Name: インビトロ蛍光顕微鏡ベースの運動アッセイのミオシン特異的適応 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-04T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: 学ぶ蛍光顕微鏡を用いたミオシン5aの運動アッセイ法。非筋性ミオシンの動態をタンパク質レベルで解析し、細胞内機能と疾患関連変異の影響を解明する再現性の高い手法です。

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このデータ収集に使用する試薬の製造に関する技術的支援に関して、ファン・ザン博士に感謝します。この研究は、NHLBI/NIHイントラウォールリサーチプログラムがHL001786からJ.R.S.に資金を提供することで支援されました。

著者らは利益相反を宣言しない。

ここで提示されるミオシン5aおよび非筋筋筋筋2bの精製およびインビトロ特徴付けのためのワークフローである。この実験は、精製ミオシン構築物のメカノケミカル特性を迅速かつ再現可能な方法で定量するのに有用である。ここに示す2つのミオシンは、多くの可能性のうち2つの具体例に過ぎませんが、条件と技術は、ほとんどのミオシンおよび他の多くの運動タンパク質に、いくつかの仕立てで適用することができます。
ここで説明するプロトコルは、ラボや実験の個々のニーズに応じて、さまざまな影響を受けます。例えば、発現と分子生物学のセクションで説明したように、この論文で使用されるタンパク質は、2つ以上のウイルスの共感染から生成された。しかし、p-FastBac二重発現ベクターやBiGBac発現システム53のような多発現ベクターを用いてタンパク質発現を成功に導くこともある。
いくつかの要因は、組換えタンパク質の成功の生産を妨げる可能性があります。タンパク質の分解を防ぐためには、タンパク質精製のすべてのステップが適切...

ミオシンは、アデノシン三リン酸(ATP)加水分解に由来するエネルギーを用いてアクチンフィラメントに力を発揮する運動タンパク質である。ミオシンには頭、首、尾のドメインが含まれています。ヘッドドメインは、ATP結合および加水分解の部位と同様にアクチン結合領域を含む。首のドメインは、軽鎖、カルモジュリン、またはカルモジュリン様タンパク質2、3に結合するIQモチーフで構成されています。尾部領域は、ミオシンの各クラスに特有のいくつかの機能を有し、2つの重鎖の二量体化、貨物分子の結合、およびヘッドドメイン1との自己抑制相互作用によるミオシンの調節を含むがこれらに限定されない。
ミオシンの運動特性はクラスによって大きく異なります。これらの特性の一部は、義務比(ミオシンがアクチンに結合しているミオシンの機械的周期の割合)およびプロセス性(剥離前にそのトラック上で複数のステップを行うモーターの能力)を含む4。40以上のミオシンクラスは、配列解析5、6、7、8に基づいて決定された。クラス2ミオシンは、最初に研究されたので、「従来」に分類されます。したがって、ミオシンの他のすべてのクラスは、「型破り」に分類されます。
ミオシン5a(M5a)はクラス5ミオシンであり、プロセスモーターであり、解離する前にアクチンに沿って複数のステップを取ることができることを意味する。これは、高いデューティ比を有し、その機械的サイクルの大部分をアクチン9、10、11、12、13、14に結合して費やしていることを示している。他のミオシンと共通して、重鎖はアクチン結合およびATP加水分解部位の両方を含むN末端モータードメインを含み、続いてレバーアームとして機能する首領域を含み、本質的な軽鎖(ELC)およびカルモジュリン(CaM)15に結合する6つのIQモチーフを有する。尾部領域にはαらせんコイルコイルが含まれており、分子を二量体化し、続いて貨物を結合するための球状尾部領域が続きます。その運動論は、メラノサイトにおけるメラノソームの輸送およびプルキンジェニューロン16,17における小胞体の輸送への関与を反映している。M5aは原型貨物輸送モータ18と考えられている。
クラス2ミオシン、または従来のミオシンは、非筋筋ミオシン2(NM2)アイソフォームに加えて骨格、心臓、平滑筋の収縮に力を与えるミオシン、NM2a、2b、および2c19を含む。NM2アイソフォームは、全ての細胞の細胞質に見出され、サイトカネシス、接着、組織形態形成、および細胞遊マイグレーション19、20、21、22において役割を共有している。本論文では、非筋ミオシン2b(NM2b)23の文脈における従来のミオシンプロトコルについて論議する。NM2bは、M5aと比較して、低いデューティ比を有し、0.2 s-123のVmaxのVを有する酵素的に遅い≈18 s-124のM5aのVmaxと比較した。特に、2つのヘッドを持つ切り捨てられたNM2bコンストラクトは、アクチン上で処理的に容易に移動しません。むしろ、アクチンとの出会いのたびに、パワーストロークが発生し、その後に分子25が解離される。
NM2bには2つのミオシン重鎖が含まれ、それぞれに1つの球状頭ドメイン、1つのレバーアーム(ELCと1つの調節軽鎖(RLC))、およびαヘリカルコイルコイルロッド/テールドメイン(約1,100アミノ酸長)が含まれ、これら2つの重鎖を二量体化します。NM2bの酵素活性および構造状態は、RLC23のリン酸化によって調節される。非リン酸化NM2bは、ATPおよび生理的イオン強度(約150mM塩)の存在下で、2つの頭部が非対称相互作用に関与し、尾部が23の2箇所で頭の上に折り畳まれるコンパクトな立体構造を採用している。この状態では、ミオシンはアクチンと強く相互作用せず、酵素活性が非常に低い。カルモジュリン依存性ミオシン軽鎖キナーゼ(MLCK)またはRho関連プロテインキナーゼによるRLCリン酸化の際、その分子は尾部を通して他のミオシンと結合して、約30個のミオシン分子23の双極性フィラメントを形成する。RLCの前述のリン酸化はまた、NM2bのアクチン活性化ATPase活性を約4倍の26、27、28に増加させる。このバイポーラフィラメントの配置は、各端に多くのミオシンモーターを搭載し、収縮および張力維持における役割に最適化されており、対立する極性を有するアクチンフィラメントを互いに23,29に対して相対的に移動させることができる。したがって、NM2bはアクチンと相互作用する際にモータのアンサンブルとして機能することが示されている。このフィラメント内の多数のモータにより、NM2bフィラメントはアクチンフィラメント上でプロセス的に移動でき、インビトロフィラメントの加工性を29を特徴付け可能にする。
細胞内のミオシンの役割を理解する上で進歩が見られましたが、タンパク質レベルで個々の特性を理解する必要があります。細胞内ではなく、単純なタンパク質とタンパク質相互作用レベルでのアクトミオシン相互作用を理解するために、インビトロ研究で使用するために組み換えミオシンを発現し、精製することができます。このような研究の結果は、メカノバイオスレーターに、最終的に複雑な細胞プロセスを駆動する特定のミオシンの生物物理学的性質について知らせる12,13,14,25,29.通常、これは、全長または切り捨てられたミオシンコンストラクトにアフィニティタグを追加し、アフィニティークロマトグラフィー29、30、31を介して精製することによって達成される。さらに、この構築物は、遺伝的にエンコエーブルなフルオロフォアまたは合成フルオロフォアでのタンパク質標識用のタグを含むように設計することができる。このような蛍光標識を添加することにより、ミオシン力学および運動学を観察する単一分子イメージング研究が行える。
精製後、ミオシンは、いくつかの方法で特徴づけることができる。ATPase活性は、異なる条件32の下でモータの全体的なエネルギー消費量とアクチン親和性についての洞察を提供する、色分け法によって測定することができる。その運動性のメカノケミストリーについて学ぶためには、さらなる実験が必要です。本論文では、精製ミオシンタンパク質の運動特性を特徴付けるために使用できる2つのin vitro蛍光顕微鏡ベースの方法について詳しく述べています。
これらの方法の第1は、滑空アクチンフィラメントアッセイであり、ミオシンモータのアンサンブル特性を定量的に研究し、精製タンパク質33のバッチの品質を定性的に研究することができる。本論文では、本アッセイに対する全内部反射蛍光(TIRF)顕微鏡の使用について論じるが、これらの実験は、多くの研究室34に広く見られるデジタルカメラを搭載した広視野蛍光顕微鏡を用いて効果的に行うことができる。このアッセイでは、ミオシンモータの飽和層がカバースリップに取り付けられています。これはニトロセルロース、抗体、膜、SiO2-誘導体化表面(トリメチルクロロシランなど)を用いて達成できるが、とりわけ29、33、35、36、37、38。蛍光標識アクチンフィラメントはカバースリップチャンバーを通過し、その上にアクチンが表面に付着したミオシンに結合する。ATP(およびNM2の研究におけるキナーゼ)を添加すると、チャンバーは、表面結合ミオシンによるアクチンフィラメントの転位を観察するために画像化される。トラッキングソフトウェアは、各滑空アクチンフィラメントの速度と長さを相関させるために使用することができます。解析ソフトウェアは、移動型および静止型アクチンフィラメントの数の測定値を提供することもできるため、所定のミオシン製剤の品質を判断するのに有用である可能性があります。失速したフィラメントの割合は、アクチンの表面テザリングによって他のタンパク質に対する意図的に変調し、ミオシン39の負荷依存性を決定するために測定することもできる。各アクチンフィラメントは多数の利用可能なモータによって推進できるため、このアッセイは非常に再現性が高く、最終的な測定速度は、開始ミオシン濃度の変化や溶液内の追加の因子の存在などの摂動に強い。これは、変化したリン酸化、温度、イオン強度、溶液粘度、表面テザーによって誘発される負荷の影響など、異なる条件下でミオシン活性を研究するために容易に変更できることを意味します。ATP加水分解ができない強結合ミオシン「デッドヘッド」などの要因は、アクチンフィラメントの停滞を引き起こす可能性がありますが、そのような問題を軽減し、正確な測定を可能にする複数の方法があります。ミオシンの運動特性はクラスによって大きく異なり、使用される特定のミオシンに応じて、このアッセイにおけるアクチンフィラメント滑空の速度は20 nm/s(ミオシン9)40、41、および60,000nm/s(シャラセアンミオシン11)42の下で変化する可能性がある。
第2アッセイは、滑空アクチンフィラメントアッセイ12の幾何学を反転させる。ここで、アクチンフィラメントはカバースリップ表面に付着しており、M5aの単一分子またはNM2bの個々の双極性フィラメントの動きが可視化される。このアッセイは、アクチン上の単一のミオシン分子またはフィラメントの実行長および速度を定量化するために使用することができる。カバースリップは、非特異的結合をブロックし、同時にビオチンポリエチレングリコール(ビオチン-PEG)などの表面を機能させる化学化合物でコーティングされています。修飾アビジン誘導体の添加は、表面を素数化し、ビオチン化アクチンがチャンバーを通過し、チャンバーの底に安定して結合したF-アクチンの層をもたらす。最後に、活性化および蛍光標識ミオシン(通常1-100 nM)がチャンバーを流れ、次いで静止したアクチンフィラメント上のミオシンの動きを観察するために画像化される。
これらのモダリティは、非筋肉と筋ミオシンの両方のダイナミクスを調べるために採用することができる迅速かつ再現可能な方法を表します。本報告書は、M5aとNM2bの両方を精製し、特徴付ける手順を概説し、それぞれ非伝統的なミオシンを表す。その後、ミオシン特異的な適応の一部について議論が行われ、2種類のアッセイで動きのキャプチャを成功させるために行うことができる。
発現・分子生物学 対象のミオシンのcDNAは、M5a-HMMを発現する場合はC末端FLAGタグ(DYKDDDK)、またはNM2b23、43、44、45、46の全長分子を発現する場合はN末端FLAGタグのために符号化する修正されたpFastBac1ベクターにクローン化されなければならない。NM2b上のC末端FLAGタグは、FLAG-アフィニティーカラムに対するタンパク質の親和性が弱くなります。対照的に、N末端FLAGタグ付きタンパク質は、通常、FLAGアフィニティーカラム23によく結合する。N末端にタグ付けされたタンパク質は、酵素活性、機械的活性およびリン酸化依存性調節23を保持する。
本論文では、フラグタグとミオシン重鎖のC末語との間にGFPを有する切り捨てられたマウスM5a重メロミオシン(HMM)様の構造を用いた。NM2bとは異なり、M5a-HMMはN端子またはC端子FLAGタグで正常にタグ付けおよび精製することができ、どちらの場合も結果として得られる構成体がアクティブになることに注意してください。M5a重鎖はアミノ酸1090で切り捨てられ、M5a47のGFPとコイルコイル領域との間に3つのアミノ酸リンカー(GCG)を含む。GFP と FLAG タグの間にリンカーが追加されなかった。M5a-HMMはカルモジュリンと共に発現した。全長ヒトNM2b構築物をELCおよびRLCと共に発現した。RLCのN末語を5アミノ酸のリンカーを介してGFPと融合した(SGLRS)。FLAGタグに直接アタッチされたのはハロタグでした。ハロタグとミオシン重鎖のN末語との間には、2つのアミノ酸(AS)からなるリンカーであった。
両方のミオシン製剤を、約2 x 106細胞/mLの密度でバキュロウイルスに感染したSf9細胞培養物の1リットルから精製した。各サブユニットのバキュロウイルスの量は、メーカーの指示によって決定されるウイルスの感染の多重度に依存した。M5aの場合、細胞はカルモジュリン用の2つの異なるバキュロウイルス1とM5a重鎖用の1つを共感染した。NM2bの場合、細胞はELC用の3つの異なるウイルス1、RLC用、NM2b重鎖用のウイルス1種と共感染した。多様なミオシン(または他の多複雑なタンパク質)を扱うラボでは、重鎖と軽鎖の多くの組み合わせを可能にし、カルモジュリンなどの一般的に使用される軽鎖は、多くの異なるミオシン重鎖と共にトランスフェクションすることができるので、このアプローチは効率的です。すべての細胞作業は、汚染を避けるために適切な滅菌技術を備えたバイオセーフティキャビネットで完了しました。
M5aおよびNM2bの両方の発現に関して、組換えミオシンを産生する Sf9 細胞を感染後2〜3日回収し、遠心分離を介して、−80°Cで保存した。 細胞ペレットは、2,800 x gで30分間4°CでコフェクトされたSf9細胞を遠心した。タンパク質精製プロセスについて、以下で詳しく説明します。

<table><tbody><tr><td><強力>1 mL シリンジ</強力></td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td><強力>2</強力> M CaCl2 溶液</td><td>VWR</td><td>10128-558</td><td></td></tr><tr><td>2 M MgCl2 Solution</td><td>VWR</td><td>10128-298</td><td></td></tr><tr><td>27 ゲージ ニードル</td><td>ベクトン・ディキンソン</td><td>309623</td><td></td></tr><tr><td>5 M NaCl Solution</td><td>KD Medical</td><td>RGE-3270</td><td></td></tr><tr><td>酢酸</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>984303</td><td></td></tr><tr><td>Amyl Acetate</td><td>Ladd Research Industries</td><td>10825</td><td></td></tr><tr><td>Anti-FLAG M2 Affinity Gel</td><td>Millipore Sigma</td><td>A2220</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/a2220bul.pdf</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Millipore Sigma</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td><強>ビオチン化G-アクチン</td><td>Cytoskeleton, Inc.</td><td>AB07</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Millipore Sigma</td><td>5470</td><td></td></tr><tr><td>bPEG-silane</td><td>Laysan Bio, Inc</td><td>Biotin-PEG-SIL-3400-1g</td><td></td></tr><tr><td>Bradford Reagent Concentrate</td><td>Bio-Rad</td><td>5000006</td><td></td></tr><tr><td>Calmodulin</td><td></td><td>PMID: 2985564</td><td></td></tr>><<tr><td>SF-900 II SFM</</td><td>>ThermFisher Scientific</td><td>11496015</td><td>http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bevtest.pdf https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bactobac_man.pdf</td></tr>Circular Filter Paper - Gliding Assay</<tr><td></td>strong>の<td>Millipore Sigma</td><td>C40</td><td></td></tr>細胞株(Sf9)</<tr><td>strong></td><td>ミリポアシグマ</td><td>WHA1001125</td><td></td></tr><tr><td> Circular Filter Paper - Inverted Assay</td><td>Millipore Sigma</td><td>WHA1001090</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, EDTAフリープロテアーゼ阻害剤錠剤</td><td>Millipore Sigma</td><td>5056489001</td><td>これは4°Cで保存する必要があります。錠剤は直接使用することも、1錠を2mLの蒸留水に溶解して25倍ストック溶液として再構成することもできます。得られた溶液は4°Cで保存することができます。C:1〜2週間、または-20°Cで少なくとも12週間</td></tr>。<tr><td>Concentrating Tubes (100,000 MWCO)</td><td>EMD Millipore Corporation</td><td>UFC910024</td><td>MWCOが精製されるタンパク質の総分子量よりも小さい限り、チューブのMWCOは必ずしも「万能」ではありません。本明細書のNM2bは100,000 MWCOのチューブで濃縮され、M5aは30,000 MWCOのチューブで濃縮されました。</td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250 Dye</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>20278</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip Rack</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z688568-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips: Gliding Acting Filament Assay</</td><td>strong>VWR International</td><td>48366-227</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips: Inverted Motility Assay</td><td>Azer Scientific</td><td>ES0107052</td><td></td></tr><tr><td>透析チューブ(3500 Dalton MCWO)</td><td>Fischer Scientific</td><td>08-670-5A</td><td>透析チューブの直径は異なる場合がありますが、MWCOは同じである必要があります。本明細書で使用したNM2bは、18mm透析チューブで透析した。チューブは、4°Cで20%アルコール溶液に保存できます。</td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol</td><td>Millipore Sigma</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Double-Sided Tape</td><td>Office Depot</td><td>909955</td><td></td></tr><tr><td>DYKDDDDK Peptide</td><td>GenScript</td><td>RP10586</td><td>0.1 M NaCl、0.1 mM EGTA、3 mM NaN3、および 10 mM MOPS (pH 7.2) を含むバッファーに、最終濃度 50 mg/mL まで溶解できます。これは -20 > で保存できます。C as 300 &micro;Lアリコート。&nbsp;</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Millipore Sigma</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>溶出カラム</td><td>Bio-Rad</td><td>761-1550</td><td>これらは再利用できます。洗浄するには、カラム容量の 2 〜 3 カラムと蒸留水でカラムをすすぎます。カラムを4°Cで冷やします。使用前にC。</td></tr><tr><td>エタノール</td><td>Fischer Scientific</td><td>A4094</td><td></td></tr><tr><td>G-actin</td><td></td><td>PMID:4254541</td><td>G-アクチンストックは200 &muで保存できます。液体N2中のM。</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Millipore Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Glucose Oxidase</td><td>Millipore Sigma</td><td>G2133</td><td></td></tr><tr><td>Glycine緩衝液、100 mM、pH 2-2.5、1 L</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-295018</td><td></td></tr><tr><td>HaloTag</strong</td><td>>Promega</td><td>G100A</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>ミリポアシグマ</td><td>320331</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td><ストロング>ラージオリフィスピペットチップ</ストロング></td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>02-707-134</td><td></td></tr><tr><td><ストロング>ロイペプチンプロテアーゼ阻害剤</ストロング></td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>78435</td><td></td></tr><tr><td>Mark12 未染色標準はしご</強力></td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>LC5677</td><td></td></tr><tr><td><強力>メタノール</強力></td><td>ミリポアシグマ</td><td>MX0482</td><td></td></tr><tr><td><強力>メチルセルロース</強力></td><td>ミリポアシグマ</td><td>M0512</td><td></td></tr><tr><td><強力>顕微鏡スライド</強力</td><td>>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-553-10</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP308-100</td><td></td></tr><tr><td>mPEG-silane</td><td>Laysan Bio, Inc</td><td>MPEG-SIL-2000-1g</td><td></td></tr><tr><td>Myosin Light Chain Kinase</td><td></td><td>PMID: 23148220</td><td>FLAGタグ付きMLCKは、ここでFLAGタグ付きミオシンが精製されたのと同じ方法で精製できます。&nbsp;</td></tr><tr><td>NaN3</td><td>Millipore Sigma</td><td>S8032</td><td></td></tr><tr><td>NeutrAvidin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31050</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulose</td><td>Ladd Research Industries</td><td>10800</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 4 to 12% Bis-Tris Mini Protein Gel, 15-well</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>NP0323PK2</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered Saline, pH 7.4</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Millipore Sigma</td><td>78830</td><td>PMSFは、イソプロパノール中の0.1 Mストック溶液として作製し、4°Cで保存することができます。イソプロパノールを添加すると結晶沈殿が起こり、室温で攪拌することで溶解することができます。使用直前に、PMSFを急速攪拌溶液に滴下して最終濃度0.1 mMにすることができます。</td></tr><tr><td>Razor Blades</td><td>Office Depot</td><td>397492</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine-Phalloidin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R415</td><td>Stock は、100% メタノールで最終濃度 200 &mu;M に希釈できます。</td></tr><tr><td>Sf9 Media</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12658-027</td><td>これは4°Cで保存する必要があります。その貯蔵寿命は製造日から18ヶ月です。</td></tr><tr><td>組織培養ディッシュ - グライディングアッセイ</td><td>コーニング</td><td>353025</td><td>各組織培養ディッシュには、約9枚のカバースリップを収納することができます。</td></tr><tr><td>組織培養ディッシュ - インバーテッドアッセイ</td><td>コーニング</td><td>353003</td><td>各組織培養ディッシュには、約4枚のカバースリップを収納することができます。</td></tr><tr><td><ストロング>スムースサイド200&マイクロ;L ピペットチップ</強力></td><td>トーマス・サイエンティフィック</td><td>1158U38</td><td></td></tr><tr><td><強力>機器</強力></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><強力>遠心分離機</強力>サー</td><td>モフィッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>75006590</td><td></td></tr><tr><td><強力>顕微鏡</強力></td><td>ニコン</td><td>モデル: 100x TIRF 対物レンズ (N.A. 1.49)</td><td></td></tr><tr><td><強力>顕微鏡カメラ</強力</td> <td>></td><td>Andor モデル:iXon DU888 EMCCDカメラ(1024 x 1024センサーフォーマット)</td><td></td></tr><tr><td><強力>顕微鏡環境制御ボックス</強力></td><td>東海HIT</td><td>カスタムサーモボックス</td><td></td></tr><tr><td><強力>顕微鏡レーザーユニット</強力></td><td>ニコン</td><td>LU-n4 405nm、488nm、561nm、および640nm</td><td></td></tr><tr><td>用の固体レーザーを備えた4つのレーザーユニットMid Bench Centrifuge</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Model: CR3i</td><td></td></tr><tr><td>Misonix Sonicator</td><td>Misonix</td><td>XL2020</td><td></td></tr><tr><td>Optima Max-XP 卓上超遠心分離機</td><td>Beckman Coulter</td><td>393315</td><td></td></tr><tr><td>Plasma-Cleaner</td><td>Diener electronic GmbH + Co. KG</td><td>Systemタイプ:Zepto</td><td></td></tr><tr><td>Sonicatorプローブ(3.2 mm)</td><td>Qsonica</td><td>4418</td><td></td></tr><tr><td>Standard Incubator</td><td>Binder</td><td>モデル:56</td><td></td></tr><tr><td>Waverly Tube Mixer</td><td>Waverly</td><td>TR6E</td><td></td></tr><tr><td>SOFTWARE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ FIJI</td><td>https://imagej.net/Fiji/Downloads</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FAST (Version 1.01)http://spudlab.stanford.edu/fast-for-automatic-motility-measurements</td><td></td> <td>FASTは、Mac OSXおよびLinuxベースのシステムで使用できます。</td><td></td></tr><tr><td>Image Stabilizer Plugin</td><td>https://imagej.net/Image_Stabilizer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ TrackMate</td><td>https://imagej.net/TrackMate<</td><td></td><td></td></tr><tr><td>strong>Imaging Software</td><td>NIS Elements (ARパッケージ)</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>http://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>File:TrackMate-manual.pdf https://github.com/turalaksel/FASTrack</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>https://github.com/turalaksel/FASTrack/blob/master/README.md</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

インビトロ蛍光顕微鏡ベースの運動アッセイのミオシン特異的適応

Myosin-Specific Adaptations of In vitro Fluorescence Microscopy-Based Motility Assays

ミオシンタンパク質は、フィラメントアクチン(F-アクチン)と結合して相互作用し、系統樹全体の生物に見られる。その構造と酵素特性は、細胞内で実行される特定の機能に適合しています。ミオシン5aは、細胞内のメラノソームおよび小胞を輸送するためにF-アクチンをプロセス的に歩く。逆に、非筋筋筋筋2bは、約30分子を含む双極性フィラメントとして動作する。これは、フィラメントの中心に向かって反対極性のF-アクチンを移動し、そこでミオシン分子がアクチンを結合し、パワーストロークを与え、サイクルを繰り返す前に解震するために非同期的に働く。非筋筋筋筋2bは、その他の非筋筋筋2アイソフォームと共に、細胞接着、サイトカネシス、および張力維持を含む役割を有する。ミオシンのメカノケミストリーは、精製タンパク質を用いたインビトロ運動性アッセイを行うことで研究できる。滑空アクチンフィラメントアッセイでは、ミオシンは顕微鏡カバースリップ表面に結合し、蛍光標識されたF-アクチンを転写し、追跡することができます。しかし、単一分子/アンサンブル運動アッセイでは、F-アクチンはカバースリップに結合し、F-アクチン上の蛍光標識ミオシン分子の動きが観察される。本報告では、親和クロマトグラフィーを用いた Sf9 細胞からの組換えミオシン5aの精製について概説する。これに続いて、2つの蛍光顕微鏡ベースのアッセイ:滑空アクチンフィラメントアッセイと反転運動アッセイの概要を説明します。これらのアッセイから、画像解析ソフトウェアを用いてアクチン転位速度や単一分子の実行長さや速度などのパラメータを抽出することができます。これらの技術はまた、非筋筋ミオシン2イソフォームの単一フィラメントの動きを研究するために適用することができ、非筋筋筋2bの文脈で本明細書で議論される。このワークフローは、非筋肉ミオシンの単一分子およびアンサンブルダイナミクスを研究するために使用できるプロトコルと定量的ツールのセットを表します。

ミオシンの精製は、図2に示すようにドデシル硫酸ポリアクリルアミドナトリウム(SDS-PAGE)ゲル電気泳動を還元することによって評価することができる。この図は最終的な透析後ミオシンを表すが、SDS-PAGEは、上清に失われた製品を識別するために、精製手順の様々な段階からアリコートに対して行うことができる。ミオシン5aHMMは120-130 kDa範囲のバンドを有し、全長非筋筋筋2bは200−230kDa範囲でバンドを有し、重鎖29、44に対応する。ミオシン5aはまた、カルモジュリンをマーク、17 kDaマークの近くにバンドを持っています。非筋筋筋2bは、ELCを示す約17kDaでバンドを有する。この NM2b 準備では GFP タグ付き RLC が存在するため、RLC は約 47 kDa で表示されます。ただし、GFP でタグ付けされていない場合、ラベルなしの RLC は約 20 kDa に存在します。
<...

ここで提示されるミオシン5aを発現および精製する手順は、その特徴付け、アンサンブルおよび単分子の両方を用いて蛍光顕微鏡ベースのアッセイ、およびこれらの方法を非筋筋筋筋2bの特徴付けのためにどのように修飾することができるかである。

Myosin proteins bind and interact with filamentous actin (F-actin) and are found in organisms across the phylogenetic tree. Their structure and enzymatic ...

このプロトコルは、非筋肉筋筋のダイナミクスをタンパク質レベルで特徴付けるために使用することができ、細胞内での役割に寄与する運動特性を知らせることができる。これは、様々な調節条件がミオシン運動に及ぼす影響を研究し、細胞行動を知らせる高速で再現性の高い高度に制御された方法です。これらの技術は、非筋肉ミオシンの疾患を引き起こす突然変異が単一分子およびアンサンブルレベルでの行動にどのような影響を与えるかを調べるのに使用することができる。その方法論の一般的なアプローチは、微小管を用いた精製キネシンおよびダイニンの特性化など、他の様々な細胞骨格系に適用することができる。このプロトコルの汎用性は、どの蛍光器と化学条件が最も適切であるかについての疑問を提起することができますが、方法は比較的迅速に最適化することができます。フローチャンバーの設置方法とコーティング方法を理解することで、これらの実験のさまざまな条件に適応できる強力な基礎となります。まず、アセテートアミルにニトロセルロース溶液を1%用意し、組織培養プレートの底部に直径125ミリメートルの円形のろ紙を置きます。8つの正方形のカバースリップをラックに積み込み、約2〜5ミリリットルの200プルーフエタノールで十分に洗浄し、続いて蒸留水を2〜5ミリリットルで洗浄します。その後、フィルターエアラインまたは窒素ラインを使用してカバースリップを完全に駆動します。1つのカバースリップの1つの端に沿って1パーセントのニトロセルロース溶液のゆっくりとピペット10マイクロリットル。1つの滑らかな動きで200マイクロリットルのピペットの先端の側面を使用してカバースリップの残りの部分にそれを塗りつぶす。次に、ニトロセルロース側を上にして、このカバースリップを組織培養皿の上に置きます。残りのカバースリップに対してこれを繰り返し、乾燥させます。光学レンズ紙で顕微鏡スライドを拭き取り、大きな破片を取り除きます。両面テープを2枚、長さ約2センチメートル切り、顕微鏡スライドの長い端の中央に沿って1枚を置きます。テープの2番目の部分は、2枚が平行になるようにテープの最初の部分の下に約2ミリメートルを置き、約10マイクロリットルの溶液を保持できる流れチャンバを作成します。ニトロセルロースカバーのスリップの1つをテープに慎重に貼り付け、ニトロセルロースでコーティングされた側がテープに直接接触するようにします。ピペットチップを使用して、スライドテープインターフェースを軽く押し下げて、カバースリップがスライドに正しく付着していることを確認します。その後、かみそりの刃でスライドの端にぶら下がっている余分なテープをカットします。ミオシン5aの溶液を準備し、氷の上に保管してください。ミオシン5aの10マイクロリットルの流れはスライド流チャンバーを通り、1分間待つ。その後、DTTと運動バッファーでミリリットルBSAあたり1ミリグラムの10マイクロリットルで流れます。これを2回繰り返し、3回目の洗浄の後に1分待ちます。ティッシュペーパーまたはフィルターペーパーのコーナーを使用して、流れチャンバー出口に紙の角をそっと置くことによって、流路を通して溶液を芯に入れます。その後、DTTで運動バッファーの10マイクロリットルで洗浄します。1ミリリットルのシリンジと27ゲージの針を使用した黒いアクチン溶液をピペットし、その溶液をチャンバーに導入する前にアクチンフィラメントを剪断します。1ミリモルDTTで50ミリモルMBの1ミリモルATPの存在下でチャンバーに黒いアクチンを追加します。次に、DTTと1ミリモルATPを用いた運動バッファーの50マイクロリットルで流れ、フリーアクチンフィラメントのチャンバーを枯渇させた。10マイクロリットルの運動バッファーをDTTで3回洗浄し、任意のATPのチャンバーを枯渇します。DTTを有する運動性バッファーを含む20ナノモルRHアクチン溶液の10マイクロリットル内の流れ、カバースリップの表面に付着したミオシン5aへのアクチンフィラメントの厳格な結合を可能にする1分間待つ。DTTで10ミリモル運動バッファーの10マイクロリットルで洗浄し、非結合RHアクチンフィラメントを除去します。最終バッファーの30マイクロリットルで流れる。561ナノメートルの励起波長を用いて蛍光顕微鏡で画像を記録し、RHアクチンを可視化します。ミオシン5a反転運動アッセイの溶液を準備し、氷の上に保管してください。DTTで10マイクロリットルの運動バッファーでチャンバーを洗浄してください。DTTを有する運動バッファーで1ミリグラムBSAあたり1ミリグラムの10マイクロリットルで流れる。これを2回繰り返し、3回目の洗浄の1分後に待ちます。流れチャンバ出口に紙の角をそっと置くことによって、流路を通して溶液を芯にするティッシュまたはフィルターペーパーを使用してください。その後、DTTで10マイクロリットルの運動バッファーでチャンバーを3回洗浄します。ニュートラアビジン溶液の10マイクロリットルの流れをDTTで運動バッファーに入れ、1分間待ちます。その後、その溶液の10マイクロリットルで3回洗浄します。大退屈なピペットチップを用いたDTTによる運動性バッファーを含むBRHアクチンの10マイクロリットルの流れ。そして1分間待ちます。その後、10マイクロリットルの運動バッファーをDTTで3回洗浄します。10ナノモルミオシン5aを有する最終バッファーの30マイクロリットルの流れ。そして、すぐに全内部反射の蛍光顕微鏡に荷を積む。TIRFイメージングに最適なフォーカスが見つかったら、記録を開始します。非筋ミオシン2bの精製は、必須の軽鎖、及び調節性軽鎖、ならびにミオシン5a及びカルモジュリンをSDS-PAGEを行うことにより評価した。グライダーアクチンフィラメントアッセイは、ラベル付きアクチンフィラメントの滑らかな動きを特徴とする理想的で追跡可能な映画の特徴を示しています。黒いアクチン洗浄により、死んだミオシンヘッドが測定フィールドから取り除かれ、アクチンフィラメントの全体的な滑らかな動きにさらに寄与することが保証されました。フィラメント追跡出力画像は、非筋肉ミオシン2bおよびミオシン5aに対して高速トラックプログラムから得られた。代表的なヒストグラムは、アクトミオシン2b滑空速度が毎秒77ナノメートルであることを示しています。そして、アトミオシン5aのそれは515ナノメートル/秒です。メチルセルロースがない場合、アクチンフィラメントはミオシンコーティングされた表面によって密接に関連付けが残らず、非筋肉ミオシン2bコーティングカバースリップの表面に近いフロッピングを引き起こす。ミオシンの動きは、反転運動アッセイを用いて表面につながれた蛍光アクチンフィラメントで観察された。黒いアクチン洗浄用のフローセルに導入する前に、ラベルなしのアクチンを剪断することが重要であり、アクチンの転位をスムーズに行うことが可能です。その他の実験では、ミオシンの運動性がミオシン突然変異、負荷誘導タンパク質、イオン強度、および調節タンパク質によってどのように影響を受けるかを調べることができます。様々な細胞条件は、将来の研究のために再構成することができます.これらの方法は、様々なミオシンアイソフォームが単一分子およびアンサンブルレベルでのそれらの運動性および機械的特性においてどのように変化するかを生化学的および生物物理学的に調査することを可能にする。

myosin-specific-adaptations-vitro-fluorescence-microscopy-based

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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活性アクチンベースアセンブリの収縮性および変形モードのin vitroでのチューニング:2次元活性ネットワークから液晶滴まで

学ぶ蛍光顕微鏡を用いたミオシン5aの運動アッセイ法。非筋性ミオシンの動態をタンパク質レベルで解析し、細胞内機能と疾患関連変異の影響を解明する再現性の高い手法です。

インビトロ蛍光顕微鏡ベースの運動アッセイのミオシン特異的適応

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