時間分解型クライオ電子顕微鏡のための高速グリッド調製

こんにちは、このJoVE"ビデオへようこそ。リーズで開発中の時間を取り上げた研究である、迅速なグリッド作成のためにここに来たセットアップをご紹介します。これは標準システムではありませんが、私たちが行うすべてのこととパラメータの詳細な説明を提供することで、自分の研究室で同様のシステムを開発できることを願っています。

デバイスの詳細な説明はリッチモンドプロトコルで与えられています。ここでは、高速グリッドの準備と時間を解決した EM のステップ バイ ステップ ガイドを提供します。私たちの経験では、タンパク質濃度は1ミリリットルあたり2ミリグラム以上でなければなりません。プロトコルは約50マイクロリットルの最小体積を必要とする。

デバイスの電源を入れます。その後、コントロールPCの電源を入れ、コントロールソフトウェアを起動します。各シリンジポンプの初期化ボタンを押して、すべてのシリンジポンプを初期化します。

ポテンショメータ電源をオンにし、9ボルトに設定し、オシロスコープ制御ソフトウェアを起動します。加圧窒素ガスは、スプレーを発生させるために必要です。窒素ボンベを開き、圧力を2バールに設定します。

すべてのシリンジポンプバルブが負荷位置にあることを確認します。これを行うには、制御ソフトウェアで分配するすべてのバルブを切り替え、ロードに戻します。すべてのシリンジをゼロに設定します。

システムに存在する気泡は、この段階で除去する必要があります。これを行うには、シリンジを緩め、手動で泡を取り外し、もう泡を含まなかったときに再び取り付けられるスポイトを取り付ける必要があります。液体の処理システムは通常水で貯えることができる。

サンプルをロードする前に、システムはバッファと平衡化されます。これは、過剰なバッファーでチューブを洗浄することによって行われます。少なくとも200マイクロリットルのバッファーを含むチューブをシリンジ1個の上に置きます。

チューブの上部を取り付けるには、ピアスする必要があります。適切な量の緩衝液を吸引し、制御ソフトウェアを使用してシリンジ1で50〜100マイクロリットルを吸引する。バルブ1を切り替えて塗布します。

すべての液体を注射器1に分配します。弁1を負荷位置に戻し、シリンジ1の初期化ボタンを押して、次の洗浄サイクルに向けてシステムを準備する。これらのステップは、通常、チューブの徹底的な洗浄を確実にするために3回繰り返される。

次に、スプレーノズルを配置する。突っ込んだ腕にEMグリッドを配置します。スプレーノズルの前にグリッドを配置します。

制御ソフトウェアを使用してバッファーを分配します。ノズルとグリッドが揃っている場合、液体は、長期間噴霧後に蓄積する必要があります。必要に応じて、ノズルの位置を調整し、液体がグリッド上に蓄積する場所を再度確認します。

次に、エタンカップの位置を調整します。ピンセットの先端は、エタンカップの中心に近いはずです。すべての設定が正しいことを確認するために、テストの実行を実行します。

湿度室を閉じます。プランジャーのパスがはっきりしていることを確認します。1回のランに必要なバッファーの体積をシリンジ1に吸引する。

バルブ1を切り替えて塗布します。コントロールソフトウェアで実行を押して実行を開始します。シリンジポンプ1が動いていることを確認し、この場合は2秒で、グリッドは適切な遅延の後、ここで1.5秒で突っ込みます。

走行が終了したら、プランジャアームの圧力を希望の値に設定します。制御ソフトウェアでOKを押して、突っ込んだアームから圧力を解放します。今、エタンカップはクールで、液体エタンで満たされています。

使用前にグリッドをグロー放電します。典型的なグロー放電は、0.1ミリバル空気中の10ミリアンペアで90秒です。チューブは、その後、サンプルと平衡化されます。

使用可能なサンプルボリュームが少ない場合、チューブは1つのデッドボリュームのみで平衡化される可能性があります。吸気サンプル。通常、死んだ体積は約30マイクロリットルです。

バルブ1を切り替えて塗布します。チューブとノズルを通してサンプルを分配します。その後、1回の実行に必要なサンプルの量を吸引します。

バルブ1を切り替えて塗布します。相対湿度が希望の値に達していることを確認します。通常、グリッドは 60% 以上で用意します。

これには数分かかる場合があります。突っ込んだ腕にグロー放電グリッドを持つピンセットを置きます。ポテンショメータスライドを開始位置に配置し、速度測定の準備をします。

オシロスコープソフトウェアの速度測定のトリガを設定します。液体エタンカップを置き、湿度室の近くに置きます。プランジャーのパスがはっきりしていることを確認します。

コントロールソフトウェアで実行を開始します。実行が終了したら、制御ソフトウェアでOKを押して、突っ込んだアームから圧力を解放します。湿度室を開き、突っ込んだ腕とピンセットの間の接続を緩めます。

グリッドを液体エタンに保ちながら、突っ込んだ腕を上に動かします。その後、グリッドを液体窒素に移し、貯蔵します。オシロスコープの測定を保存します。

手動でポテンショメータスライダーとプランジャーの位置をリセットします。このプロトコルを繰り返して、レプリケート グリッドを準備します。時間分解実験も同様の方法で行われます。

混合工程で希釈するため、時間分解実験には高いストック濃度が必要です。時間分解実験では、3 つのシリンジをすべて使用します。チューブは、シリンジポンプとスプレーノズルに取り付けられています。

ここで使用されるマイクロ流体スプレーノズルには、混合素子も含まれています。長いチューブは、より大きなデッドボリュームを与え、洗浄平衡ステップは、より多くのバッファとサンプルを必要とされることに注意してください。バッファーとサンプルとすべてのシリンジを別々に平衡化します。

典型的には、サンプルA'および3にシリンジ1が使用され、サンプルB'チューブが平衡化された後、サンプルAをシリンジ1に、サンプルBを注射器2および3にロードする。次いで、バルブを1~3個切り替えて分配します。コントロールソフトウェアで実行を開始します。

時間を解決した実験では、別の実行スクリプトが必要であることに注意してください。異なる時間遅延は、2つの方法で達成することができます。プランジャー速度を調整することで、混合から凍結までの時間遅延を変更できます。

プランジ速度が速いほど、時間の遅延が短くなります。あるいは、スプレーエタンの距離は、スプレーノズルの垂直位置を調整することによって変化する。距離を大きくすると、時間の遅延が長くなります。

低倍率の電子顕微鏡では、典型的なグリッドはこのように見えます。薄い氷の領域は、示されているように、データ取得に適しています。高い倍率では、パーティクルがはっきりと見えるはずです。

アポフェリチンのような試験標本では、単一のグリッドからの比較的小さいデータセットは、3〜4つのオングストローム分解能での再構築に十分である。時間分解実験では、異なる時間ポイントやグリッドからデータセットを収集します。3D 分類のデータを結合し、パーティクルをその時点までトレースすると便利です。

このようにして、データは反応動態に関する構造情報および情報を提供することができる。結論として、私たちはあなたがビデオを楽しんだことを願っています。私たちは、ビデオと一緒にJoVE紙の詳細な説明で、突然変異からの問題の一部を軽減したり、空気と水の界面での相互作用を助けるために示されている迅速なグリッド作成を介して独自の実験を行うことができることを願っています。

だから、幸せなグリッド作り。