集団運動属性を解析するためのマウス胚性口蓋前葉細胞の単離とタイムラプスイメージング
2021年2月13日
我々は、二次元(2D)成長および創傷修復アッセイのタイムラプスイメージングのための一次マウス胚口蓋間葉細胞の単離および培養のためのプロトコルを提示する。また、タイムラプスイメージングデータの解析方法を提供し、細胞流の形成と指向運動性を決定します。
このプロトコルにより、頭蓋顔面分野の研究者は、口蓋棚の上昇中に間葉リモデリングを理解する手段として、コントロール細胞と変異細胞の集団移動属性を定量的に比較することができます。一次マウス胚性口蓋間葉細胞およびタイムラプスイメージングの使用は、口蓋棚の上昇ダイナミクスを評価するためのアクセス可能なプロキシメソッドを提供する。マウス胚から口蓋殻を収穫するには、殺菌した穿孔スプーンを使用して、胚13.5日目の胚を、立体顕微鏡の下で無菌MEPM培養培地で満たされた無菌10センチメートル皿に入れる。
切断後、殺菌された細かいNo.5鉗子の1つの先端を頬のすぐ内側の口に挿入し、頭蓋骨の後ろから出るまで鉗子の先端を押し込みます。鉗子を向け、もう一方の腕が外耳道の上をホバリングしてから、鉗子をつまんでティッシュを切るようにします。頭の反対側の切開を繰り返し、下顎、舌、および頭蓋骨の下の部分が取り除かれるまでピンチカット手順を続け、口蓋棚を露出させる。
頭を横に置き、小さな無菌のステンレス製のはさみの先端を胚の目の高さ程度の頭蓋骨の前と後ろに置き、目のすぐ上を切って頭蓋骨の頭蓋骨を取り除き、平らな表面を作り出します。次に、皿の底に平らに置く優れた側面で頭を逆さまに置き、頭の前半分の中央溝の両側に2つの隆起した橋として見えるはずの口蓋棚を見つけます。皿に頭を固定するには、口蓋棚に頭の前部の鼻領域の近くの組織を通して細かい鉗子の一方の先端を挿入し、もう一方は頭蓋骨の後部の基部を通して口蓋棚に挿入する。
非常に鋭く、棚の側面の基部のティッシュに非常に鋭い、細かい鉗子の第二のペアの両方のポイントを挿入し、ゆっくりと慎重にティッシュを切断するためにピンチ。棚の内側表面の基部に沿って切開を繰り返し、棚の前部と後端の両方で棚を取り付けから頭に取り外し、棚を穏やかに持ち上げ、必要に応じて追加のピンチを作り、周囲の組織からシェルを完全に解放します。2番目の口蓋棚が同様に取り除かれた場合、滅菌プラスチック電球転写ピペットを使用して、氷上のPBSの約500マイクロリットルで無菌1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに棚を移します。
MEPM細胞培養をセットアップするには、すべての棚が採取された場合、組織を乱さずにPBSを吸引し、直ちに37度摂氏0.25%トリプシンの200マイクロリットルを口蓋棚組織の各チューブに加える。1,000マイクロリットルのピペットを使用して組織を数回短時間ピペットし、37°Cで10分間培養し、5分後に短時間ピペットします。インキュベーションの終わりに、各チューブに800マイクロリットルのMEPM培養培地を添加し、チューブを遠心して細胞を採取する前に、組織を再びピペットする。
上清を吸引した後、ペレットを1チューブあたり1ミリリットルの新鮮なMEPM培養培地に再懸濁し、1ウェルあたり2ミリリットルを含む6ウェル組織培養処理プレートの個々のウェルに細胞をプレートし、1ウェル当たり3ミリリットルの最終合計にプレート化し、細胞を滅菌細胞培養インキュベーターで12時間プラスチック表面に付着させる。2D集合移動アッセイを設定するには、分析するサンプルごとに約1ミリメートルの高さに1つの無菌2ウェルシリコーンインサートの上部を取り除き、滅菌鉗子を使用して、6ウェルプレートの個々のウェルの中心に短く無菌の2ウェルインサートをプレートします。すべてのエッジに沿って押し下げて、挿入物がウェルボトムに完全に接着され、細胞培養インキュベーター中の一晩インキュベートのために各インキュベートの各挿入物に40〜50マイクロリットルのMEPM培養液の合計体積で、短いシリコーン挿入物の1平方ミリメートル当たり300 MEPM細胞が完全に付着していることを確認します。
創傷修復アッセイを設定するには、無変無変の無菌2ウェルシリコーンインサートをサンプルあたり6ウェルプレートの1つのウェルの中央に配置し、挿入物の端をしっかりと押して培養プレートに取り付けます。次いで、1平方ミリメートル当たり400細胞を各挿入液中に100マイクロリットルのMEPM培地に投入し、細胞培養培地中で48時間培養した。2D集合的移動アッセイを行う場合、細胞を大きな培養皿に2ウェルシリコーンインサートに播種すると、通常、イメージングに優れた細胞密度が得られます。
35ミリメートル皿に入れた小さな3Dプリントリングも2D運動性解析に使用できます。創傷修復アッセイの場合、細胞は高い合流まで2ウェルシリコーンインサートで成長します。その後、インサートが除去され、創傷は閉鎖されるまで画像化されます。
MEPM軌道は持続性であり、細胞運動の方向は数時間維持される。平均変位対時間分析は、変位の形式での持続性が経過時間に比例していることを示します。運動性データの流れ解析では、共移動MEPM細胞クラスターのサイズは約300ミクロンである。
野生型と変異MEPM細胞の間には深い運動性の違いも認められる。この手順は、様々なトランスジェニックマウスラインで使用することができ、細胞の動きに対する効果を研究するために、様々な生化学的試薬でMEPM細胞を治療することができます。我々は、一次口蓋間葉細胞に焦点を当ててきたが、タイムラプスイメージングと定量分析は、動的発達過程における任意の運動細胞型の移動属性を探索するためにも使用することができる。
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概要
このプロトコルは、時間経過撮像のために一次マウス胚性口蓋間葉細胞の分離と培養について概説しています。これにより、頭顔面研究における集団移動属性の研究が容易になります。
主要な研究要素
科学分野
- 頭顔面生物学
- 細胞運動性
- 間葉細胞ダイナミクス
背景
- 口蓋棚上昇の理解は頭顔面発達において重要です。
- 一次マウス胚性口蓋間葉細胞はこれらのプロセスを研究するためのモデルとして機能します。
- 時間経過撮像により、時間経過での細胞挙動の観察が可能になります。
- 対照細胞と変異細胞間の比較分析により、間葉細胞リモデリングに関する洞察が得られます。
研究目的
- 口蓋間葉細胞における集団移動を定量的に評価すること。
- 細胞流形成と運動性を分析するための方法論を提供すること。
- 口蓋棚上昇に関与するダイナミクスの理解を深めること。
使用した方法
- 胚13.5日目のマウス胚から口蓋棚の分離。
- 顕微鏡下での精密な解剖のために滅菌済みの器具の使用。
- 最適な成長のためのMEPM培地で細胞の培養。
- 創傷修復アッセイ中の細胞挙動をモニターするための時間経過撮像。
主要な結果
- 一次口蓋間葉細胞の分離と培養の成功。
- 集団移動属性に関する定量データの取得。
- 方向性運動性と細胞流形成に関する洞察。
- 頭顔面生物学における将来の研究のための方法論の確立。
結論
- このプロトコルは、口蓋棚ダイナミクスを研究するための信頼できる方法を提供します。
- 時間経過撮像は細胞挙動の分析に効果的です。
- この研究結果は間葉細胞リモデリングの理解に貢献します。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This protocol enables quantitative assessment of collective cell movement in a disease-relevant system, providing a proxy model for studying mesenchymal remodeling during palatal shelf elevation. By isolating primary mouse embryonic palatal mesenchymal cells and applying time-lapse imaging, researchers can measure stream formation, shape alignment, and directional persistence to compare control and mutant phenotypes. The approach supports mechanistic de-risking in target validation by linking cellular behavior to developmental defects, offering predictive value for craniofacial disorder research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying collective movement attributes in control versus mutant MEPM cells.
- Operational Value: Provides a reproducible method to assess mesenchymal cell dynamics as a functional readout for target engagement.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by identifying motility differences associated with palate elevation defects.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative outputs such as mean displacement over time and cluster size (~300 microns) for assay standardization.
- Operational Value: Establishes a scalable 2D collective migration assay using silicone inserts for consistent cell seeding and imaging.
- Scientific Value: Enables wound repair assay adaptation to measure closure kinetics as a functional readout of cell motility.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Uses primary MEPM cells as a disease-relevant system to model mesenchymal remodeling in craniofacial development.
- Operational Value: Facilitates continuity from discovery to preclinical validation by allowing comparison across genetic or pharmacological perturbations.
- Scientific Value: Supports predictive confidence in lead identification by correlating cellular phenotypes with developmental outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum, supporting hypothesis testing in early biology and enabling quantitative screening for motility-modulating compounds or genetic perturbations.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by analyzing how genetic mutations alter collective movement in palatal mesenchymal cells.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized isolation, culture, and time-lapse imaging protocols for reproducible compound evaluation.
- Analytics: Provides trajectory-based measurements including persistence of direction and flow analysis of co-moving clusters for objective comparison.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by using a proxy model that reflects in vivo mesenchymal dynamics during palate elevation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying collective cell movement in other dynamic developmental systems beyond craniofacial biology.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in mesenchymal remodeling processes.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized cell isolation, plating density (300–1,400 cells/mm²), and imaging conditions.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of motility defects linked to developmental pathology.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization of targets based on functional validation in a physiologically relevant mesenchymal model.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryonic dissection and sterile tissue handling under microscopy.
- Dependent on access to time-lapse imaging systems and environmental control for long-term culture.
- Necessitates standardization of silicone insert preparation and cell seeding densities across laboratories.
- Involves adaptation considerations when extending the model to other mesenchymal or migratory cell types.
- Limited by the embryonic stage specificity (E13.5) and viability of primary palatal shelf tissue post-dissection.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:38
Embryonic Palatal Shelf Dissection
2:54
Mouse Embryonic Palatal Mesenchymal (MEPM) Cell Culture
4:07
2D Collective Migration Assay Setup
4:52
Wound Repair Assay Setup
5:28
Results: Representative MEPM Imaging and Collective Movement Analysis
6:33
Conclusion
