Name: ゼブラフィッシュオプティクスカップ形態形成の4次元イメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: 学ぶゼブラフィッシュの眼杯形態形成の4次元ライブイメージング法。Danio rerioを用いたレーザー走査共焦点顕微鏡による時間経過撮影で、細胞動態と組織発生を可視化し、脊椎動物の眼発生メカニズムを解明する。

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私たちは、このプロトコルのタイムラプスアプローチと議論に取り組むために、クワンラボの過去と現在のメンバーに感謝しています。この作業は、NIH(R01 EY025378およびR01 EY025780からKMKまで)によってサポートされました。F31 EY030758 から SL;および T32 GM007464 を MAC にします。

<ol><li>Adler, R., Canto-Soler, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+optic+vesicle+development%3A+complexities%2C+ambiguities+and+controversies%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of optic vesicle development: complexities, ambiguities and controversies.</a> Developmental Biology. 305 (1), 1-13 (2007).</li>
<li>Chow, R. L., Lang, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+eye+development+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Early eye development in vertebrates.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 17, 255-296 (2001).</li>
<li>Fuhrmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eye+morphogenesis+and+patterning+of+the+optic+vesicle%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Eye morphogenesis and patterning of the optic vesicle.</a> Current Topics in Developmental Biology. 93, 61-84 (2010).</li>
<li>Martinez-Morales, J. R., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shaping+the+vertebrate+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+and+Development%22%5BJournal%5D)">Shaping the vertebrate eye.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 19 (5), 511-517 (2009).</li>
<li>Yang, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+cell-extrinsic+growth+factors+in+vertebrate+eye+pattern+formation+and+retinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Roles of cell-extrinsic growth factors in vertebrate eye pattern formation and retinogenesis.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 15 (1), 91-103 (2004).</li>
<li>Bogdanovic, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Numb%2FNumbl-Opo+antagonism+controls+retinal+epithelium+morphogenesis+by+regulating+integrin+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Numb/Numbl-Opo antagonism controls retinal epithelium morphogenesis by regulating integrin endocytosis.</a> Developmental Cell. 23 (4), 782-795 (2012).</li>
<li>Bryan, C. D., Casey, M. A., Pfeiffer, R. L., Jones, B. W., Kwan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optic+cup+morphogenesis+requires+neural+crest-mediated+basement+membrane+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Optic cup morphogenesis requires neural crest-mediated basement membrane assembly.</a> Development. 147 (4), (2020).</li>
<li>Bryan, C. D., Chien, C. B., Kwan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+laminin+alpha+1+results+in+multiple+structural+defects+and+divergent+effects+on+adhesion+during+vertebrate+optic+cup+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Loss of laminin alpha 1 results in multiple structural defects and divergent effects on adhesion during vertebrate optic cup morphogenesis.</a> Developmental Biology. 416 (2), 324-337 (2016).</li>
<li>Cavodeassi, F., Ivanovitch, K., Wilson, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eph%2FEphrin+signalling+maintains+eye+field+segregation+from+adjacent+neural+plate+territories+during+forebrain+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Eph/Ephrin signalling maintains eye field segregation from adjacent neural plate territories during forebrain morphogenesis.</a> Development. 140 (20), 4193-4202 (2013).</li>
<li>England, S. J., Blanchard, G. B., Mahadevan, L., Adams, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dynamic+fate+map+of+the+forebrain+shows+how+vertebrate+eyes+form+and+explains+two+causes+of+cyclopia%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A dynamic fate map of the forebrain shows how vertebrate eyes form and explains two causes of cyclopia.</a> Development. 133 (23), 4613-4617 (2006).</li>
<li>Gordon, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signaling+regulates+cell+motility+and+optic+fissure+and+stalk+formation+during+vertebrate+eye+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signaling regulates cell motility and optic fissure and stalk formation during vertebrate eye morphogenesis.</a> Development. 145 (22), (2018).</li>
<li>Ivanovitch, K., Cavodeassi, F., Wilson, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precocious+acquisition+of+neuroepithelial+character+in+the+eye+field+underlies+the+onset+of+eye+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Precocious acquisition of neuroepithelial character in the eye field underlies the onset of eye morphogenesis.</a> Developmental Cell. 27 (3), 293-305 (2013).</li>
<li>Kwan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complex+choreography+of+cell+movements+shapes+the+vertebrate+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A complex choreography of cell movements shapes the vertebrate eye.</a> Development. 139 (2), 359-372 (2012).</li>
<li>Martinez-Morales, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ojoplano-mediated+basal+constriction+is+essential+for+optic+cup+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Ojoplano-mediated basal constriction is essential for optic cup morphogenesis.</a> Development. 136 (13), 2165-2175 (2009).</li>
<li>Miesfeld, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yap+and+Taz+regulate+retinal+pigment+epithelial+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Yap and Taz regulate retinal pigment epithelial cell fate.</a> Development. 142 (17), 3021-3032 (2015).</li>
<li>Nicolas-Perez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+cellular+behavior+and+cytoskeletal+dynamics+reveal+a+constriction+mechanism+driving+optic+cup+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Analysis of cellular behavior and cytoskeletal dynamics reveal a constriction mechanism driving optic cup morphogenesis.</a> eLife. 5, (2016).</li>
<li>Picker, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+coupling+of+pattern+formation+and+morphogenesis+in+the+developing+vertebrate+retina%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Dynamic coupling of pattern formation and morphogenesis in the developing vertebrate retina.</a> PLoS Biology. 7 (10), e1000214(2009).</li>
<li>Rembold, M., Loosli, F., Adams, R. J., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individual+cell+migration+serves+as+the+driving+force+for+optic+vesicle+evagination%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Individual cell migration serves as the driving force for optic vesicle evagination.</a> Science. 313 (5790), 1130-1134 (2006).</li>
<li>Sidhaye, J., Norden, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concerted+action+of+neuroepithelial+basal+shrinkage+and+active+epithelial+migration+ensures+efficient+optic+cup+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Concerted action of neuroepithelial basal shrinkage and active epithelial migration ensures efficient optic cup morphogenesis.</a> eLife. 6, (2017).</li>
<li>Driever, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+screen+for+mutations+affecting+embryogenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish.</a> Development. 123, 37-46 (1996).</li>
<li>Haffter, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+identification+of+genes+with+unique+and+essential+functions+in+the+development+of+the+zebrafish%2C+Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The identification of genes with unique and essential functions in the development of the zebrafish, Danio rerio.</a> Development. 123, 1-36 (1996).</li>
<li>Nusslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+issue+of+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The zebrafish issue of Development.</a> Development. 139 (22), 4099-4103 (2012).</li>
<li>Hoshijima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+CRISPR-Cas9-based+methods+for+generating+deletion+mutations+and+F0+embryos+that+lack+gene+function+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Highly efficient CRISPR-Cas9-based methods for generating deletion mutations and F0 embryos that lack gene function in zebrafish.</a> Developmental Cell. 51 (5), 645-657 (2019).</li>
<li>Kwan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Tol2kit%3A+a+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).</li>
<li>Almeida, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectrum+of+Fates%3A+a+new+approach+to+the+study+of+the+developing+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Spectrum of Fates: a new approach to the study of the developing zebrafish retina.</a> Development. 141 (9), 1971-1980 (2014).</li>
<li>Baye, L. M., Link, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interkinetic+nuclear+migration+and+the+selection+of+neurogenic+cell+divisions+during+vertebrate+retinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Interkinetic nuclear migration and the selection of neurogenic cell divisions during vertebrate retinogenesis.</a> The Journal of Neuroscience. 27 (38), 10143-10152 (2007).</li>
<li>Clark, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Llgl1+in+retinal+neuroepithelia+reveals+links+between+apical+domain+size%2C+Notch+activity+and+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Loss of Llgl1 in retinal neuroepithelia reveals links between apical domain size, Notch activity and neurogenesis.</a> Development. 139 (9), 1599-1610 (2012).</li>
<li>Das, T., Payer, B., Cayouette, M., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+time-lapse+imaging+of+cell+divisions+during+neurogenesis+in+the+developing+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">In vivo time-lapse imaging of cell divisions during neurogenesis in the developing zebrafish retina.</a> Neuron. 37 (4), 597-609 (2003).</li>
<li>Kay, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+requirement+for+ganglion+cells+during+assembly+of+retinal+synaptic+layers%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Transient requirement for ganglion cells during assembly of retinal synaptic layers.</a> Development. 131 (6), 1331-1342 (2004).</li>
<li>Norden, C., Young, S., Link, B. A., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actomyosin+is+the+main+driver+of+interkinetic+nuclear+migration+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Actomyosin is the main driver of interkinetic nuclear migration in the retina.</a> Cell. 138 (6), 1195-1208 (2009).</li>
<li>Suzuki, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cone+photoreceptor+types+in+zebrafish+are+generated+by+symmetric+terminal+divisions+of+dedicated+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cone photoreceptor types in zebrafish are generated by symmetric terminal divisions of dedicated precursors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (37), 15109-15114 (2013).</li>
<li>Wan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ciliary+marginal+zone+of+the+zebrafish+retina%3A+clonal+and+time-lapse+analysis+of+a+continuously+growing+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The ciliary marginal zone of the zebrafish retina: clonal and time-lapse analysis of a continuously growing tissue.</a> Development. 143 (7), 1099-1107 (2016).</li>
<li>Yoshimatsu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+partner+selection+during+retinal+circuit+reassembly+varies+with+timing+of+neuronal+regeneration+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Presynaptic partner selection during retinal circuit reassembly varies with timing of neuronal regeneration in vivo.</a> Nature Communications. 7, 10590(2016).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>Wan, Y., Otsuna, H., Chien, C. B., Hansen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+interactive+visualization+tool+for+multi-channel+confocal+microscopy+data+in+neurobiology+research%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Visualization+and+Computer+Graphics%22%5BJournal%5D)">An interactive visualization tool for multi-channel confocal microscopy data in neurobiology research.</a> IEEE Transactions on Visualization and Computer Graphics. 15 (6), 1489-1496 (2009).</li>
<li>Wan, Y., Otsuna, H., Chien, C. B., Hansen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FluoRender%3A+an+application+of+2D+image+space+methods+for+3D+and+4D+confocal+microscopy+data+visualization+in+neurobiology+research%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Pacific+Visualization+Symposium%22%5BJournal%5D)">FluoRender: an application of 2D image space methods for 3D and 4D confocal microscopy data visualization in neurobiology research.</a> IEEE Pacific Visualization Symposium. , 201-208 (2012).</li>
<li>Carney, K. R., Bryan, C. D., Gordon, H. B., Kwan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LongAxis%3A+a+MATLAB-based+program+for+3D+quantitative+analysis+of+epithelial+cell+shape+and+orientation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">LongAxis: a MATLAB-based program for 3D quantitative analysis of epithelial cell shape and orientation.</a> Developmental Biology. 458 (1), 1-11 (2020).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

ここでは、視カップ形態形成の toto 標識および4Dタイムラプスイメージングのためのプロトコルについて説明する。私たちは、異なる細胞内区画をマークするために蛍光タンパク質をコードするキャップRNAを生成するプロセスを進めます。ゼブラフィッシュ1細胞胚を注入する;多重化イメージングのためのアガロースに11 hpf胚を埋め込む。そして、光学カップ形態形成(12-24 hpf)の間に複数の胚の4Dデータセットを取得する。

これらの情報密度の高いデータセットでは、無数の質問に答えることができます。4Dデータは、さまざまな方法で視覚化し、定量的に分析することができます。このプロトコルの範囲外ですが、達成できるものの種類の例として、目標と標準アプリケーションの一部をここに挙げてください。もちろん、定量的な画像解析方法は絶えず開発されており、市販のツールとカスタムメイドのツールの両方を使用できます。そのような方法を使用していない場合は、取得したデータセットが選択した定量的分析アプローチに適していることを確認するために、何らかの最適化を行う準備をする必要があります。

4D データセットの視覚化と定量的な評価は、ファイルのサイズが原因で困難になる場合があります。取得ソフトウェアを使用してデータセットを個別の胚に分割し、ImageJ/Fiji を使用して、コンフォーカル ファイルを商用形式からより標準的な tif スタックに変換し、各時間ポイントを別のファイルとして保存することができます。これにより、ファイル サイズが小さくなり、ファイル形式が標準化されます。各タイムポイントからの個々の光学セクションは、ImageJ/Fiji を使用して2D(XY)タイムラプスとして組み立てることができ、データの迅速な2D可視化と評価が可能になります。映画1は正確にこれを示す例です:図4I–I''に示す最適サンプルのタイムラプスとして時間をかけて組み立てられた単一の光学セクション。そこから、3Dおよび4Dビジュアライゼーションのために、我々は一般的に、自由に利用できるが、特定のグラフィックスカードの要件を持っているFluoRender35、36を使用しています。FluoRender を使用すると、任意の軸で 3D レンダリングデータを回転させ、時間の経過とともにデータセットを 4D で視覚化し、任意の平面でカットアウェイを生成し、回転とビジュアライゼーションをムービーまたは一連の tif イメージとして保存できます。

定量分析の面では、答えるべき多くの質問があります。私たちは、光学カップ形態形成の根底にある細胞挙動を理解するという独自の目標を支援するソフトウェアを社内で開発しました。私たちのプログラム、LongTrackerは、セル13を追跡するための位置のプロキシとして核信号を使用しています。これらのデータを使用して、セルが移動するタイミング、場所、および方法を決定できます。細胞の移動速度と距離。細胞が分裂する頻度。当社独自のソフトウェアに加えて、4Dセルトラッキング用の複数の市販およびカスタムメイドのオプションがあります。我々はまた、神経残の37内の細胞のセグメンテーションを行い、細胞の形状と組織を定量化するプログラムLongAxisを開発しました。ただし、LongAxis に入力されるデータセットは、高解像度で取得された単一の Z スタックです。永続的な課題は、細胞を自信を持ってセグメント化し、その形態を外挿するのに十分な解像度のタイムラプスデータセットを生成することです。その他の1つは、細胞形状の直接可視化のためにKaedeなどの光変換可能な蛍光素を用いたモザイク(スパース)ラベリングであり、我々および他の人たちが発達眼8、11、13で行ったように。これにより、セルのセグメンテーションの問題が簡単になり、FluoRender での 3D レンダリングを通じてセルの形状とサイズを簡単に定量できます。

このプロトコルの各ステップは、私たちの目的のために特別に最適化されました。このプロトコルの特異性はいくつかの制限をもたらします:書かれたプロトコルは、ゼブラフィッシュの目の発達(例えば、眼の神経新生など)、他の眼構造、他の発達段階、または他の細胞内区画の他の側面をイメージングするために最適化されていません。埋め込みの向き、イメージングの速度、ラベルはすべて、生物学的な質問に答えるように設計されています。画像の神経新生を画像化するために、例えば、ここで説明する胚の後方方向は、目的の特定の特徴の可視化を可能にしないことがあり、かつ、イメージングの速度が適切でない場合がある。プロトコルの多くの側面は、自分の特定の興味や目標に応じて、さまざまなニーズに合わせて適応および変更することができます。まず、RNA注射を使用すると、ラベリングプロセスが非常に柔軟になります。蛍光タンパク質融合構築物は、対象となる細胞下の構造を標識するために使用することができ、RNA注入量は、標識を最適化するために変化させることができる。光変換可能な蛍光系Kaedeの研究に基づいて、RNA注射は12 hpf11,13で終わった翻訳のバーストをサポートしているように見えます。RNA注入による高レベルの蛍光タンパク質発現は、光漂白と戦うことができるが、そのようなアプローチは、目的の蛍光標識の持続的な発現をサポートしていない。後の段階で胚を画像化する場合など、持続的な発現が必要な場合、トランスジェニックラインはオプションであり、ゼブラフィッシュで新しいラインを構築することは簡単です24.

次に、プロトコルは、開発の後期段階に適応することができます。顔料は後の段階で画像化を妨げる可能性があるため、胚をフェニルチオ尿素(PTU)で処理して顔料形成を阻害したり、色素合成のための遺伝子変異体を使用することができる。胚のけいれんを防ぐために、トリケーヌはアガロースおよび胚培地オーバーレイ溶液に添加することができ、アガロース率は必要に応じて調節することができる。目が大きくなるにつれて、取り付け方向を変更する必要があるかもしれません。ここでは、胚をドーサリーに取り付けますが、後の段階では、目的の構造に応じて横または前に取り付ける方が理にかなっているかもしれません。空間的スケールと時間スケールの異なるプロセスが発生するため、画像取得の Z ステップと時間ステップを最適化することもできます。これらの機能は、実際には各ラボのニーズに合わせて経験的にしか決定できません。

最後に、このプロトコルは、目の発達の初期段階で比較的高い割合のアガロースに埋め込まれた胚を用いて、レーザー走査共焦点顕微鏡用に特別に開発されました。眼の発達中に異なる時間または異なる場所でイメージングしている場合、このプロトコルは目的のプロセスに適応する必要があります。現在、多くの異なるイメージング手法が可能であり、光学エンジニアによって開発されています。各アプローチは、イメージング用の胚を埋め込み、取り付けるさまざまな方法から、さまざまなファイルサイズやフォーマットにまで、独自の課題をもたらします。最大限の空間解像度と時間分解能がフォトブリーチ、光毒性、および膨大なファイルサイズとバランスを取る最適化プロセスをガイドするための導入での考慮事項を概説します。これらの一般的な原則は、上記の実用的な情報に加えて、他の人が目の発達における多くのオープンな質問を研究するためのタイムラプスイメージングアプローチを確立するのに役立つことを願っています。

脊椎動物の目の発達は、将来の脳神経エピテリウムからの眼小胞の出現(または膣)から始まる。その後、視小胞は一連の組織形状の変化を受け、伸び、膣化して光学カップを生成する。光学カップにおいて、神経網膜および網膜色素上皮は、いずれも神経エピテリウムに由来し、表面外皮に由来する新生レンズを包み込む。全体のプロセスは、神経エピテリウム、外胚葉、間葉系細胞集団の間で調整された、複雑な一連の細胞および組織の動きおよび分子シグナル伝達を必要とする。これらの初期事象は眼の基本的な構造を確立し、虹彩や角膜形成を含む眼の発達の後のステップは、初期の組織化に精緻化されている。早期の眼の発達と形態形成の混乱は、アノフタルミア、微小眼科、コロボーマを含むヒトの多数の視覚障害状態の根づく。視用カップ形態形成を支配する細胞および分子メカニズムのロックを解除することは、視覚システムの発達とこれらのプロセスが苦しくなったときに生じる病理学的状態をさらに理解するために重要です。
脊椎動物の目の発達と形態形成の理解は、古典的な組織学的研究から、マウス、ひよこ、カエル、および魚1、2、3、4、5を含む様々なモデル生物における胚学的および遺伝的アプローチに至るまでの膨大な量の研究から生まれた。この研究機関は、初期の眼の発達を調節する分子メカニズムを確立しましたが、歴史的には、眼の形態形成、すなわち3D構造の出現に対する理解が乏しく存在しています。これらの知見の大部分は、離散的な時点で切除された胚をイメージングすることから来た。これは2次元の組織形態のビューを提供するのに十分であるが、形態形成は動的な、3Dプロセスである。時間の経過とともに組織の形状が3次元でどのように変化し、単一細胞がどのように振る舞い、そしてそれらの挙動が3D組織形状の変化にどのように寄与するかを決定するためには、異なるアプローチが必要である。
この知識のギャップに対処する1つの解決策は、臓器が形になるにつれて細胞や組織をリアルタイムで動的に観察できるライブイメージングです。残念ながら、これは胚発生の制約のために多くのモデル生物で容易に実現可能ではありません。例えば、マウスやひよこの胚(子宮内または卵殻内で発達する)は容易にアクセスされず、多くの生きた胚は光学的に透明ではなく、重大な光散乱を引き起こし、画像を取得できる深さを制限する。ゼブラフィッシュは、外部発達および透明胚を有し、眼形態形成6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19の生画像化を行うユニークな機会を提供する。十分なトランスジェニックおよび変異線も利用可能であり、新しいトランスジェニックおよび変異体20、21、22、23、24を生成するためのツールも利用可能である。また、ゼブラフィッシュにおいて、12時間の時間枠(受精後12〜24時間、hpf)を超えて、全体のプロセスのイメージングが可能となる。
細胞下構造の遺伝的にコード化された重要な標識を可能にする蛍光タンパク質のファミリーの拡大と最適化、顕微鏡法の改善と革新によって、ライブイメージングの取り組みが加速されました。ここで説明するプロトコルは、スピニングディスク共焦点顕微鏡、選択的平面照明顕微鏡(SPIMおよびその変異体)、および他のより専門的な顕微鏡法を含むゼブラフィッシュ胚発生をイメージングするための他の現在のアプローチではなく、レーザースキャン共焦点顕微鏡を使用する。開発中のゼブラフィッシュの目では、回転ディスク共焦点顕微鏡は、組織の深いイメージングには十分ではないことがわかりました。SPIM は非常に高速なイメージング時間を誇り、より広く使用されていますが、ビジュアライゼーションと分析のために大規模なデータセットを処理することは依然として課題です。対照的に、レーザースキャン共焦点顕微鏡は、特に光学ハードウェアの組み立てに関する専門知識を欠いている個人のために、簡単にアクセスできます。レーザースキャン共焦点顕微鏡の普及が、多くのラボで役立つことを期待しています。
ここでは、光学カップ形態形成の4Dデータセットを、膜およびクロマチン用の胚の トト 標識に使用する方法と、画像取得用のレーザー走査型共焦点顕微鏡( 図1で示す)を用いる方法を説明する。ここで使用される蛍光タンパク質(EGFP-CAAXおよびH2A.F/Z-mCherry)は、単一細胞分解能を有する組織標識を提供するために選択された。このプロトコルで生成されたデータセットを、さまざまな画像解析や可視化機能に使用します。このプロトコルは、他の細胞内構造が望まれる場合に容易に適応することができる。細胞形状の可視化のために選ばれた細胞膜標識:我々は、EGFP-CAAXを用い、H-rasの最後の21個のアミノ酸を、プレニル化シグナル配列として、EGFP13のC末流に融合させる。他の血漿膜標的蛍光タンパク質(例えば、膜貫通融合またはミリストア化)も同様に働く可能性が高い。核をマークするために、我々はH2Aを選択しました。F/Z-mCherry, mCherryがヒストンタンパク質に融合している13.これにより、有糸分裂のスピンドルの向きを含む細胞分裂が容易に可視化されます。
ライブイメージングアプローチでは、信号対雑音比、軸解像度、サンプル保存を最大化しながら、イメージング速度を向上させるトレードオフを考慮する必要があります。私たちは、画像品質と1回の実行で画像化することができる胚の数を最大化する方法を最適化しました。多くの場合、目標は、ホモ接合性変異胚における光学カップ形態形成を画像化するものであり、これは、視カップ形態形成の発症時およびヘテロ接合の子孫(胚の25%が所望の遺伝子型である)の野生型と区別できない可能性がある。画像取得を最適化し、その後多重化することにより、ホモ接合変異型胚のデータセットをキャプチャする可能性が高くなります。
時間分解、またはボリュームデータ(Zスタック)の取得頻度は、タイムラプスイメージングの重要な側面です。このようなデータセットの目的に応じて、速度に関する要件が異なります。当初、このプロトコルは手動4Dセルトラッキングのために開発されました。均一に標識された組織内の個々の細胞の追跡は、1つの細胞が時間の経過とともに連続的に追跡されているという確信を与えるのに十分な時間分解能を必要とします。我々は、ゼブラフィッシュの視用カップ形態形成のZスタックは、少なくとも12時間にわたって3.1分ごとに取得しなければならないことを発見した。ここでは、2.5分ごとに4~5個の胚のZスタックを取得できるように、レーザー走査共焦点顕微鏡での取得を最適化しました。
Z ステップ サイズの確立は、3D レンダリングと視覚化の場合、Z ステップ サイズが XY ピクセル次元に等しい等方性データが理想的なプロトコル最適化の重要なステップでした。実際には、イメージング時間とフォトブリーチングの制約を与えられ、ライブサンプルでこのようなタイムラプスデータを取得することは非常に困難です。したがって、適切なZステップサイズを決定することは、実験のレンダリングと可視化のニーズにとって重要であり、具体的には、速度を維持し、光の漂白を防ぎながら軸情報を最大化するために必要なX:Y:Zボクセル比が必要です。このプロトコルでは、確立されたボクセル比は1:1:3.5(0.6 μm x 0.6 μm x 2.1 μm Zステップサイズで、40倍長い作動距離の水浸漬目標を使用した場合)でした。Z深度130~140μmを取得すると、適切な時間分解能と少ない光の切り落としを伴うボリュームデータが得られます。
上で議論したように、このプロトコルは、ゼブラフィッシュの光学カップ形態素の4Dイメージングに特異的であり、細胞膜およびクロマチンに対して標識されたトトの胚、およびレーザー走査共焦点顕微鏡を用いる。以下のプロトコルは、さまざまな実験やニーズに簡単に適応できます。まず、細胞内構造に関しては、生細胞マーカーが存在するあらゆる構造を画像化することができる。次に、ここでの焦点は光学カップ形態形成のみに焦点を当てているが、タイムラプスイメージングは、眼の発達の他の段階に適応することができ、例えば、神経新生25、26、27、28、29、30、31、32、33。イメージング後の開発では、胚固定化(自発的な筋肉活動が約24hpfから始まる)、色素沈着(24時間前後に出現し始める)、組織サイズ(眼の神経発生時に体積が著しく成長する)、イメージング速度(対象プロセスの速度に応じて調整する必要があります)を考慮する必要があります。これらの考慮事項はすべて、容易に管理できます。プロトコルは非常に柔軟です。ここでの特定のプロトコルの詳細に加えて、目の発達の他の側面をライブイメージングに興味のある人を支援する一般的な原則があります。

<table><tbody><tr><td>デルタTPG皿0.17mm透明</td><td>Bioptechs</td><td>0420041500C</td><td>カバーガラス底光学互換性使い捨て</td></tr><tr><td>パスツールピペット</td><td>VWR</td><td>14672-608</td><td>全長14.6cm(53/4")</td></tr><tr><td>デュモン#5、#55、または #5SF 鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11254-20</td><td>スタイル#5の場合:ストレートチップ、0.05 x 0.01 mmチップ、イノックス、長さ11 cm</td></tr>フ<tr><td>レーミング/ブラウンマイクロピペットプーラー</td><td>Sutter</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Immersol W</td><td>Carl Zeiss Microscopy</td><td>4449690000000</td><td>水排出対物レンズ用浸漬液、ハロゲンフリー、低蛍光</td></tr><tr><td>マイクロインジェクション モールド</td><td>適応科学ツール</td><td>TU-1</td><td>6つのランプ、1つは90度、もう1つは45度の面取り面。</td></tr><tr><td>マイクロローダーのヒント</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td>Microloader、ガラスマイクロキャピラリー充填用チップ、0.5 &ndash; 20 & micro;L</td></tr><tr><td>mMessage mMachine SP6 Transcription Kit</td><td>Invitrogen</td><td>AM1340</td><td>には、SP6 Enzyme Mix、10X Reaction Buffer、2XNTP&frasl が含まれています。CAP溶液、GTP溶液、pTRI-Xef、TURBO DNase、酢酸アンモニウム停止溶液、塩化リチウム沈殿溶液、およびゲルローディングバッファーはすべて&ndashに保存されています。20°C.ヌクレアーゼフリーの水は、任意の温度で保存できます。</td></tr><tr><td>ニコンSMZ645実体顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>SMZ645</td>は<td>、胚の注入に使用されます(図2Bを参照)</td></tr><tr><td>NotI-HF酵素</td><td>NEB</td><td>R3189S</td><td>は、ゲルローディング染料、パープル(6X)</td></tr><tr><td>NuSieve GTGアガロー</td>ス<td>ロンザ</td><td>50081</td><td>細かい解像度、低溶融アガロー</td></tr>ス<tr><td>対物レンズLD "C-アポクロマート" 40x/1.1 W Korr M27</td>カール<td>ツァイス顕微鏡421867-9970-000</td><td></td><td></td></tr>が付属しています<tr><td>オリンパスSZX16実体顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>SZX2-ZB16</td>は<td>、スクリーニング、胚の埋め込みに使用されます(図3Aを参照)</td></tr><tr><td>フェノールレッド溶液</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>P0290</td><td>0.5%DPBS、滅菌ろ過、エンドトキシン試験、細胞培養試験</td></tr><tr><td>ピコリットルマイクロインジェクター</td><td>ハーバード装置</td><td>PLI-100</td><td>フェムトリットルからマイクロリットルへの注射;注入回数、時間、圧力のデジタル表示。注入、バランス、クリア、充填、ホールドを含む5つの圧力が含まれています</td></tr><tr><td>ピペットポンプピペット</td><td>SP Bel-Art</td><td>F37898</td>は<td>、使い捨てパスツールピペットに適合し、吸引または分配用の側面と迅速な空のためのプランジャーのサムホイールが含まれています</td></tr><tr><td>プレミアム薄肉ホウケイ酸ガラスキャピラリー</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td>G100T-4</td><td>1.0 x 0.78 mm</td></tr><tr><td>QIAquick PCR精製キット</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td>QIAquickスピンカラム、バッファー、コレクションチューブ(2 ml)が含まれています</td></tr><tr><td>RNaseフリーH2O</td><td>Invitrogen</td><td>AM9906</td><td>DNaseフリー、分子生物学グレード、RNaseフリーRNeasy</td></tr><tr><td>ミニキット</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>には、RNeasyミニスピンカラム、コレクションチューブ(1.5 mlおよび2 ml)、RNaseフリー試薬およびバッファー</td></tr><tr><td>ステージアタッチメントが含まれています Z PIEZO WSB 500</td><td>Carl Zeiss Microscopy</td><td>432339-9000-000</td><td></td></tr><tr><td>ステージインサート Z ピエゾ WSB ユニバーサル</td><td>カールツァイス顕微鏡</td><td>432339-9030-000</td><td></td></tr><tr><td>ツァイス LSM 880 エアスキャン付き</td><td>カールツァイス顕微鏡</td><td>N/A</td><td>倒立型 Axio Observer 顕微鏡</td></tr><tr><td>Zen Black 2.3 SP1 ソフトウェア</td><td>カールツァイス顕微鏡</td><td>N/A</td><td>ツァイス・エフィシェント・ナビゲーション (ZEN) は、ツァイスのすべての光学顕微鏡システムを制御します</td></tr></tbody></table>

ゼブラフィッシュオプティクスカップ形態形成の4次元イメージング

4-Dimensional Imaging of Zebrafish Optic Cup Morphogenesis

視覚システム機能は精密な組織および器官の構造の確立を必要とする。脊椎動物の目では、構造的欠陥は視覚障害の一般的な原因であるが、眼形態形成のメカニズムはまだ十分に理解されていない。胚性眼の基本的な組織は脊椎動物全体で保存され、したがってゼブラフィッシュ胚の生画像化は、正常および病理学的状態下でリアルタイムで目の発達を直接観察するための強力なアプローチとなっている。動き、形態、相互作用、分裂、死を含む動的細胞プロセスを胚で可視化することができる。ゼブラフィッシュにおける初期の眼の発達における細胞下構造とタイムラプス共焦点顕微鏡の均一標識法を開発した。このプロトコルは、1細胞ゼブラフィッシュ胚への注入のためのキャップ付きmRNAを生成し、光学小胞段階で胚を取り付け(受精後12時間、hpf)、レーザー走査共焦点顕微鏡で光学カップ形態素の多次元タイムラプスイメージングを行い、複数のデータセットが同じイメージングセッションで連続して取得されるようにする方法を概説する。このようなアプローチでは、セルの追跡、体積測定、3 次元 (3D) レンダリング、視覚化など、さまざまな目的に使用できるデータが得られます。私たちのアプローチは、野生型と遺伝子変異条件の両方で、光学カップの開発を促進する細胞および分子メカニズムを特定することを可能にします。これらの方法は、他のグループによって直接採用されるか、またはゼブラフィッシュの眼の発達の多くの追加の側面を視覚化するために適応することができる。

このプロトコルは、ゼブラフィッシュ早期眼の開発におけるトトラベリングおよび多次元イメージングのアプローチを記述する。レーザー走査共焦点顕微鏡によるラベリング、埋め込み、4次元(4D)イメージング、および光学カップ形態形成の解剖機構のためのデータセットの取得を最適化するための考慮事項について述べる。

Visual system function requires the establishment of precise tissue and organ structures. In the vertebrate eye, structural defects are a common cause of ...

目の形態形成に関する我々の理解は、以前の固定組織研究から来ている。しかし、これらの研究は細胞および組織のダイナミクスを欠いていた。タイムラプスイメージングを使用して、可視化と分析のためにこのプロセス全体をキャプチャすることができます。生画像化を容易にするゼブラフィッシュ胚の光学的明瞭化における外部開発を利用し、ほとんどの研究キャンパスで容易に入手可能なレーザー走査共焦点顕微鏡を用いる。この方法を新しく作成する研究者は、使用できるデータセットを取得する前に、試行錯誤を期待する必要があります。多くのステップ, 特に注射や埋め込み, 成功のためにうまくいく必要がありますので、忍耐を持っています.ゼブラフィッシュが繁殖し始めると、卵が受精することを確実にするために15〜20分待っている間に、P10ピペットとP10マイクロリットルの先端を使用して、引っ張られたガラス毛細管マイクロ注入針を2.5〜5マイクロリットルのRNA希釈でバックロードします。卵の準備ができたら、移送ピペットと解剖顕微鏡を使用して卵を慎重に射出型にロードし、鉗子を使用して胚を転がして必要に応じて単一の細胞が見えるようにします。次に、1細胞段階ですべての胚を注入し、卵黄ではなく細胞を標的にして、現像胚の均一な標識を確保する。受精後約11時間で、42°Cの熱ブロックにE3培地中の1.6%低融解アガロースの1〜5ミリリットルのアリコートを置き、蛍光顕微鏡を使用して、蛍光の全体的な明るさを持つ胚をスクリーニングします。胚を適切にステージングするためにスマイトを数えます。受精後11時間で、3つのスマイトが観察されるべきである。理想的なサンプルは、強力なEGFPとmCherry信号を有し、正しい発達段階にある。取り付ける前に、寒天コーティングされた皿に胚を入れ、鉗子を使用して各胚から絨毛を取り除きます。すべての胚が脱裸になったら、ガラスローラーピペットを使用して1つの胚を吸引する。胚がガラスパスツールピペットの先端に座り、胚を熱ブロックからアガロースのチューブに落とすように、できるだけ多くのE3を排出します。胚がピペットの先端に残っていることを注意して、胚が胚と一緒に少量のアガロースを吸引する前に、胚を数秒間アガロースに沈ませます。胚とアガロースをガラス底皿のアガロース液滴に排出し、アガロース液滴が硬化する前に、迅速に、しかし慎重に鉗子を使用して胚の後側を下に向けます。同じ方法で10〜12個の胚を取り付けた後、単一のアガロースディスク内のすべての液滴を包む皿の底を完全に覆うのに十分なアガロースを加える。アガロースが硬化すると、アガロース上の層E3がサンプルを水分補給し続ける。レーザー走査共焦点顕微鏡をタイムラプスイメージングの適切なパラメータに設定した後、ガラス底皿の下側に水の屈折率に一致する浸漬媒体を自由にコーティングし、気泡を避けるように気を付け、40X水目的に少量の浸漬媒体を適用します。ステージインサートでガラス底皿を固定し、胚を一晩湿らせたままにするためにE3培地を追加します。モデリングクレイを使用して、プラスチック製の蓋を皿の上に密封し、皿と接触する目的を上げます。顕微鏡ソフトウェアの位置見出しの下で、クリックして追加をクリックして、タイムラプスされる最初のサンプルのXYZ情報を保存し、強い蛍光と最適な取り付けでサンプルを選択します。[検索] タブで、次のサンプルを検索し、[位置] をクリックしてサンプルを選択します ( を参照) します。すべてのサンプルを選択したら、最初の位置をハイライト表示して[移動]をクリックします。連続的にスキャンしながら、フレーム内の視小胞を並べ、視小胞と脳に対して前および遠位領域に十分なスペースを残します。最初と最後のZスライスを割り当てるには、最初にセットを選択し、細かいフォーカスノブでZ方向を移動しながら最後に設定し、光学カップの成長に対応するために約63の総スライス数を維持します。成長のための部屋を可能にするために、視小胞の腹側に余分な部屋を含める。最初と最後の Z スライスを設定したら、C をクリックして Z スタックの中心に移動し、両方のレーザーのレーザーパワーとゲインを調整します。レーザーのパワーとゲインが設定されたら、スキャンを停止し、[更新]をクリックして位置情報を更新します。次の位置に移動するには、2 桁の位置をクリックします。最初と最後の Z スライスの両方を定義したら、時系列の見出しを開き、サイクル数を 300 に、時間間隔を 2.5 分に設定します。設定を確認してすべてが確定したことを確認したら、[開始] をクリックしてタイムラプスを開始し、最初の一回のイメージングが正しくキャプチャされていることを確認してから、タイムラプスを一晩実行できるようにします。単一細胞への直接注入は、均一な標識および強い蛍光のために必要である。アガロースに浸漬すると、胚は皿全体に均等に配置されるべきです。胚が正しくステージングされ、十分に蛍光性があり、十分に取り付けられている場合、それらはタイムラプス中にイメージングフレームに残り、臓器全体を画像化することができます。水平または対角線のような、後軸に沿って向いていないサンプルは、タイムラプスが進むにつれてイメージングフレームから成長し、それ以上の分析には使用できません。過剰に回転した胚は、より後回しになります。回転が少ない胚は、最も前部組織のみを観察することを可能にする。さらに、フレームの向きに関して取り付けられたサンプルは、タイムラプスを成功に導く可能性が高くなります。腹側に対するこのバイアスは、最適なタイムラプスをもたらす腹側方向の組織成長のための余分なスペースを提供する。これらの基準が満たされない場合、タイムラプスは組織の3Dボリューム全体をキャプチャしなくなり、それ以上の分析に使用できなくなります。これらの情報が豊富なデータセットは、細胞速度と軌道の定量化による4D細胞追跡、細胞および組織の体積測定、3Dおよび4Dビジュアライゼーションなど、さまざまな方法で分析できます。

4-dimensional-imaging-of-zebrafish-optic-cup-morphogenesis

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JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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