Name: 集団運動属性を解析するためのマウス胚性口蓋前葉細胞の単離とタイムラプスイメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-13T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: 学ぼう マウス胚性口蓋前葉細胞の単離とタイムラプスイメージング手法を用いた集団運動属性の定量的解析方法。頭蓋顔面発生における間葉組織リモデリングの動態理解に貢献します。

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このプロジェクトは、国立衛生研究所の助成金DE026172(I.S.)とGM102801(A.C.)によって部分的に支援されました。I.S.はまた、生物医学研究優秀センター(COBRE)助成金(国立一般医学研究所P20 GM104936)、カンザスIDeA生物医学研究優秀基金(国立一般医学研究所P20 GM103418)、カンザス知的発達障害研究センター(KIDDRC)助成金(U54 Euniceケネディ・シュリバー、国立衛生研究所)の一部を支援されました。 HD090216)。

<ol><li>Bush, J. O., Jiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palatogenesis%3A+morphogenetic+and+molecular+mechanisms+of+secondary+palate+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development.</a> Development. 139 (2), 231-243 (2012).</li>
<li>Mossey, P. A., Little, J., Munger, R. G., Dixon, M. J., Shaw, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleft+lip+and+palate%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Cleft lip and palate.</a> Lancet. 374 (9703), 1773-1785 (2009).</li>
<li>Lan, Y., Xu, J., Jiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+mechanisms+of+palatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular mechanisms of palatogenesis.</a> Current Topics in Developmental Biology. 115, 59-84 (2015).</li>
<li>Li, C., Lan, Y., Jiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+cellular+mechanisms+of+palate+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">Molecular and cellular mechanisms of palate development.</a> Journal of Dental Research. 96 (11), 1184-1191 (2017).</li>
<li>Gritli-Linde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+etiopathogenesis+of+cleft+lip+and+cleft+palate%3A+usefulness+and+caveats+of+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The etiopathogenesis of cleft lip and cleft palate: usefulness and caveats of mouse models.</a> Current Topics in Developmental Biology. 84, 37(2008).</li>
<li>Meng, L., Bian, Z., Torensma, R., Vonden Hoff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+mechanisms+in+palatogenesis+and+cleft+palate%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">Biological mechanisms in palatogenesis and cleft palate.</a> Journal of Dental Research. 88 (1), 22-33 (2009).</li>
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<li>Kousa, Y. A., Schutte, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+an+orofacial+gene+regulatory+network%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Toward an orofacial gene regulatory network.</a> Developmental Dynamics. 245 (3), 220-232 (2016).</li>
<li>Jin, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+cell+remodeling+during+mouse+secondary+palate+reorientation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal cell remodeling during mouse secondary palate reorientation.</a> Developmental Dynamics. 239 (7), 2110-2117 (2010).</li>
<li>Yu, K., Ornitz, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histomorphological+study+of+palatal+shelf+elevation+during+murine+secondary+palate+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Histomorphological study of palatal shelf elevation during murine secondary palate formation.</a> Developmental Dynamics. 240 (7), 1737-1744 (2011).</li>
<li>Chiquet, M., Blumer, S., Angelini, M., Mitsiadis, T. A., Katsaros, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+remodeling+during+palatal+shelf+elevation+revealed+by+extracellular+matrix+and+F-actin+expression+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal remodeling during palatal shelf elevation revealed by extracellular matrix and F-actin expression patterns.</a> Frontiers in Physiology. 7, 392(2016).</li>
<li>Paul, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARHGAP29+mutation+is+associated+with+abnormal+oral+epithelial+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">ARHGAP29 mutation is associated with abnormal oral epithelial adhesions.</a> Journal of Dental Research. 96 (11), 1298-1305 (2017).</li>
<li>Hall, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPECC1L+regulates+palate+development+downstream+of+IRF6%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">SPECC1L regulates palate development downstream of IRF6.</a> Human Molecular Genetics. 29 (5), 845-858 (2020).</li>
<li>Walker, B. E., Fraser, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Closure+of+the+secondary+palate+in+three+strains+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Embryology+and+Experimental+Morphology%22%5BJournal%5D)">Closure of the secondary palate in three strains of mice.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 4 (2), 176-189 (1956).</li>
<li>Jin, J. Z., Li, Q., Higashi, Y., Darling, D. S., Ding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Zfhx1a+mutant+mice+reveals+palatal+shelf+contact-independent+medial+edge+epithelial+differentiation+during+palate+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Analysis of Zfhx1a mutant mice reveals palatal shelf contact-independent medial edge epithelial differentiation during palate fusion.</a> Cell Tissue Research. 333 (1), 29-38 (2008).</li>
<li>Kouskoura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+etiology+of+cleft+palate+formation+in+BMP7-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The etiology of cleft palate formation in BMP7-deficient mice.</a> PLoS One. 8 (3), 59463(2013).</li>
<li>Lan, Y., Zhang, N., Liu, H., Xu, J., Jiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Golgb1+regulates+protein+glycosylation+and+is+crucial+for+mammalian+palate+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Golgb1 regulates protein glycosylation and is crucial for mammalian palate development.</a> Development. 143 (13), 2344-2355 (2016).</li>
<li>He, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt5a+regulates+directional+cell+migration+and+cell+proliferation+via+Ror2-mediated+noncanonical+pathway+in+mammalian+palate+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Wnt5a regulates directional cell migration and cell proliferation via Ror2-mediated noncanonical pathway in mammalian palate development.</a> Development. 135 (23), 3871-3879 (2008).</li>
<li>Lan, Y., Qin, C., Jiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+hyaluronan+synthase-2+in+craniofacial+and+palate+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">Requirement of hyaluronan synthase-2 in craniofacial and palate development.</a> Journal of Dental Research. 98 (12), 1367-1375 (2019).</li>
<li>Yonemitsu, M. A., Lin, T. Y., Yu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronic+acid+is+required+for+palatal+shelf+movement+and+its+interaction+with+the+tongue+during+palatal+shelf+elevation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Hyaluronic acid is required for palatal shelf movement and its interaction with the tongue during palatal shelf elevation.</a> Developmental Biology. 457 (1), 57-68 (2020).</li>
<li>Goering, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPECC1L-deficient+palate+mesenchyme+cells+show+speed+and+directionality+defect%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">SPECC1L-deficient palate mesenchyme cells show speed and directionality defect.</a> Scientific Reports. 11 (1), 1452(2021).</li>
<li>Fantauzzo, K. A., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PI3K-mediated+PDGFRalpha+signaling+regulates+survival+and+proliferation+in+skeletal+development+through+p53-dependent+intracellular+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">PI3K-mediated PDGFRalpha signaling regulates survival and proliferation in skeletal development through p53-dependent intracellular pathways.</a> Genes and Development. 28 (9), 1005-1017 (2014).</li>
<li>Vasudevan, H. N., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SRF+regulates+craniofacial+development+through+selective+recruitment+of+MRTF+cofactors+by+PDGF+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">SRF regulates craniofacial development through selective recruitment of MRTF cofactors by PDGF signaling.</a> Developmental Cell. 31 (3), 332-344 (2014).</li>
<li>Vasudevan, H. N., Mazot, P., He, F., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+tyrosine+kinases+modulate+distinct+transcriptional+programs+by+differential+usage+of+intracellular+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Receptor tyrosine kinases modulate distinct transcriptional programs by differential usage of intracellular pathways.</a> Elife. 4, 07186(2015).</li>
<li>Gao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2%2C3%2C7%2C8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin+and+TGFbeta3-mediated+mouse+embryonic+palatal+mesenchymal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dose+Response%22%5BJournal%5D)">2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin and TGFbeta3-mediated mouse embryonic palatal mesenchymal cells.</a> Dose Response. 17 (1), 1559325818786822(2019).</li>
<li>Iyyanar, P. P. R., Nazarali, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hoxa2+inhibits+bone+morphogenetic+protein+signaling+during+osteogenic+differentiation+of+the+palatal+mesenchyme%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Hoxa2 inhibits bone morphogenetic protein signaling during osteogenic differentiation of the palatal mesenchyme.</a> Frontiers in Physiology. 8, 929(2017).</li>
<li>Jiang, Z., Pan, L., Chen, X., Chen, Z., Xu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt6+influences+the+viability+of+mouse+embryonic+palatal+mesenchymal+cells+via+the+beta-catenin+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Therapeutic+Medicine%22%5BJournal%5D)">Wnt6 influences the viability of mouse embryonic palatal mesenchymal cells via the beta-catenin pathway.</a> Experimental and Therapeutic Medicine. 14 (6), 5339-5344 (2017).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+interplay+of+retinoic+acid+and+TGF-beta+signaling+mediated+by+TG-interacting+factor+to+modulate+mouse+embryonic+palate+mesenchymal-cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Research+Part+B%3A+Developmental+and+Reproductive+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Negative interplay of retinoic acid and TGF-beta signaling mediated by TG-interacting factor to modulate mouse embryonic palate mesenchymal-cell proliferation.</a> Birth Defects Research Part B: Developmental and Reproductive Toxicology. 101 (6), 403-409 (2014).</li>
<li>Bush, J. O., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ephrin-B1+forward+signaling+regulates+craniofacial+morphogenesis+by+controlling+cell+proliferation+across+Eph-ephrin+boundaries%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Ephrin-B1 forward signaling regulates craniofacial morphogenesis by controlling cell proliferation across Eph-ephrin boundaries.</a> Genes & Development. 24 (18), 2068-2080 (2010).</li>
<li>Mo, J., Long, R., Fantauzzo, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pdgfra+and+Pdgfrb+genetically+interact+in+the+murine+neural+crest+cell+lineage+to+regulate+migration+and+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Pdgfra and Pdgfrb genetically interact in the murine neural crest cell lineage to regulate migration and proliferation.</a> Frontiers in Physiology. 11, 588901(2020).</li>
<li>He, F., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+PDGFRalpha+signaling+in+medial+nasal+process+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A critical role for PDGFRalpha signaling in medial nasal process development.</a> PLoS Genetics. 9 (9), 1003851(2013).</li>
<li>Fantauzzo, K. A., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+an+immortalized+mouse+embryonic+palatal+mesenchyme+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Generation of an immortalized mouse embryonic palatal mesenchyme cell line.</a> PLoS One. 12 (6), 0179078(2017).</li>
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<li>Neufeld, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Allee+effect+in+modelling+post+resection+recurrence+of+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">The role of Allee effect in modelling post resection recurrence of glioblastoma.</a> PLoS Computational Biology. 13 (11), 1005818(2017).</li>
<li>Zamir, E. A., Czirok, A., Rongish, B. J., Little, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+digital+image-based+method+for+computational+tissue+fate+mapping+during+early+avian+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">A digital image-based method for computational tissue fate mapping during early avian morphogenesis.</a> Annals of Biomedical Engineering. 33 (6), 854-865 (2005).</li>
<li>Czirok, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical-flow+based+non-invasive+analysis+of+cardiomyocyte+contractility%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Optical-flow based non-invasive analysis of cardiomyocyte contractility.</a> Scientific Reports. 7 (1), 10404(2017).</li>
<li>Biggs, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon+regulatory+factor+6+regulates+keratinocyte+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Interferon regulatory factor 6 regulates keratinocyte migration.</a> Journal of Cell Science. 127, Pt 13 2840-2848 (2014).</li>
<li>Czirok, A., Varga, K., Mehes, E., Szabo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+cell+streams+in+epithelial+monolayers+depend+on+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22New+Journal+of+Physics%22%5BJournal%5D)">Collective cell streams in epithelial monolayers depend on cell adhesion.</a> New Journal of Physics. 15, 75006(2013).</li>
<li>Szabo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+cell+motion+in+endothelial+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Biology%22%5BJournal%5D)">Collective cell motion in endothelial monolayers.</a> Physical Biology. 7 (4), 046007(2010).</li>
<li>Gulyas, M., Csiszer, M., Mehes, E., Czirok, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Software+tools+for+cell+culture-related+3D+printed+structures%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Software tools for cell culture-related 3D printed structures.</a> PLoS One. 13 (9), 0203203(2018).</li>
<li>Soderholm, J., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scratch+n%27+screen+for+inhibitors+of+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Scratch n' screen for inhibitors of cell migration.</a> Chemistry & Biology. 12 (3), 263-265 (2005).</li>
<li>Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+wound-healing+assays+for+probing+collective+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Laboratory+Automation%22%5BJournal%5D)">Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration.</a> Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 59-65 (2012).</li>
<li>Svensson, C. M., Medyukhina, A., Belyaev, I., Al-Zaben, N., Figge, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Untangling+cell+tracks%3A+Quantifying+cell+migration+by+time+lapse+image+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Untangling cell tracks: Quantifying cell migration by time lapse image data analysis.</a> Cytometry Part A. 93 (3), 357-370 (2018).</li>
<li>Fantauzzo, K. A., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDGFRbeta+regulates+craniofacial+development+through+homodimers+and+functional+heterodimers+with+PDGFRalpha%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">PDGFRbeta regulates craniofacial development through homodimers and functional heterodimers with PDGFRalpha.</a> Genes & Development. 30 (21), 2443-2458 (2016).</li>
<li>Rafi, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-epileptic+drug+topiramate+upregulates+TGF%CE%B21+and+SOX9+expression+in+primary+embryonic+palatal+mesenchyme+cells%3A+Implications+for+teratogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Anti-epileptic drug topiramate upregulates TGFβ1 and SOX9 expression in primary embryonic palatal mesenchyme cells: Implications for teratogenicity.</a> PLoS ONE. , In Press (2021).</li>
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著者らは開示するものは何もない。

口蓋棚の標高は、垂直から水平方向のリモデリングイベント1、3、4、9、11を構成します。このリフォームプロセスでは、口蓋棚間葉細胞が協調的に振る舞う必要があると仮定されています。野生型 MEPM 細胞を用いた分析は、この細胞の挙動が組み込みであり、定量化できることを示しています。したがって、これらのアッセイは口蓋裂の新規および既存のマウスモデルにおける主要な口蓋棚の上昇欠陥を発見するために使用することができる。セクション1と2で概説されている方法は、研究者が主要なMEPM細胞のアリコートを分離、培養、および凍結することを可能にするべきである。これらの細胞は、ここで説明する2D培養および創傷修復アッセイを含む多種多様な用途に使用することができる。2D培養物を、タイムラプ...

口蓋の発達は、口蓋形成の欠陥が口蓋裂につながり、単離した症例で起こる一般的な出生時欠損、または何百もの症候群1,2の一部として広範囲に研究されてきた。胚性口蓋の発達は、胚組織の移動および融合を伴う動的プロセスである。このプロセスは、口蓋棚の1)誘導、2)舌の隣の口蓋棚の垂直成長、舌の上の口蓋棚の3)上昇、および4)正中線1、3、4における口蓋棚の融合の4つの主要なステップに分けることができる。過去数十年にわたり、多くのマウス変異体が口蓋裂5、6、7、8を明らかに同定されてきた。これらのモデルの特徴は、口蓋棚誘導、増殖、および融合ステップにおける欠陥を示している。しかし、口蓋棚の標高欠陥はまれであった。したがって、口蓋棚の上昇のダイナミクスを理解することは、興味深い研究分野です。
口蓋棚の標高欠陥を有するいくつかのマウス変異体の慎重な分析は、口蓋棚の非常に前部領域が反転するように見えるが、口蓋棚の垂直から水平移動または「リモデリング」が口蓋1、3、4の後部領域に起こることを示す現在のモデルにつながっている。 9、10、11。口蓋棚の内側縁上皮は、この改造に必要なシグナリングを開始する可能性が高く、口蓋棚間葉によって駆動される。最近、多くの研究者は、口蓋棚12,13を含む一過性の経口接着を示すマウスモデルにおける口蓋棚の上昇遅延を同定した。間葉性のリモデリングは、細胞の再編成を伴い、水平方向に膨らみを作り出し、同時に口蓋棚を垂直方向9、10、14に引き込む。口蓋棚の上昇および基礎間葉リモデリングに影響を与えるために提案されたいくつかのメカニズムの中には、細胞増殖15、16、17、化学戦術勾配18、および細胞外マトリックス成分19、20がある。重要な疑問が生じた:Specc1l-欠損マウスで観察された口蓋棚の標高遅延も、口蓋棚の改造の欠陥も一因であり、この改修欠陥は、原発MEPM細胞21の挙動における本質的な欠陥に現れる可能性がありますか?
原発性MEPM細胞は、遺伝子発現22、23、24、25、26、27、28、29、および増殖を伴ういくつかの研究のために頭蓋顔面分野で使用されてきた30、31、32 を使用しますが、集合的な細胞行動分析には何もありません。MEPM細胞のタイムラプスイメージングを2D培養および創傷修復アッセイで行い、MEPM細胞が集団運動21の指向性運動および形成された密度依存性細胞ストリーム属性を示すことを示した。さらに、Specc1l変異細胞は、より狭い細胞ストリームを形成し、高可変細胞移動軌跡を示した。この協調運動性の欠如は、Specc1l変異胚13,21における口蓋上昇遅延に寄与すると考えられる。したがって、原発性MEPM細胞を用いたこれらの比較的単純なアッセイは、口蓋棚の上昇時に間葉リモデリングを研究するための代理として機能し得る。本論文では、2Dおよび創傷修復アッセイの経時経過イメージングと分析に加えて、一次MEPM細胞の単離と培養について述べている。

<table><tbody><tr><td>ビーカー、250 mL (x2)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB-100-250</td><td></td></tr><tr><td>CO2</td><td>Matheson Gas</td><td>UN1013</td><td></td></tr><tr><td>コニカルチューブ、15 mL (x1)</td><td>Midwest Scientific</td><td>C15B</td><td></td></tr><tr><td>Debian オペレーティングシステム</td><td></td><td></td><td>タイムラプス画像の計算解析</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagles Medium/High Glucose with 4 mML-グルタミンおよびピルビン酸ナトリウム</td><td>Cytiva Life Sciences</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>EtOH, 100%</td><td>Decon Laboratories</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>EVOS FL Auto</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AMAFD1000</td><td></td></tr><tr><td>EVOS Onstage Incubator</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AMC1000</td><td></td></tr><tr><td>EVOS Onstage Vessel Holder, Multi-Well Plates</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AMEPVH028</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>コーニング</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>ファインポイント #5 ステンレス製鉗子 (x2)</td> <td>ファインサイエンスツール</td><td>11295-10</td><td>解剖</td></tr><tr><td>器 滅菌器 ビーズバス</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>18000-45</td><td></td></tr><tr><td>マイクロセトリフュージチューブ、1.5mL</td><td>アバン</td>ト <td>2925</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ解剖用ステンレス製ハサミ、ストレート</td><td>Roboz</td><td>RS-5910</td><td>Dissection</td></tr><tr><td>NucBlue(Hoechst)ライブレディプローブ</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R37605</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリンストレプトマイシン溶液、100x</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>シリコンインサート、2ウェル</td><td>Ibidi</td><td>80209</td><td></td></tr><tr><td>小型穴あきステンレス鋼スプーン</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>MC17C</td><td>解剖</td></tr><tr><td>スプリングはさみ、4 mm</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>15018-10</td><td></td></tr><tr><td>滅菌済み 10 cm ディスプレイ</td> <td>コーニング</td><td>430293</td><td></td></tr><tr><td>滅菌済み 12 ウェルプレート</td> <td>PR1MA</td><td>667512</td><td></td></tr><tr><td>滅菌済み 6 ウェルプレート</td> <td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>滅菌済み PBS</td><td>コーニング</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>滅菌済みプラスチック電球トランスファーピペット</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>202-1S</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン、0.25%</td> <td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>25200056</td><td></td></tr></tbody></table>

集団運動属性を解析するためのマウス胚性口蓋前葉細胞の単離とタイムラプスイメージング

Isolation and Time-Lapse Imaging of Primary Mouse Embryonic Palatal Mesenchyme Cells to Analyze Collective Movement Attributes

口蓋の発達は、舌の隣にある両側口蓋棚の垂直成長に続いて、舌の上に標高と融合を伴う動的なプロセスである。この過程の欠陥は、口蓋裂、共通の出生時欠損につながる。最近の研究では、口蓋棚の標高には、棚の向きを垂直から水平に変換する改造プロセスが含まれていることが示されています。この動的なリフォームにおける口蓋棚間葉細胞の役割は、研究が困難であった。タイムラプスイメージングベースの定量分析は、最近、一次マウス胚性口蓋間葉(MEPM)細胞が集団運動に自己組織化できることを示すために使用されています。定量的解析では、口蓋の標高欠陥を持つマウス モデルから、変異 MEPM 細胞の違いを特定できます。本論文では、E13.5胚からMEPM細胞を分離して培養する方法について、特にタイムラプスイメージングのために、また、河川形成、形状アライメント、方向の持続性の測定を含む集団運動の様々な細胞属性を決定する方法について述べる。MEPM細胞は、標高の動的プロセス中に口蓋棚間葉系の役割を研究するためのプロキシモデルとして機能することができると考えています。これらの定量的方法により、頭蓋顔面場の研究者は、コントロール細胞と突然変異細胞の集団運動属性を評価および比較することができ、口蓋棚の上昇時の間葉リモデリングの理解を強化する。さらに、MEPM細胞は、一般的に集団細胞の動きを調べた稀な間葉細胞モデルを提供する。

口蓋棚の解剖を図1に示す。切開のシーケンスは、組織の滑りを最小限に抑えるように設計されています.頭部の取り外し(図1A,B)に続いて、下顎が取り除かれる(図1B,C)。頭の上部の切開(図1C,D)は、逆さまに置くと組織を安定化させ(図1E)、ピンチ(図1F)、および物品用(図1G)を図表棚に可視化する。
単一の胚から切除された口蓋棚のペアはトリプシン化され、35mm皿または6ウ...

我々は、二次元(2D)成長および創傷修復アッセイのタイムラプスイメージングのための一次マウス胚口蓋間葉細胞の単離および培養のためのプロトコルを提示する。また、タイムラプスイメージングデータの解析方法を提供し、細胞流の形成と指向運動性を決定します。

Development of the palate is a dynamic process, which involves vertical growth of bilateral palatal shelves next to the tongue followed by elevation and ...

このプロトコルにより、頭蓋顔面分野の研究者は、口蓋棚の上昇中に間葉リモデリングを理解する手段として、コントロール細胞と変異細胞の集団移動属性を定量的に比較することができます。一次マウス胚性口蓋間葉細胞およびタイムラプスイメージングの使用は、口蓋棚の上昇ダイナミクスを評価するためのアクセス可能なプロキシメソッドを提供する。マウス胚から口蓋殻を収穫するには、殺菌した穿孔スプーンを使用して、胚13.5日目の胚を、立体顕微鏡の下で無菌MEPM培養培地で満たされた無菌10センチメートル皿に入れる。切断後、殺菌された細かいNo.5鉗子の1つの先端を頬のすぐ内側の口に挿入し、頭蓋骨の後ろから出るまで鉗子の先端を押し込みます。鉗子を向け、もう一方の腕が外耳道の上をホバリングしてから、鉗子をつまんでティッシュを切るようにします。頭の反対側の切開を繰り返し、下顎、舌、および頭蓋骨の下の部分が取り除かれるまでピンチカット手順を続け、口蓋棚を露出させる。頭を横に置き、小さな無菌のステンレス製のはさみの先端を胚の目の高さ程度の頭蓋骨の前と後ろに置き、目のすぐ上を切って頭蓋骨の頭蓋骨を取り除き、平らな表面を作り出します。次に、皿の底に平らに置く優れた側面で頭を逆さまに置き、頭の前半分の中央溝の両側に2つの隆起した橋として見えるはずの口蓋棚を見つけます。皿に頭を固定するには、口蓋棚に頭の前部の鼻領域の近くの組織を通して細かい鉗子の一方の先端を挿入し、もう一方は頭蓋骨の後部の基部を通して口蓋棚に挿入する。非常に鋭く、棚の側面の基部のティッシュに非常に鋭い、細かい鉗子の第二のペアの両方のポイントを挿入し、ゆっくりと慎重にティッシュを切断するためにピンチ。棚の内側表面の基部に沿って切開を繰り返し、棚の前部と後端の両方で棚を取り付けから頭に取り外し、棚を穏やかに持ち上げ、必要に応じて追加のピンチを作り、周囲の組織からシェルを完全に解放します。2番目の口蓋棚が同様に取り除かれた場合、滅菌プラスチック電球転写ピペットを使用して、氷上のPBSの約500マイクロリットルで無菌1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに棚を移します。MEPM細胞培養をセットアップするには、すべての棚が採取された場合、組織を乱さずにPBSを吸引し、直ちに37度摂氏0.25%トリプシンの200マイクロリットルを口蓋棚組織の各チューブに加える。1,000マイクロリットルのピペットを使用して組織を数回短時間ピペットし、37°Cで10分間培養し、5分後に短時間ピペットします。インキュベーションの終わりに、各チューブに800マイクロリットルのMEPM培養培地を添加し、チューブを遠心して細胞を採取する前に、組織を再びピペットする。上清を吸引した後、ペレットを1チューブあたり1ミリリットルの新鮮なMEPM培養培地に再懸濁し、1ウェルあたり2ミリリットルを含む6ウェル組織培養処理プレートの個々のウェルに細胞をプレートし、1ウェル当たり3ミリリットルの最終合計にプレート化し、細胞を滅菌細胞培養インキュベーターで12時間プラスチック表面に付着させる。2D集合移動アッセイを設定するには、分析するサンプルごとに約1ミリメートルの高さに1つの無菌2ウェルシリコーンインサートの上部を取り除き、滅菌鉗子を使用して、6ウェルプレートの個々のウェルの中心に短く無菌の2ウェルインサートをプレートします。すべてのエッジに沿って押し下げて、挿入物がウェルボトムに完全に接着され、細胞培養インキュベーター中の一晩インキュベートのために各インキュベートの各挿入物に40〜50マイクロリットルのMEPM培養液の合計体積で、短いシリコーン挿入物の1平方ミリメートル当たり300 MEPM細胞が完全に付着していることを確認します。創傷修復アッセイを設定するには、無変無変の無菌2ウェルシリコーンインサートをサンプルあたり6ウェルプレートの1つのウェルの中央に配置し、挿入物の端をしっかりと押して培養プレートに取り付けます。次いで、1平方ミリメートル当たり400細胞を各挿入液中に100マイクロリットルのMEPM培地に投入し、細胞培養培地中で48時間培養した。2D集合的移動アッセイを行う場合、細胞を大きな培養皿に2ウェルシリコーンインサートに播種すると、通常、イメージングに優れた細胞密度が得られます。35ミリメートル皿に入れた小さな3Dプリントリングも2D運動性解析に使用できます。創傷修復アッセイの場合、細胞は高い合流まで2ウェルシリコーンインサートで成長します。その後、インサートが除去され、創傷は閉鎖されるまで画像化されます。MEPM軌道は持続性であり、細胞運動の方向は数時間維持される。平均変位対時間分析は、変位の形式での持続性が経過時間に比例していることを示します。運動性データの流れ解析では、共移動MEPM細胞クラスターのサイズは約300ミクロンである。野生型と変異MEPM細胞の間には深い運動性の違いも認められる。この手順は、様々なトランスジェニックマウスラインで使用することができ、細胞の動きに対する効果を研究するために、様々な生化学的試薬でMEPM細胞を治療することができます。我々は、一次口蓋間葉細胞に焦点を当ててきたが、タイムラプスイメージングと定量分析は、動的発達過程における任意の運動細胞型の移動属性を探索するためにも使用することができる。

isolation-time-lapse-imaging-primary-mouse-embryonic-palatal

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

この記事では、表面のラベルを説明し、...

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神経前駆有糸分裂は、神経新生の重要なパラメータである。神経前駆糸分裂の我々の理解の多くは、固定された組織の分析に基づいている。胚性脳スライス内のライブイメージングは​​、制御された環境で、高い時間·空間分解能で有糸分裂を評価するための汎用的な手法である。...

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対称性の破れ、偏光と創発集団行動を表示、マウス胚性幹細胞の凝集物の生成<em&gt;インビトロ</em

ここでは、C.エレガンスの発生過程を追跡し定量化する方法を示しています。提示されている方法は、簡単に実装できるオープンソースのツールに基づいています。3D細胞形状モデルの再構築方法、細胞内構造の手動追跡方法、皮質収縮流の解析方法などを実演します。...

の発達過程を追跡し、定量化<em&gt; C。エレガンス</em&gt;オープンソースのツールを使用しました

このプロトコルは、マウス着床前胚において系統の仕様を研究するために、タンパク質発現のin situ分析 、定量的、単一のセルを実行するための方法を提示します。胚盤胞のコレクションのために必要な手順、全マウント免疫蛍光タンパク質の検出、共焦点顕微鏡での試料の画像化、および核分割及び画像解析について説明します。...

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ここでは、共焦点顕微鏡法を用いたマウス二次口蓋融合のライブイメージングのためのプロトコールを提示する。このプロトコールは、様々な蛍光レポーターマウス系統と、および機械的洞察のための経路阻害剤と組み合わせて使用​​することができる。このプロトコールは、他の発生系におけるライブイメージングに適合させることができる。...

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マウスにおけるペリオスチール骨格幹細胞のCCL5誘導性移行のリアルタイムイメージング

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学ぼう マウス胚性口蓋前葉細胞の単離とタイムラプスイメージング手法を用いた集団運動属性の定量的解析方法。頭蓋顔面発生における間葉組織リモデリングの動態理解に貢献します。

集団運動属性を解析するためのマウス胚性口蓋前葉細胞の単離とタイムラプスイメージング

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