Name: 同種の抗体を用いた二重標識免疫蛍光による宿主と病原体の相互作用の研究 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: 学ぶ 同種抗体を用いた二重標識免疫蛍光法で、Trypanosoma cruzi感染LLC-MK2細胞における宿主と病原体の相互作用を解析する方法。抗体資源が限られる状況でも、クロス反応を防ぎながら複数タンパク質の局在を可視化できる。

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この作品は、フンダソン・デ・アンパロ・ア・ペスキサ・ド・エスタド・デ・サンパウロ(FAPESP 2010/19547-1;; 2018/03677-5)からMMABへ、フンダサン・デ・アポオ・アオ・エンシーノ、ペスキサ・エ・アシストエンシア-FAEPAからMMAB、そしてクオルデナソン・デ・アペルフェイソアメント・デ・ペソアル・デ・ニーベル・スーペリア・ブラジル(CAPES) - ファイナンス・コード0011。CG-CはCAPESから修士と博士の交わりを受け、LAMT-SはCNPqから博士課程のフェローシップを受けました。共焦点顕微鏡支援のイライザベテ・R・ミラニと、LLC-MK2細胞(USPリベイラオ・プレト医科大学)を提供してくれたダリオ・ザンボニ博士に感謝します。

1. 細胞培養と寄生虫培養
<ol><li>10% のヒートインを添加したRPMI培地中の25cm2細胞培養フラスコで、アメリカ型培養コレクション(CCL-7)からLLC-MK2(アカゲザル腎臓上皮)細胞を増殖させる 活性FBS(ウシ胎児血清)および抗生物質(100 U/mLペニシリンおよび100 μg/mLストレプトマイシン)を5%CO2 17で37°Cで活性化した。</li>
	<li>LLC-MK2細胞を以前のプロトコル18に従ってトリパノソーマ・クルジ(Y株)で感染させる。</li>
	<li>LLC-MK2感染細胞(5mL)の上清を15mLの細胞培養円錐遠心分離管と遠心分離機で500xgで10分間、22°Cで細胞デブリを下げる。37°Cでチューブを10分間保ち、トリポマスティゴテが上清まで泳がせます。</li>
	<li>22°Cで15分間、2500 x gで新しい円錐形管と遠心分離機に上清を集めます。 上清を捨て、完全なRPMI培地中に寄生虫を含むペレットを再懸濁し、ノイバウアーチャンバー内の細胞を計数して細胞密度を決定します。</li>
</ol>2. 免疫蛍光プロトコルの制御
メモ:一度固定すると、カバーリップを含むプレートを1x PBS(pH 7.2)で4°Cで1週間保存することができます。保存するには、細胞が透過性のステップを経ていないことが重要です。
<ol><li>LLC-MK2細胞(2 x 104)を、RPMI培地中のUV殺菌された丸めたカバーリップを含む24のウェルプレートに16時間沈着させる。</li>
	<li>感染した細胞の場合、 T.クルジ (項目1.4)を含む上清を各ウェルに比例して加え(MOI 10:1)、感染の6時間放置します。PBS溶液で感染細胞および非感染細胞を5回含むカバースリップを洗浄し、室温(RT)で10分間1x PBS(pH 7.2)で2%パラホルムアルデヒドで固定した。</li>
	<li>カバーリップを1x PBS(pH 7.2)でそれぞれ5分間3回洗います。</li>
	<li>1x PBS (PH 7.2) で 0.2% IGEPAL CA-630 で、RT で 10 分間、カバーリップを透過させます。</li>
	<li>カバーリップを1倍のPBSでそれぞれ5分間3回洗います。</li>
	<li>ブロッキング溶液(1x PBSでは2%BSA、pH 7.2)を用いてRTで30分間カバーリップをインキュベートする。</li>
	<li>インキュベートは、マウスモノクローナル抗hnRNPA1(希釈1:200)またはマウスポリクローナル抗TcFAZ(希釈1:100)抗体をブロッキング溶液で希釈した抗体を用いて、RTで30分間カバーリップを行う。</li>
	<li>カバーリップを1倍のPBSでそれぞれ5分間3回洗います。</li>
	<li>アレクサフルオール488(1:600)にコンジュゲートされたヤギ抗マウスIgG F(H+L)と共に、アレクサ594(1:300)に結合してアクチンフィラメント(F-actin)を染色して、ラットを希釈して30分間RTでカバーリップをインキュベートします。</li>
	<li>1x PBS(pH 7.2)をそれぞれ5分間3回洗浄します。</li>
	<li>スライドの表面にDAPI培地を用いたProLongゴールドアンチフェード付き試薬を少量塗布します。</li>
	<li>鉗子を使用して、気泡が形成されるのを防ぐために取り付け媒体のカバースリップを静かに傾ける。乾いたら、必要に応じてカバースリップを密封します。</li>
</ol>3. 同じ宿主で上げられたモノクローナルおよびポリクローナル抗体を用いた二重標識免疫蛍光プロトコル
<ol><li>上記の手順 2.1 ~ 2.6 を繰り返します。</li>
	<li>インキュベートは、インハウスマウスポリクローナル抗TcFAZ抗体(1:100)を用いた感染細胞および非感染細胞を含むカバースリップを、RTで30分間ブロッキング溶液に希釈した。</li>
	<li>カバーリップを1倍のPBSでそれぞれ5分間3回洗います。</li>
	<li>インキュベートは、ラットで30分間カバーリップをラットで覆い、ヤギの抗マウスIgG F(ab')2(H+L)をアレクサフルオール647(1:600)に結合し、ブロッキング溶液で希釈した。</li>
	<li>カバーリップを1倍のPBSでそれぞれ5分間3回洗います。</li>
	<li>2回目のブロッキングステップを、AffiniPureウサギの抗マウスIgG(H+L)希釈(0.12 mg/mL)で、RTで30分間ブロッキング溶液で行います。</li>
	<li>カバーリップを1x PBS(pH 7.2)で3回洗浄し、それぞれ5分間洗います。次にマウスモノクローナル抗hnRNP A1 IgG2b抗体(1:200)をRTで30分間インキュベートします。</li>
	<li>カバーリップを1倍のPBSでそれぞれ5分間3回洗います。</li>
	<li>アレクサFluor 488(1:600)に結合したヤギの抗マウスIgG2b抗体と、ブロッキング溶液で希釈されたアレクサ594(1:300)に結合したファロジンで30分間カバースリップをインキュベートします。</li>
	<li>カバーリップを1倍のPBSでそれぞれ5分間3回洗います。</li>
	<li>上記の手順 2.8 ~ 2.10 を繰り返します。</li>
</ol>4. 異なる宿主種からの第3ポリクローナル抗体を添加したトリプル標識免疫蛍光プロトコル
注:追加のラベリングについては、IgGサブクラス、抗体アイソタイプに注意し、抗体の順序に従ってください:1.マウスポリクローナル、2.ウサギポリクローナル、3. 第2ブロック、および4.コンフォーカル顕微鏡で利用可能なレーザーの種類を検討して、正しいフルオロフォア共役二次抗体を選択します。
<ol><li>上記の手順 2.1 ~ 2.6 を繰り返します。</li>
	<li>ステップ3.2〜3.5(洗浄工程)の後、RTで30分間ブロッキング溶液中のウサギポリクローナル抗体で新しいインキュベーションを開始します。</li>
	<li>カバーリップを1x PBS(pH 7.2)でそれぞれ5分間3回洗います。</li>
	<li>ラットの抗ウサギ抗体 IgG をアレクサ 647 (1:600) に結合して 30 分間ブロック溶液にインキュベートします。</li>
	<li>カバーリップを1倍のPBSでそれぞれ5分間3回洗います。</li>
	<li>AFFINIPureウサギ抗マウスIgG(H+L)希釈(0.12 mg/mL)でRTで30分間ブロッキング溶液でブロッキングステップを実行します。</li>
	<li>カバーリップを1x PBS(pH 7.2)でそれぞれ5分間3回洗浄し、ブロック溶液中で希釈した任意のマウスモノクローナルIgGサブクラス抗体で30分間インキュベートします。</li>
	<li>カバーリップを1倍のPBSでそれぞれ5分間3回洗います。</li>
	<li>カバーリップを、アレクサ594(1:600)に結合したヤギの抗マウスIgGサブクラス抗体を30分間インキュベートします。</li>
	<li>カバーリップを1倍のPBSでそれぞれ5分間3回洗います。</li>
</ol>5. 共焦点イメージング取得
<ol><li>63X油浸漬目的で、共焦点顕微鏡を用いて蛍光検査サンプルを分析し、光増倍管(PMT)とハイブリッド検出器(HyD)で蛍光を検出します。 注:私たちは、共焦点顕微鏡のマルチユーザー研究所からのセットアップを使用しました - LMMC、リベイランプレト医学部、サンパウロ大学。</li>
	<li>分離されたチャネルを持つすべての共焦点画像を取得します。アドビフォトショップを使用して画像処理を実行します。</li>
</ol>

<ol><li>Lloyd, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+proteins+hijacked+by+mammalian+cytoplasmic+plus+strand+RNA+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Nuclear proteins hijacked by mammalian cytoplasmic plus strand RNA viruses.</a> Virology. 479-480, 457-474 (2015).</li>
<li>Casadevall, A., Pirofski, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-pathogen+interactions%3A+basic+concepts+of+microbial+commensalism%2C+colonization%2C+infection%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Host-pathogen interactions: basic concepts of microbial commensalism, colonization, infection, and disease.</a> Infection and Immunity. 68 (12), 6511-6518 (2000).</li>
<li>Sidik, S. M., Salsman, J., Dellaire, G., Rohde, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shigella+infection+interferes+with+SUMOylation+and+increases+PML-NB+number%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Shigella infection interferes with SUMOylation and increases PML-NB number.</a> PLoS One. 10 (4), 0122585(2015).</li>
<li>Robert McMaster, W., Morrison, C. J., Kobor, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics%3A+A+New+Model+for+Intracellular+Parasite-Host+Cell+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Epigenetics: A New Model for Intracellular Parasite-Host Cell Regulation.</a> Trends in Parasitology. 32 (7), 515-521 (2016).</li>
<li>Casali, P., Schettino, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+natural+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Structure and function of natural antibodies.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 210, 167-179 (1996).</li>
<li>Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohisto-chemistry+and+multiple+labeling+with+antibodies+from+the+same+host+species+to+study+adult+hippocampal+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Immunohisto-chemistry and multiple labeling with antibodies from the same host species to study adult hippocampal neurogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), e52551(2015).</li>
<li>Tóth, Z. E., Mezey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+visualization+of+multi-ple+antigens+with+tyramide+signal+amplification+using+antibodies+from+the+same+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Simultaneous visualization of multi-ple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (6), 545(2007).</li>
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<li>Buchwalow, I. B., Minin, E. A., Boecker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multicolor+fluorescence+immunostaining+technique+for+simultaneous+antigen+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Histochemica%22%5BJournal%5D)">A multicolor fluorescence immunostaining technique for simultaneous antigen targeting.</a> Acta Histochemica. 107 (2), 143(2005).</li>
<li>Nakamura, A., Uchihara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+enhancement+of+triple+immunofluorescence+using+two+antibodies+from+the+same+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Dual enhancement of triple immunofluorescence using two antibodies from the same species.</a> Journal of Neuroscience Methods. 135 (1-2), 67(2004).</li>
<li>McCormick, J., Lim, I., Nichols, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropeptide+precursor+pro-cessing+detected+by+triple+immunolabeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Neuropeptide precursor pro-cessing detected by triple immunolabeling.</a> Cell and Tissue Research. 297 (2), 197(1999).</li>
<li>Shindler, K. S., Roth, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+immunofluorescent+staining+using+two+unconjugated+primary+antisera+raised+in+the+same+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Double immunofluorescent staining using two unconjugated primary antisera raised in the same species.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44 (11), 1331(1996).</li>
<li>Wang, B. L., Larsson, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+demonstration+of+multiple+anti-gens+by+indirect+immunofluorescence+or+immunogold+staining.+Novel+light+and+electron+microscopical+double+and+triple+staining+method+employing+primary+antibodies+from+the+same+species%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Simultaneous demonstration of multiple anti-gens by indirect immunofluorescence or immunogold staining. Novel light and electron microscopical double and triple staining method employing primary antibodies from the same species.</a> Histochemistry. 83 (1), 47(1985).</li>
<li>Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+indirect+immunofluorescence+procedure+for+staining+the+same+cryosection+with+two+mouse+monoclonal+primary+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 41 (8), 1273-1278 (1993).</li>
<li>Pranchevicius, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+Va+phosphorylated+on+Ser1650+is+found+in+nuclear+speckles+and+redistributes+to+nucleoli+upon+inhibition+of+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motility+and+the+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Myosin Va phosphorylated on Ser1650 is found in nuclear speckles and redistributes to nucleoli upon inhibition of transcription.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 65 (6), 441-456 (2008).</li>
<li>Moreira, B. P., de Castro, C. G., Prado, L. C. dS., da Fonseca, C. K., Baqui, M. M. A. Use of antibodies from the same host species in double labeling immunofluorescence on trypanosome cytoskeleton. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMoreira%2C+BP+%22Microscopy+and+Imaging+Science%3A+Practical+Approaches+to+Applied+Research+and+Education%22">Microscopy and Imaging Science: Practical Approaches to Applied Research and Education</a>. Méndez-Vilas, A. 7, 374-378 (2016).</li>
<li>Hull, R. N., Cherry, W. R., Tritch, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+characteristics+of+monkey+kidney+cell+strains+LLC-MK1%2C+LLC-MK2%2C+and+LLC-MK2+%28NCTC-3196%29+and+their+utility+in+virus+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Growth characteristics of monkey kidney cell strains LLC-MK1, LLC-MK2, and LLC-MK2 (NCTC-3196) and their utility in virus research.</a> Journal of Experimental Medicine. 115, 903-918 (1962).</li>
<li>Stecconi-Silva, R. B., Andreoli, W. K., Mortara, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parameters+affecting+cellular+invasion+and+escape+from+the+parasitophorous+vacuole+by+different+infective+forms+of+Trypanosoma+cruzi%5BTitle%5D)+AND+%22Mem%C3%B3rias+do+Instituto+Oswaldo+Cruz%22%5BJournal%5D)">Parameters affecting cellular invasion and escape from the parasitophorous vacuole by different infective forms of Trypanosoma cruzi.</a> Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 98 (7), 953-958 (2003).</li>
<li>de Souza, W., de Carvalho, T. M., Barrias, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+on+Trypanosoma+cruzi%3A+Host+Cell+Interaction%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Review on Trypanosoma cruzi: Host Cell Interaction.</a> International Journal of Cell Biology. 2010, 295394(2010).</li>
<li>Burleigh, B. A., Woolsey, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+signalling+and+Trypanosoma+cruzi+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Cell signalling and Trypanosoma cruzi invasion.</a> Cellular Microbiology. 4 (11), 701-711 (2002).</li>
<li>Baqui, M. M. A., Takata, C. S., Milder, R. V., Pudles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+giant+protein+associated+with+the+anterior+pole+of+a+trypanosomatid+cell+body+skeleton%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A giant protein associated with the anterior pole of a trypanosomatid cell body skeleton.</a> European Journal of Cell Biology. 70, 243-249 (1996).</li>
<li>Baqui, M. M., Milder, R., Mortara, R. A., Pudles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+and+in+vitro+phosphorylation+and+subcellular+localization+of+trypanosomatid+cytoskeletal+giant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motility+and+the+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">In vivo and in vitro phosphorylation and subcellular localization of trypanosomatid cytoskeletal giant proteins.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 47 (1), 25-37 (2000).</li>
<li>Baqui, M. M., De Moraes, N., Milder, R. V., Pudles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+giant+phosphoprotein+localized+at+the+spongiome+region+of+Crithidia+luciliae+thermophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Eukaryotic+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A giant phosphoprotein localized at the spongiome region of Crithidia luciliae thermophila.</a> Journal of Eukaryotic Microbiology. 47 (6), 532-537 (2000).</li>
<li>Jean-Philippe, J., Paz, S., Caputi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hnRNP+A1%3A+the+Swiss+army+knife+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">hnRNP A1: the Swiss army knife of gene expression.</a> International Journal of Molecular Sciences. 14 (9), 18999-19024 (2013).</li>
<li>Vidarsson, G., Dekkers, G., Rispens, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IgG+subclasses+and+allotypes%3A+from+structure+to+effector+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">IgG subclasses and allotypes: from structure to effector functions.</a> Frontiers in Immunology. 5, 520(2014).</li>
</ol>

著者らは、競合する利益や財政的利益を宣言しません。

ここでは、同じ宿主種の2つの異なる抗体を用いて 、トリパノソーマ・クルジ 感染細胞において二重免疫標識を行うプロトコルを提示する。研究するために、より詳細に、感染の影響を、核または細胞質小器官などの宿主細胞内の構造は、このプロトコルを用いて標識することができる。また、後埋め薄いセクション免疫金標識法にも使用できる。このアプローチは、トリパノソマチドおよび他の寄生虫を研究するために利用可能な抗体が少ないという障害を克服するのに役立ちます。
さらに、我々のプロトコルは、細胞内寄生虫が宿主細胞と一緒に標識され、同じ免疫蛍光における2つの真核生物が、異なる種類の組織で実現されたプロトコルとは異なる7、8、9、10、11...

病原体と宿主細胞との相互作用を細胞レベルで研究するために、ウイルス、細菌、原虫などの異なるグループがほとんどの宿主細胞タイプ1,2,3,4に感染する可能性があるため、疾患の根本的な原因に関する必須情報を提供する。また、病原体の成長を遅らせるか阻害する可能性のある治療標的を開発し、同定するのにも役立ちます。生きた条件では、産生された抗体は自己成分、ウイルスからの抗原、細菌成分または製品、真菌、寄生虫、および他の人を認識する責任がある5。
このため、抗体は、主に細胞構造およびタンパク質の位置および機能を理解するために広く使用されているツールである。複数の抗体標識を用いたいくつかの研究は、追加のブロッキングステップが免疫局在の特異性に寄与することを示している。さらに、ほとんどの記載されたプロトコルは、同じ宿主種からの抗体を含む特定の商業的モノクローナル抗体を使用する6,7,8,9,10,11,12,13,14。
通常、二重標識免疫蛍光は、異なる種で生起された2つの抗体を使用して、目的の細胞構造または病原体および宿主細胞間の相互作用を見るために染色する。しかし、これは、一部の病原体に特異的な市販のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体が二重標識を行う利用できない場合に問題となる可能性がある。また、市販の抗体コンジュゲーションキットがあり、かつ、一次抗体をスクシニミジルエステル反応15によって直接フルオロフォアに結合させることができる。問題は、これらのキットはしばしば高価であり、ラベルを付けるのに十分な抗体が必要であるということです。これを知りながら、トリパノソーマbrucei16でタンパク質の局在を研究するために、同じ種で育てられた2つの異なる抗体を用いた二重免疫蛍光法の開発に成功しました。しかし、トリパノソーマクルシを含む細胞内寄生虫については、このアプローチは実証されていない。ここでは、クロス反応を伴わずに同種で生起した一次抗体を用いて細胞内T.クルジ寄生虫および宿主細胞を研究するために二重標識免疫蛍光を行う方法を示す。この方法に加えて、異なる種からの第3抗体を添加して三重免疫蛍光標識が確立されている。これらのアプローチは、抗体の供給源が限られており、任意の細胞タイプで使用できる場合に役立ちます。

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 488 - IgG2b 抗体</td><td>Life technologies, USA</td><td>A21141</td><td>ヤギ抗マウス</td></tr><tr><td>AffiniPure Rabbit 抗マウス IgG (H+L)</td><td>Jackson Immunoresearch, USA</td><td>315-005-003</td><td>抗マウス抗体</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 - IgG F (ab')2 (H+L) 抗体</td><td>Life technologies, 米国</td><td>A11017</td><td>ヤギ抗マウス</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 IgG1 抗体</td><td>Life technologies, 米国</td><td>A21125</td><td>ヤギ抗マウス</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 - IgG F (ab')2 (H+L) 抗体</td><td>Life technologies, USA</td><td>A21237</td><td>ヤギ抗マウス</td></tr><tr><td>抗hnRNPA1抗体 IgG2b</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>R4528</td><td>マウス抗体</td></tr><tr><td>抗TcFAZ (T. cruzi FAZ protein) 抗体</td><td>Our lab</td><td>In-house</td><td>Mouse antibody</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>A2153-10G</td><td>アルブミンタンパク質</td></tr><tr><td>洗剤 Igepal CA-630</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>I3021</td><td>Nonionic Detergent</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Gibco, Thermo fisher scientific, USA</td><td>12657-029</td><td>Serum</td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>Gibco, Thermo fisher scientific, USA</td><td>15140-122</td><td>Antibiotic</td></tr><tr><td>Phalloidin Alexa Fluor 594</td><td>Life technologies, USA</td><td>A12381</td><td>アクチンマーカー</td></tr><tr><td>ProLong Gold 退色防止剤 with DAPI</td><td>Life technologies, 米国</td><td>P36935</td><td>封入剤</td></tr><tr><td>試薬 RPMI 1640 1X with L-glutamine</td><td>Corning, 米国</td><td>10-040-CV</td><td>細胞培養培地</td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA溶液</td><td>Sigma-Aldrich, 米国</td><td>T4049-100ML</td><td>Bioreagent</td></tr></tbody></table>

同種の抗体を用いた二重標識免疫蛍光による宿主と病原体の相互作用の研究

Double Labeling Immunofluorescence using Antibodies from the Same Species to Study Host-Pathogen Interactions

今日では、寄生虫と宿主の細胞相互作用を研究するために利用可能な幅広い分子ツールを見つけることが可能です。しかし、寄生虫の中で特定の細胞構造およびタンパク質を認識する商業的なモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を得るためにいくつかの制限がある。また、トリパノソマチドの標識に利用できる市販の抗体はほとんどありません。通常、寄生虫に対するポリクローナル抗体は、社内で調製され、同じ種で産生される他の抗体と組み合わせて使用することはより困難である可能性があります。ここで、プロトコルは、同じ種で育てられたポリクローナルおよびモノクローナル抗体を使用して、宿主細胞および病原体相互作用を研究するために二重標識免疫蛍光を行う方法を示す。二重標識免疫蛍光を達成するためには、まずマウスポリクローナル抗体をインキュベートし、次に二次マウスIgG抗体を任意の蛍光色に結合してインキュベーションに従うことは重要です。その後、次の二次抗体によって一次抗体の痕跡が認識されるのを防ぐために、追加のブロッキングステップが必要です。次に、マウスモノクローナル抗体とその特異的IgGサブクラス二次抗体を別のフルオロクロームに結合させ、適宜にサンプルに添加する。さらに、異なる種で上げられた第3の抗体を用いて三重標識免疫蛍光を行うことが可能である。また、核やアクチンなどの構造は、その後、それらの特定の化合物またはラベルで染色することができます。したがって、ここで提示されるこれらのアプローチは、一次抗体の供給源が限られている任意の細胞に対して調整することができる。

ここでは、トリパノソマチド中の特異的構造およびタンパク質を認識する市販の抗体の利用不能により抗体の供給源が制限される場合の免疫蛍光による宿主寄生虫相互作用を研究する方法を示す。
トリパノソマチドの中で、T.クルシは脊椎動物と無脊椎動物の宿主19の間の様々な発達段階を含む最も複雑なライフサイクルの1つを有する。T.クルジのライフサイクルの間、哺乳動物感染の初期段階で、メタサイクリックトリポマスチゴスは、寄生虫および脊椎動物宿主細胞19,20に存在する多種多様な分子を含むプロセスを通じて細胞に侵入する。これらのプロセスを研究するために、私たちの研究室では、T.クルーシ、T.ブルゼイ、リーシュマニアsp16、21<sup...

ここで、プロトコルは、宿主と病原体の相互作用を研究するために同じ種で生起される一次抗体を用いて二重標識免疫蛍光を行う方法を説明する。また、このプロトコルには、別の宿主からの第3の抗体を含むことができる。このアプローチは、任意の細胞型および病原体で行うことができる。

Nowadays, it is possible to find a wide range of molecular tools available to study parasite-host cell interactions. However, some limitations exist to ...

このプロトコルでは、同じ宿主からの2つの抗体を免疫蛍光アッセイで一緒に使用して宿主細胞および病原体の相互作用を研究することができる。寄生虫の特定の細胞構造やタンパク質を認識するために利用できる市販の抗体はごくわずかであるため、このプロトコルは非常に有用です。これは、同じ種で育てられたポリクローナルおよびモノクローナル抗体を使用する、簡単に実行できる二重標識免疫蛍光プロトコルです。多くの研究者は、これが可能であることを知らないかもしれません.このアプローチは、抗体の供給源が限られている場合に役立ちます。感染した宿主細胞の宿主細胞タンパク質の病原体を検出するために使用することができ、また、自由な生物に適用することができる。これは、単純なプロトコルであり、抗体の第1および第2のペア間の1つのブロッキングステップを必要とする。この手順は、私の研究室のカミラ・ガシェ=カストロ博士と博士課程の学生レイズ・トラヤノ・シルバによって実証されます。LLC-MK2細胞をトリパノソーマクルシに感染させた3日後、15ミリリットルの細胞培養円錐管で感染細胞から上清を集める。サンプルを遠心分離して細胞の破片を下げ、室温にチューブを置き、トリポマスティゴが上清まで泳ぐことを可能にする。10分後、上清を新しい円錐形チューブに集め、次いでサンプルを遠心分離し、完全なRPMI培地に寄生虫を含むペレットを再懸濁する前に上清を捨てる。LLC-MK2細胞をUV殺菌された丸みを帯びたカバーリップを含む24ウェルプレートに追加し、&mが16時間落ち着くことを可能にします。次に細胞に感染するには、T.Cruziを含む上清を各ウェルに加え、6時間インキュベートする。次に、感染した細胞と非感染細胞を含むカバーリップをPBSで5回洗浄し、次にPBSで2%パラホルムアルデヒドで細胞を固定します。10分後、PBSでカバーリップを5分間3回洗い、非イオン性洗剤で10分間パーメバリンを透過させます。3回の5分間のPBSを3回のPBSでのせり付け、ブロッキング溶液中のカバーリップを30分間インキュベートし、続いてマウスモノクローナルまたはポリクローナル抗体で30分間インキュベーションを行います。PBSを溶解した後、ブロッキング溶液中の二次抗体とファロイジンで2次抗体を使用してカバースリップを30分間インキュベートし、宿主細胞内のアクチンフィラメントを染色します。次に、スライドの表面にDAPI培地を用いた少量のアンチフェード実装試薬を塗布する前に、PBSでカバーリップを再び3回洗います。鉗子を使用して、気泡の形成を防ぐために、媒体のカバースリップを静かに傾けます。二重標識の場合、前述のようにブロッキング溶液中でカバースリップをインキュベートした後、それらをマウスポリクローナル抗体に30分間インキュベートする。次に、PBSでそれぞれ5分間3回カバーリップを洗浄してから、二次抗体で30分間インキュベートします。次いで3回のPBSを溶解し、ブロッキング溶液で希釈したAffiniPureウサギ抗マウスIgGで第2のブロッキングステップを行う。30分後、PBSでカバーリップを再び洗浄してから、マウスモノクローナル抗体でさらに30分間インキュベートします。次に、3回のPBSをスイーズした後、ヤギの抗マウスIgG2B抗体およびファロイジンでカバースリップをインキュベートする。次いで、3回のPBSを用いて、前述のようにアンチフェード実装試薬を塗布する。トリプルラベリングの場合、マウスポリクローナル抗体でカバーリップを遮断し、インキュベートした後、ヤギの抗マウス抗体を続け、30分間ブロッキング溶液中でウサギポリクローナル抗体で新しいインキュベーションを開始する。その後、3回のPBSを使用した後、ヤギの抗ウサギ抗体でカバースリップを30分間インキュベートします。次に、3回のPBSを溶解した後、30分間ブロッキング溶液中で希釈したAffiniPureウサギ抗マウス抗体を用いてブロッキングステップを行う。次に、マウスモノクローナルIgGサブクラス抗体を30分間インキュベートする前に、カバーリップを再び洗浄します。3回のPBSを使用した後、特定のヤギ抗マウスIgGサブクラス抗体で30分間カバーリップをインキュベートします。インキュベーション後、カバーリップをPBSでそれぞれ5分間3回洗います。63X油浸出目的で共焦点顕微鏡を使用して免疫蛍光サンプルを分析し、光増倍管とハイブリッド検出器で蛍光を検出します。次に、分離されたチャンネルを持つすべての共焦点画像を取得し、Adobe Photoshopを使用して画像処理を実行します。これらの共焦点顕微鏡画像は、宿主細胞および内在性寄生虫における抗体の特異性を強調する感染細胞および非感染細胞の対照実験を用いた結果を示す。マウスポリクローナル抗体抗体抗トリパノソーマクルシFAZは、寄生虫の旗ラムの付着帯でT.cruzi巨大タンパク質を認識したが、宿主細胞には認識しなかった。核内の異種核リボヌクレオプロテインA1の分布は、宿主哺乳類細胞のみを認識する市販のマウスモノクローナル抗体を用いて観察されたが、寄生虫は認めていない。また、宿主および寄生虫核及び寄生虫キネトプラストをDAPIで染色し、宿主F-アクチンをアレクサ594に結合させたファロイジンで染色し、抗体の特異性を確認した。二重標識免疫蛍光は、共焦点顕微鏡で分析された宿主および寄生虫におけるタンパク質分布を示す。標識は、この方法論を用いた抗体間の交差反応を示唆しなかった。要約すると、宿主と病原体の相互作用を研究するためにここで説明するプロトコルは、抗体の任意の組み合わせに適応することができる基本的かつ精巧な技術を提示する。このアプローチは、免疫蛍光を費用対効果の高い、少数の抗体が利用可能な場合に関心のある2つ以上のタンパク質の局在化を研究するのに役立ちます。

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学ぶ 同種抗体を用いた二重標識免疫蛍光法で、Trypanosoma cruzi感染LLC-MK2細胞における宿主と病原体の相互作用を解析する方法。抗体資源が限られる状況でも、クロス反応を防ぎながら複数タンパク質の局在を可視化できる。

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