インビトロ蛍光顕微鏡ベースの運動アッセイのミオシン特異的適応
February 4th, 2021
ここで提示されるミオシン5aを発現および精製する手順は、その特徴付け、アンサンブルおよび単分子の両方を用いて蛍光顕微鏡ベースのアッセイ、およびこれらの方法を非筋筋筋筋2bの特徴付けのためにどのように修飾することができるかである。
このプロトコルは、非筋肉筋筋のダイナミクスをタンパク質レベルで特徴付けるために使用することができ、細胞内での役割に寄与する運動特性を知らせることができる。これは、様々な調節条件がミオシン運動に及ぼす影響を研究し、細胞行動を知らせる高速で再現性の高い高度に制御された方法です。これらの技術は、非筋肉ミオシンの疾患を引き起こす突然変異が単一分子およびアンサンブルレベルでの行動にどのような影響を与えるかを調べるのに使用することができる。
その方法論の一般的なアプローチは、微小管を用いた精製キネシンおよびダイニンの特性化など、他の様々な細胞骨格系に適用することができる。このプロトコルの汎用性は、どの蛍光器と化学条件が最も適切であるかについての疑問を提起することができますが、方法は比較的迅速に最適化することができます。フローチャンバーの設置方法とコーティング方法を理解することで、これらの実験のさまざまな条件に適応できる強力な基礎となります。
まず、アセテートアミルにニトロセルロース溶液を1%用意し、組織培養プレートの底部に直径125ミリメートルの円形のろ紙を置きます。8つの正方形のカバースリップをラックに積み込み、約2〜5ミリリットルの200プルーフエタノールで十分に洗浄し、続いて蒸留水を2〜5ミリリットルで洗浄します。その後、フィルターエアラインまたは窒素ラインを使用してカバースリップを完全に駆動します。
1つのカバースリップの1つの端に沿って1パーセントのニトロセルロース溶液のゆっくりとピペット10マイクロリットル。1つの滑らかな動きで200マイクロリットルのピペットの先端の側面を使用してカバースリップの残りの部分にそれを塗りつぶす。次に、ニトロセルロース側を上にして、このカバースリップを組織培養皿の上に置きます。
残りのカバースリップに対してこれを繰り返し、乾燥させます。光学レンズ紙で顕微鏡スライドを拭き取り、大きな破片を取り除きます。両面テープを2枚、長さ約2センチメートル切り、顕微鏡スライドの長い端の中央に沿って1枚を置きます。
テープの2番目の部分は、2枚が平行になるようにテープの最初の部分の下に約2ミリメートルを置き、約10マイクロリットルの溶液を保持できる流れチャンバを作成します。ニトロセルロースカバーのスリップの1つをテープに慎重に貼り付け、ニトロセルロースでコーティングされた側がテープに直接接触するようにします。ピペットチップを使用して、スライドテープインターフェースを軽く押し下げて、カバースリップがスライドに正しく付着していることを確認します。
その後、かみそりの刃でスライドの端にぶら下がっている余分なテープをカットします。ミオシン5aの溶液を準備し、氷の上に保管してください。ミオシン5aの10マイクロリットルの流れはスライド流チャンバーを通り、1分間待つ。
その後、DTTと運動バッファーでミリリットルBSAあたり1ミリグラムの10マイクロリットルで流れます。これを2回繰り返し、3回目の洗浄の後に1分待ちます。ティッシュペーパーまたはフィルターペーパーのコーナーを使用して、流れチャンバー出口に紙の角をそっと置くことによって、流路を通して溶液を芯に入れます。
その後、DTTで運動バッファーの10マイクロリットルで洗浄します。1ミリリットルのシリンジと27ゲージの針を使用した黒いアクチン溶液をピペットし、その溶液をチャンバーに導入する前にアクチンフィラメントを剪断します。1ミリモルDTTで50ミリモルMBの1ミリモルATPの存在下でチャンバーに黒いアクチンを追加します。
次に、DTTと1ミリモルATPを用いた運動バッファーの50マイクロリットルで流れ、フリーアクチンフィラメントのチャンバーを枯渇させた。10マイクロリットルの運動バッファーをDTTで3回洗浄し、任意のATPのチャンバーを枯渇します。DTTを有する運動性バッファーを含む20ナノモルRHアクチン溶液の10マイクロリットル内の流れ、カバースリップの表面に付着したミオシン5aへのアクチンフィラメントの厳格な結合を可能にする1分間待つ。
DTTで10ミリモル運動バッファーの10マイクロリットルで洗浄し、非結合RHアクチンフィラメントを除去します。最終バッファーの30マイクロリットルで流れる。561ナノメートルの励起波長を用いて蛍光顕微鏡で画像を記録し、RHアクチンを可視化します。
ミオシン5a反転運動アッセイの溶液を準備し、氷の上に保管してください。DTTで10マイクロリットルの運動バッファーでチャンバーを洗浄してください。DTTを有する運動バッファーで1ミリグラムBSAあたり1ミリグラムの10マイクロリットルで流れる。
これを2回繰り返し、3回目の洗浄の1分後に待ちます。流れチャンバ出口に紙の角をそっと置くことによって、流路を通して溶液を芯にするティッシュまたはフィルターペーパーを使用してください。その後、DTTで10マイクロリットルの運動バッファーでチャンバーを3回洗浄します。
ニュートラアビジン溶液の10マイクロリットルの流れをDTTで運動バッファーに入れ、1分間待ちます。その後、その溶液の10マイクロリットルで3回洗浄します。大退屈なピペットチップを用いたDTTによる運動性バッファーを含むBRHアクチンの10マイクロリットルの流れ。
そして1分間待ちます。その後、10マイクロリットルの運動バッファーをDTTで3回洗浄します。10ナノモルミオシン5aを有する最終バッファーの30マイクロリットルの流れ。
そして、すぐに全内部反射の蛍光顕微鏡に荷を積む。TIRFイメージングに最適なフォーカスが見つかったら、記録を開始します。非筋ミオシン2bの精製は、必須の軽鎖、及び調節性軽鎖、ならびにミオシン5a及びカルモジュリンをSDS-PAGEを行うことにより評価した。
グライダーアクチンフィラメントアッセイは、ラベル付きアクチンフィラメントの滑らかな動きを特徴とする理想的で追跡可能な映画の特徴を示しています。黒いアクチン洗浄により、死んだミオシンヘッドが測定フィールドから取り除かれ、アクチンフィラメントの全体的な滑らかな動きにさらに寄与することが保証されました。フィラメント追跡出力画像は、非筋肉ミオシン2bおよびミオシン5aに対して高速トラックプログラムから得られた。
代表的なヒストグラムは、アクトミオシン2b滑空速度が毎秒77ナノメートルであることを示しています。そして、アトミオシン5aのそれは515ナノメートル/秒です。メチルセルロースがない場合、アクチンフィラメントはミオシンコーティングされた表面によって密接に関連付けが残らず、非筋肉ミオシン2bコーティングカバースリップの表面に近いフロッピングを引き起こす。
ミオシンの動きは、反転運動アッセイを用いて表面につながれた蛍光アクチンフィラメントで観察された。黒いアクチン洗浄用のフローセルに導入する前に、ラベルなしのアクチンを剪断することが重要であり、アクチンの転位をスムーズに行うことが可能です。その他の実験では、ミオシンの運動性がミオシン突然変異、負荷誘導タンパク質、イオン強度、および調節タンパク質によってどのように影響を受けるかを調べることができます。
様々な細胞条件は、将来の研究のために再構成することができます.これらの方法は、様々なミオシンアイソフォームが単一分子およびアンサンブルレベルでのそれらの運動性および機械的特性においてどのように変化するかを生化学的および生物物理学的に調査することを可能にする。
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概要
このプロトコルは、ミオシン5aの発現と精製、およびそのin vitro蛍光顕微鏡アッセイによる特徴付けを詳細に説明しています。また、非筋ミオシン2bの研究のための修正についても説明しています。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 生化学
- 細胞生物学
- 神経科学
背景
- ミオシンは細胞の運動性に重要な役割を果たします。
- ミオシンのダイナミクスを理解することは、細胞内での機能を解明するために不可欠です。
- 非筋ミオシンはさまざまな細胞プロセスに関与しています。
- 特徴付け技術は、ミオシンの挙動における変異の影響を明らかにすることができます。
研究の目的
- タンパク質レベルでの非筋ミオシンダイナミクスを特徴付けること。
- 細胞の役割に寄与する運動特性について情報を得ること。
- 調節条件がミオシンの運動性に与える影響を調査すること。
使用された方法
- アンサンブルおよび単分子蛍光顕微鏡。
- 精製ミオシンの特徴付け。
- 蛍光色素と化学条件の最適化。
- 実験のためのフローチャンバーのセットアップとコーティング。
主な結果
- このプロトコルは迅速で、再現可能で、高度に制御されています。
- 非筋ミオシンにおける疾患原因変異の研究を可能にします。
- 他の細胞骨格系にも適用可能な多用途な方法論。
- さまざまな実験条件のための迅速な最適化。
結論
- ミオシンダイナミクスを理解することで、細胞の挙動に関する知識が深まります。
- この方法は将来の研究のための強固な基盤を提供します。
- 健康と疾患におけるミオシン機能に関する重要な疑問を提起します。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This protocol enables quantitative characterization of myosin motility at single molecule and ensemble levels, providing mechanistic insights into motor protein function. It supports target validation by linking biochemical properties to cellular phenotypes, informing de-risking of myosin-directed therapeutic strategies. The approach is adaptable to disease-relevant models, facilitating preclinical evaluation of myosin isoform dynamics under controlled conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of myosin mechanochemistry to clarify functional roles in cellular transport and adhesion.
- Operational Value: Provides reproducible, quantitative readouts of translocation velocity and run length for target engagement assessment.
- Predictive Value: Supports hypothesis testing of how regulatory conditions or mutations alter motor protein behavior, aiding in target confidence scoring.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, fluorescence-based motility assays compatible with high-content imaging for compound screening.
- Quantitative Output: Delivers measurable parameters such as actin translocation velocity and single molecule run length for dose-response analysis.
- Platform Reuse: Adaptable to other cytoskeletal systems (e.g., kinesin/dynein with microtubules), enabling cross-target assay portability.
Translational & Preclinical Research
- Disease Modeling: Allows reconstitution of cellular conditions to study disease-causing mutations in non-muscle myosins at the protein level.
- Mechanistic De-risking: Links molecular motility defects to cellular phenotypes, supporting translational biomarker alignment.
- Preclinical Continuity: Bridges discovery-stage target validation with preclinical functional assessment through conserved assay format.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to lead optimization, offering biophysical characterization that informs structure-function relationships in motor proteins.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and functional validation of myosin isoforms through direct observation of motility dynamics.
- Screening: Enables assay standardization and reproducibility for evaluating compound effects on motor protein activity under controlled buffer conditions.
- Analytics: Provides quantitative measurements of velocity and processivity that allow comparison across isoforms, mutants, or treatment conditions.
- Translational Research: Connects single molecule behavior to ensemble-level outputs relevant to cellular functions like cytokinesis and tension maintenance.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying diverse motor proteins across therapeutic areas, reducing assay redevelopment effort.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in myosin mechanochemical coupling.
- Operational Value: Ensures assay reproducibility and standardization across laboratories through defined flow chamber preparation and imaging protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of motility-altering mutations or regulatory effects.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of myosin targets based on validated functional domains and motility profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein purification, fluorescence microscopy, and image analysis for motility tracking.
- Depends on access to TIRF or widefield fluorescence microscopy systems and flow chamber fabrication capabilities.
- Necessitates standardization of buffer conditions, ATP concentrations, and fluorophore selection across experimental replicates.
- Involves optimization considerations for different myosin isoforms regarding surface density, ionic strength, and regulatory protein inclusion.
- Limited by the need for purified, functional protein preparations; activity may be affected by tags, degradation, or improper folding.
