、治療遺伝子を統合したり、脱退細胞を置き換えたりする可能性を提供し、AMDなどの疾患に対する再生および治癒療法の開発を可能にする。13遺伝子治療は、RPE65変異関連のレチン性変性2、3を治療するための治療法を含むマーケティング承認を既に得ている。高齢者(>60歳)の間で、世界中で約3,000万人が新血管(nvAMD)または血管(aAMD)AMD4の影響を受けます。両方の形態は、酸化的損傷、機能障害およびRPE細胞の喪失を含む年齢関連の誘発によって誘発され、その後に光受容体分解が続き、とりわけ(例えば遺伝的リスク対立遺伝子、喫煙、高血圧)5、6。nvAMDでは、病因は脈絡膜新生血管形成を誘導する血管形成血管内皮成長因子(VEGF)を支持する血管新生および抗血管新生因子の不均衡によって悪化する。現在までに、NVAMDだけが、CNVを抑制するためにVEGFタンパク質の阻害剤の毎月のビトリアル内注射によって治療可能である。aAMD6,7に対する有効な治療法はまだありません。
いくつかの研究は、抗VEGF療法に代わる細胞ベースの治療法を評価した:バインダーらによって行われた研究は、採取したばかりの自家RPE細胞がnAMD8、9、10の患者に移植されたが、適度な視力改善を示したが、患者の小さなグループだけが読み取りを可能にするのに十分な高い最終的な視力に達した。最近、第I相臨床試験では、胚性幹細胞由来RPEパッチを使用してAMDを有望な結果で治療しました。すなわち、11を治療した10人の患者のうち2人で最大12ヶ月間のRPEパッチの有効性、安定性、安全性。さらに、いくつかのグループは、自家RPE-ブルッフの膜-脈絡膜パッチが末梢性のレチナから収穫され、黄斑12、13、14に移植された研究を発表している。そして、移植用に誘導多能性幹細胞(iPSC)由来のRPEパッチが生成された。aAMDの場合、補体経路を標的とする抗体は、臨床試験6、16および地理的萎縮(GA)を有する患者における因子CD59(AAVCAGsCD59)の遺伝子をコードするアデノ関連ウイルス(AAV)ベクターの単一のウイルス内注射を用いた第I相試験で試験された。フェーズIIの研究は最近始まり、高度なaAMDを有する132人の患者を募集し、介入後2年間で結果を評価することを目指しています18.最後に、FocuS研究グループは、ヒト補体因子19をコードする組換え非複製AAVベクターの安全性、用量応答および有効性を評価する第I/II多施設臨床試験を開始した。
主に、再生AMD療法の目的は、損傷または失われた機能的RPE細胞の移植である。しかし、IPE細胞とRPE細胞は多くの機能的および遺伝的類似性(例えば、貪食およびレチノール代謝)を共有し、かつIPE細胞がより実現可能に収穫されるため、RPE代替20として提案されている。IPE細胞移植が動物モデル21,22における感光体変性を遅らせるということは以前に実証されているが、末期nvAMD患者では視覚機能を安定化させるが、これらの患者23では有意な改善は認められなかった。有効性の欠如は、移植細胞の数が少ないこと、および/または神経保護性の疾患の不均衡に起因する可能性があります。別のアプローチは、網膜ホメオスタシスを回復させ、残りのRPE細胞を維持し、変性から光受容体とRGCを保護するために神経保護因子を過剰発現するトランスフェクト色素上皮細胞を移植することです。その結果、PEDF、GM-CSF、インスリン様成長因子(IMF)などの神経保護タンパク質および抗血管新生タンパク質を分泌するために遺伝子工学を受けた機能RPEまたはIPE細胞の移植を含む新しい治療法を提案する。細胞株を使用する代わりに、いくつかの種、1つの種、またはヒト組織でこのアプローチを開発し分析する利点は:1)独立した実験室および異なる種1、24、25で実現された多数の研究によって示されるように結果の再現性および伝達可能性の増加;2)豚やウシの細胞は、追加の動物の犠牲なしで実現可能に使い捨て;3)特に豚やウシの細胞の可用性は、堅牢な結果を生成するために大規模なテストシリーズを可能にします。4)大部分が使用されるモデルから細胞を単離、培養、遺伝的に改変する知識は、複数の種24、25、26で生体内解析を可能にし、最初に治療された患者に対して改善されたリスクベネフィット比を提供する。5)提示されたプロトコルの柔軟性は、様々なモデルや実験的なセットアップで、および遺伝子工学の有無にかかわらずすべての眼球ベースの治療法でその使用を可能にする。対照的に、細胞株またはヒト組織としての代替技術は、限られた転写性および/または限定的な解位性のみのものである。ARPE-19のような細胞株は予備実験に理想的である;しかし、低色素沈着と高増殖は、初等細胞1とは大きく異なる。ヒトドナー組織から分離されたRPEおよびIPE細胞は、転写可能なインビトロ実験のための貴重な供給源を提供する。しかし、米国系アメリカ人の眼バンクからヒト組織を取得すると、組織は少なくとも2日齢(核分裂後)であり、長く高価な輸送が必要ですが、局所ドナー組織は生産的な研究のために十分な量では利用できません。原細胞の使用の利点は、他のグループ27,28からの複数の研究によって確認される。
PEDFおよび/またはGM-CSFをコードする遺伝子を用いて一次RPEおよび/またはGM-CSFをコードする遺伝子を用いたSB100Xトランスポゾンシステムを用いた細胞ベースの非ウイルス遺伝子治療の開発のために、それぞれ29、30、31、32、ARPE-19細胞のトランスフェクションを確立しました。.次に、容易にアクセス可能なウシおよびブタの原発細胞に単離およびトランスフェクションプロトコルが確立された。現在、小さな(マウスとして)から大型哺乳類(牛)まで、5種の異なる種から一次RPE細胞とIPE細胞の単離とトランスフェクションが確立されました。ヒトドナー眼30に由来する一次RPEおよびIPE細胞で確認した。ATMPの良い製造慣行(GMP)準拠の生産は、人間のドナー組織を使用して検証されました33.最後に、アプローチの安全性と効率の両方を、プロトコルが適応された3つの異なる種(マウス、ラット、ウサギ)でin vivoで評価しました。臨床セットアップでは、虹彩生検が患者から採取され、IPE細胞はクリーンルームで単離され、トランスフェクションされ、細胞が同じ患者に下無しに移植される。プロセス全体は、約60分間続く単一の外科セッション中に行われます。治療アプローチの開発とその効率の評価は、堅牢で効率的な遺伝子送達方法を実装し、遺伝子送達の効率を分析し、治療タンパク質産生および神経保護効果を分析し、生体内1、24、25、29、30のアプローチをテストするための細胞移植を行うために、優れたin vitroおよびex vivoモデルを要求しました。.この療法は、ジュネーブ州(2019-00250)の研究のための倫理委員会からの臨床段階Ib/IIa試験の倫理的承認を有し、現在、スイスの規制当局によって承認のために要求された最後の前臨床データが提示されたプロトコルを使用して収集されることを言及する価値があります。この点に関して、生体内データの前臨床はCNVの有意な減少および優秀な安全24、25、31を示した。
ここでは、ウシ、ブタ、ウサギ、ラットおよびマウスからのRPE/IPE細胞の単離および培養、および効率的な遺伝子送達方法としてエレクトロポレーションと組み合わせた統合型 SB100X トランスポゾンシステムの使用について説明する。特に、原発PE細胞は、過剰発現PEDFおよびGM-CSFにトランスフェクションした。これらのプロトコルのコレクションはATMPの開発のすべての前臨床段階で実施される in vitro および in vivo の研究を可能にする。さらに、セットアップは、関心や疾患の他の遺伝子に適応する可能性を有する。

<table><tbody><tr><td>12ウェルプレート</td><td>コーニング</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>24ウェルプレート</td><td>コーニング</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>48ウェルプレート</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>150687</td><td></td></tr><tr><td>6ウェルプレート</td><td>グライナー</td><td>7657160</td><td></td></tr><tr><td>ベタジン</td><td>ムンディファーマ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ボンマイクロ鉗子フラット</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Colibri鉗子(無菌)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CytoTox-Glo細胞毒性アッセイ</td><td>Promega</td><td>G9291</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/Ham's F12</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8062</td><td></td></tr>ド<tr><td>レープ(無菌)</td><td>M&ouml;lnlycke ヘルスケア</td><td>800530</td><td></td></tr><tr><td>エレクトロポレーション緩衝液 3P.14</td><td>3P 医薬品</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Brunschwig</td><td>P40-37500</td><td></td></tr><tr><td>鉗子 (サイズ違い) (滅菌)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>ガーゼ圧縮</td><td>PROMEDICAL AG</td><td>25403</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (0.9%)</td><td>Laboratorium Dr. Bichsel AG</td><td>1000090</td><td></td></tr><tr><td>針(18G)&nbsp;</td><td>テルモ</td><td>TER-NN1838R</td><td></td></tr><tr><td>ネオントランスフェクションキット 10 & micro;L</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>MPK1096</td><td></td></tr><tr><td>ネオントランスフェクションシステム</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>MPK5000S</td><td></td></tr><tr><td>ノイバウアーチャンバー</td><td>マリエンフェルト・スーペリア</td><td>640010</td><td></td></tr><tr><td>パスツールピペット(ファイヤーポリッシュ)</td><td>Witeg</td><td>4100150</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781-100</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital (Thiopental Inresa)</td><td>Ospedalia AG</td><td>31408025</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>150288</td><td></td></tr><tr><td>pFAR4-PEDF</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pFAR4-SB100X</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pFAR4-Venus</td><td></td><td></td><td>Pastor et al., 2018.Scherman教授とMarie教授による</td></tr>提供:<tr><td>pSB100X (250 ng/&micro;L)</td><td></td><td></td><td>M&aacute;t&eacute;Sら、2009年。Izsvak</td></tr><tr><td>pT2-CAGGS-Venus</td><td></td><td></td><td>Johnen et al., 2012</td></tr><tr><td>pT2-CMV-GMCSF-His プラスミド DNA (250 ng/&micro;L)</td><td></td><td></td><td>当研究室でクローニングした</td></tr><tr><td>pT2-CMV-PEDF-HisプラスミドDNA(250 ng/&micro;L)</td><td></td><td></td><td>Pastor et al., 2018</td></tr><tr><td>scarpel no. 10</td><td>Swann-Morton</td><td>501</td><td></td></tr><tr><td>scarpel no. 11</td><td>Swann-Morton</td><td>503</td><td></td></tr><tr><td>Sharp-sharp tip curved Extra Fine Bonn Scissors (sterile)&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>シャープシャープチップストレート 極細ボンハサミ(滅菌)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>タリ画像処理サイトメーター</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>T10796</td><td></td></tr>トリ<tr><td>プシン0.25%&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>25050014</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン5%/ EDTA 2%</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>T4174</td><td></td></tr><tr><td>バンナススプリングシザー湾曲(滅菌)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

非ウイルス遺伝子治療のための哺乳動物一次色素上皮細胞の単離、培養、遺伝子工学

Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy

加齢黄斑変性症(AMD)は、患者>60年の失明の最も頻繁な原因であり、世界中で約3000万人に影響を及ぼします。AMDは環境や遺伝的要因の影響を受ける多因子性疾患であり、網膜色素上皮(RPE)細胞の変性に続いて感光体分解による網膜の機能障害を引き起こします。理想的な治療法には、RPE細胞死および感光体変性を防ぐために神経保護因子を分泌する健康なRPE細胞の移植が含まれる。機能的および遺伝的類似性と、より侵襲性の低い生検の可能性のために、虹彩色素上皮(IPE)細胞の移植が退化したRPEの代用として提案された。低い数の網膜移植細胞による神経保護因子の分泌は、睡眠美容(SB100X)、色素上皮由来因子(PEDF)および/または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)をコードする遺伝子を用いたトランスポゾン媒介性トランスフェクションによって達成することができる。げっ歯類、豚、牛など様々な種のRPE細胞とIPE細胞の分離、培養、SB100X媒介トランスフェクションを確立しました。地球儀は植え付けされ、角膜とレンズは虹彩と眼炎にアクセスするために除去される。カスタムメイドのヘラを使用して、IPE細胞は単離された虹彩から除去される。RPE細胞を収穫するには、種に応じてトリプシンインキュベーションが必要になることがあります。次いで、RPEカスタマイズされたヘラを使用して、細胞を培地に懸濁させる。播種後、細胞を週2回監視し、合流に達した後、エレクトロポレーションによってトランスフェクトする。遺伝子の一体化、発現、タンパク質分泌、および機能は、qPCR、WB、ELISA、免疫蛍光、および機能アッセイにより確認された。種に応じて、30,000-5百万(RPE)および10,000-150万(IPE)細胞を1眼で単離することができます。遺伝子組み換え細胞は、酸化ストレスを軽減する能力を持つ重要なPEDF/GM-CSF過剰発現を示し、遺伝子治療アプローチを開発するためにヒトに移入可能なex vivo分析および生体内研究のための柔軟なシステムを提供する。

異種哺乳類からのPE分離 前述のプロトコルを用いて、IPE細胞とRPE細胞を5種分から正常に単離し、培養した。各手順から得られる細胞の数は、眼の種や大きさに依存する(表1)。図1に示すように、細胞は典型的なPE細胞の形態および色素沈着を示す(示されたウサギ細胞を除く、アルビノニュージーランドホワイト(NZW)ウサギ由来である)。21日後の分離では、細胞はコンフルエントであり、さらなる実験(例えば、トランスフェクション)に使用する準備ができている。なお、全ての種の培養物は、正常形態および安定したトランスジーン発現を確認して、さらに2年まで監視および制御される(データは示さない)。
脱分化、細胞ストレス、および遺伝子発現の変化は、RT-qPCRおよび免疫体系化学によって除外された。遺伝子のパネル(VEGF、CRALBP、CATD、ZO-1、KRT8)は、トランスフェクトされたヒトRPE細胞(ARPE-19細胞)で分析し、正常RPE発現パターン<sup c...

ここでは、種々の哺乳動物(マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ)から一次虹彩および網膜色素上皮細胞を単離およびトランスフェクトするプロトコルが提示される。この方法は、ヒトに移管可能なエクスビボ分析およびインビボ研究のための様々なセットアップにおける眼遺伝子治療アプローチを研究するのに理想的である。

Age-related macular degeneration (AMD) is the most frequent cause of blindness in patients &#62;60 years, affecting ~30 million people worldwide. AMD is a ...

このプロトコルは、様々なセットアップで眼遺伝子治療を研究するための最適なシステムとして、5つの哺乳類からの色素上皮細胞の単離およびトランスフェクションを示すため、有意である。この方法の主な利点は、その柔軟性、転写性、高い細胞収率、生存率およびトランスフェクション率が5種および非ウイルス性SB100Xトランスポゾンシステムに使用される。これらの技術は、本プロトコルで単離され、トランスフェクトされている網膜および虹彩色素上皮細胞を標的とした遺伝子治療アプローチを研究するために開発されたが、任意の眼の研究に使用できる。手順を実証するグレッグ・シーリー、研究室の技術者になります。動物を安楽死させた後、湾曲したはさみと大腸菌の鉗子を使って目を引き、残りの筋肉組織と皮膚を目からきれいにします。無菌PBSで満たされた50ミリリットルのチューブに目を集め、チューブを層流フードに移します。ヨウ素系溶液に2分間水没して消毒し、滅菌PBSで満たされた50ミリリットルのチューブに目を移します。滅菌ガーゼの圧縮に片目を置き、眼を視神経の近くにしっかりと保持します。その後、11番メスで虹彩の限界付近にカットします。はさみを使用して、虹彩の周りにカットし、前セグメントを取り除き、ペトリ皿に入れ、網膜色素上皮、またはRPE細胞が単離されるまで、球根をビトリウスに残します。虹彩色素上皮、またはIPE細胞を単離するには、細かい鉗子でレンズを取り外し、IPE細胞を含む虹彩を繊細に引き抜きます。ペトリ皿に虹彩を入れ、滅菌PBSで洗います。0.25%トリプシンの500マイクロリットルを加え、摂氏37度で10分間インキュベートします。トリプシンを取り外し、500マイクロリットルの完全な媒体を加え、平らで火を磨いたパスツールピペットでIPEを繊細に削ります。細胞懸濁液を回収し、1.5ミリリットルのチューブに入れます。ノイバウアーチャンバーを使用して細胞を数え、完全な培地の1ミリリットルで24ウェルプレートにウェルあたり0.2百万個の細胞を播種します。プレートをインキュベーターに入れ、摂氏37度と二酸化炭素5%で培養します。RPE細胞を単離するには、薄い鉗子を持つ後部セグメントからビトレウスユーモアとレチナを取り除きます。24ウェルプレートに電球を入れ、1眼あたり0.25%トリプシンの500マイクロリットルを加え、摂氏37度で10分間インキュベートします。トリプシンを取り除き、1球当たり500マイクロリットルの完全な媒体を加え、湾曲した火で磨かれたパスツールピペットでRPE細胞を繊細に削ります。細胞懸濁液を回収し、1.5ミリリットルのチューブに入れます。ノイバウアーチャンバーを使用して細胞を数え、前述のように細胞を播種します。プレートをインキュベーターに入れる。目から残った筋肉組織と皮膚をきれいにし、ヨウ素ベースの溶液で目を消毒し、PBSで洗いすります。IPE細胞を単離するには、レンズを取り外し、前述のように虹彩を引き抜きます。2つのアイリスを調製した後、完全な媒体の1ミリリットルを追加し、平らな、火で磨かれたパスツールピペットで掻いて細胞を分離し、その後、細胞を数えて播種します。プレートをインキュベーターに入れる。RPE細胞を単離するには、後部セグメントからビトリスとレチナを取り除き、ペトリ皿に電球を入れます。電球に1ミリリットルの完全な媒体を入します。湾曲した火で磨かれたパスツールピペットを使用して、RPE細胞を取り除きます。1,000マイクロリットルピペットを使用して電球内の細胞懸濁液を回収し、1.5ミリリットルのチューブに移して再懸濁します。次に、細胞を数えて播種し、先に示したようにプレートをインキュベートします。クリーニング後、目を開けて虹彩の周りを切って前のセグメントを取り除き、ペトリ皿に入れます。RPE細胞が分離されるまで、球根にガラス膜を残します。IPE細胞を単離するには、レンズに前セグメントが付属している場合は、レンズを取り外し、細かい鉗子を使用してIPE細胞を含む虹彩を繊細に引き抜きます。ペトリ皿に虹彩を入れ、滅菌PBSで洗います。メス番号10で毛様体を切ります。アイライズを準備した後、摂氏37度で0.25%トリプシンの2ミリリットルで10分間インキュベートします。トリプシンを取り出し、完全な媒体の2ミリリットルを追加し、平らな、火で磨かれたパスツールピペットで傷ついて細胞を分離します。細胞懸濁液を2ミリリットルチューブに移し、120倍G.上清を捨て、完全な培地の2ミリリットルで細胞を再懸濁して10分間遠心分離します。完全な培地の3ミリリットルで6ウェルプレートでウェルあたり0.32百万細胞をシード。プレートをインキュベーターに入れ、摂氏37度と二酸化炭素5%で培養します。RPE細胞を単離するには、鉗子を持つ後部セグメントからビトレウスユーモアとレチナを取り除きます。網膜色素上皮に損傷を与えないようにしてください。PBSで電球を洗います。両眼を準備した後、約4分の3の電球をトリプシンで満たし、電球の目の上にペトリ皿の蓋をして摂氏37度で25分間インキュベートします。トリプシンを取り出し、完全な媒体の1ミリリットルを追加します。湾曲した火で磨かれたパスツールピペットを使用して、RPE細胞を取り除きます。電球内の細胞懸濁液を回収し、1.5ミリリットルチューブに移して再懸濁します。完全な培地の3ミリリットルの6ウェルプレートで120倍G.Seed 0.32万細胞で10分間細胞を遠心分離する。プレートをインキュベーターに入れ、摂氏37度と二酸化炭素5%で培養します。加湿インキュベーターで37°C、炭酸ガス5%で細胞を培養します。3〜4日後、ピペットを上下にして非接着細胞を採取し、体積の半分を別の井戸に入れます。完全な媒体で1ミリリットルに井戸を充填します。さらに3〜4日後、細胞採取を繰り返し、今度は非接着性細胞を2つのウェルから1つにプールする。すべての井戸にミディアムを追加します。細胞を観察し、週に2回培地を変更します。セルが合流に達したら、1%FBS で完全な培地に切り替えます。前述のプロトコルを用いて、IPE細胞とRPE細胞を5種分から正常に単離し、培養した。RPE発現パターンは、RPE65の免疫蛍光によって一次ウシIPE細胞で確認された。細胞生存率は、市販の細胞毒性アッセイキットおよび結び目電気ポレート制御を用いてエレクトロポレーションバッファーの潜在的毒性を排除することを検討した。細胞生存率への影響は認められない。異種由来の前培養された色素上皮細胞を、黄色蛍光金タンパク質にトランスフェクトした。トランスフェクトされたRPE19細胞を陽性対照として使用した。前培養ブ豚RPEにおけるトランスフェクション効率の定量をここに示す。新たに単離されたウサギ色素上皮細胞を黄色蛍光タンパク質Venusにトランスフェクトし、顕微鏡検査でモニタリングした。色素上皮細胞を色素上皮由来因子とトランスフェクトし、ウェスタンブロットによりタンパク質分泌をモニターした。トランスフェクト細胞のシグナルは、研究対象のすべての種および日に対して非トランスフェクト細胞と比較して高く、この時間内にタンパク質分泌の減少は認められなかった。鋭利なツールで細胞を削らないようにすることが重要です。ここでは、丸いメスを使用しなければならない小さなマウスの目を除いて、火磨きパスツールピペットが使用されます。色素上皮細胞は、遺伝子治療アプローチを開発し、例えば酸化ストレス損傷などの病理学的状態をシミュレートするために使用することができる。これらのモデルはまた、治療薬をテストするために使用することができます。

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Research

JoVE Journal

Biology

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非ウイルス遺伝子治療のための哺乳動物一次色素上皮細胞の単離、培養、遺伝子工学

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