Name: リアルタイムの生体内多光子顕微鏡で、血液脳関門透過性を高める、集中超音波治療とマイクロバブル治療を可視化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: 学ぶ 多光子顕微鏡を用いたマウス脳のリアルタイムイメージング法。集中超音波とマイクロバブル治療による血液脳関門透過性の変化を可視化し、薬物送達の効果を評価する手法です。

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動物の住宅は、比較医療コア施設(CoMed、NTNU)によって提供されました。図3は BioRender.com で作成されました。ビデオの録画と編集は、NTNU自然科学学部のウェブマスターであるPer Henningによって行われました。このプロジェクトは、ノルウェー科学技術大学(NTNU、ノルウェーのトロンハイム)、ノルウェー研究評議会(RCN 262228)、カナダ衛生研究所(FDN 154272)、国立衛生研究所(R01 EB003268)、サニーブルック健康科学センターの焦点を当てた超音波研究のテメルティチェアによって資金提供されました。

カリッサ・プーン、メリーナ・ミューレンプフォード、マリーケ・オルスマン、キャサリーナ・デ・ランゲ・デイヴィスは、金融的または非金融的競合する利益相反を宣言しません。スピロス・コトプーリスは正社員で、超音波とマイクロバブル/クラスター強化薬物送達を開発しているEXACTセラピューティクスASの株式を所有しています。クラルボ・ハイニネンはFUSインスツルメンツの創設者であり、そこから非研究関連のサポートを受けています。

脳の生体内多光子顕微鏡モニタリングは、超音波暴露時の脳応答を研究するための貴重なツールです。我々の知る限りでは、ここで説明するプロトコルは、超音波マイクロバブル治療中に脳のパレンチマの多光子顕微鏡イメージングを行う唯一の方法である。頭蓋窓の作成とリングトランスデューサの使用は、高い空間的および時間的分解能での超音波マイクロバブル治療に対する血管、細胞、およびその他の下流応答をリアルタイムで監視することを可能にする。他のグループは、超音波マイクロバブル治療の完了後に多光子顕微鏡イメージングを行い、それによって治療に対する脳実質のリアルタイム応答を欠く19。説明された手順は、超音波マイクロバブル治療の背後にある急性メカニズムを照らすのに役立つ可能性のあるデータの収集を可能にする、改善された時間制御を提供する。定量的および定性的なデータは、蒸発性キネティックス27,29,30、βアミロイドプラーク容積31、および細胞ダイナミクス32の変化のような、取得した画像スタックから抽出および分析することができる。
プロトコル全体で、いくつかのトラブルシューティング手順が強調表示されました。まず、特にオペレータエラーの影響を受けやすい外科的ステップが強調された。例えば、頭蓋窓の外科手術中のアガロースの使用およびトランスデューサーの配置。手術中の動物生理学のモニタリングや、注射前のデキストランの徹底的なボルテックスなど、動物の不快感や死を防ぐための措置も提供されました。第2に、トランスデューサの物理的な仕様、および対物レンズ、トランスデューサ、および頭蓋窓の位置合わせも強調された。リングトランスデューサの仕様とその音響特性は、動物モデルと同様に使用される対物レンズを考慮して決定する必要があります。具体的には、リングトランスデューサの内径は対物レンズを囲むのに十分な大きさでなければならないが、動物の頭蓋骨にしっかりと取り付けられるほど小さい。さらに、トランスデューサの焦点領域は、使用する対物レンズの範囲と一致する必要があります。
一般的な課題は、頭蓋窓とリングトランスデューサが対物レンズに対して角度が付いているということです。頭蓋窓とトランスデューサを備えた対物レンズの適切なセンタリング(XY)およびアライメント(Z)は、トランスデューサの焦点領域、したがって治療された脳組織の領域がイメージングの視野と一致し、対物レンズとトランスデューサの間の衝突のリスクを低減することを保証する。アライメントは、動物の頭部位置を調整したり、固定されている立体フレームを回転させることによって達成できます。
顕微鏡部品(例えば、検出器、ビームスプリッター)および画像取得パラメータは、研究の目的に基づいて選択されるべきである。ここでは、長い焦点距離(>2mm)の対物レンズは、対物レンズと脳の間に位置するカバースリップとリングトランスデューサの存在により使用されます。アップライト顕微鏡は、特に脳実験のために、動物を操縦するためのより多くのスペースを可能にするので、また推薦される。超音波マイクロバブルの運動学を捕捉するために、血管内色素の漏出を誘発し、高い時間分解能が良好であり、これは共鳴走査システムを用いて達成することができる。これを、ガリウムヒ素リン化(GaAsP)検出器などの高感度検出システムと組み合わせることで、より良好な画像が得られます。
提示された実験手順には、いくつかの制限があります。まず、外科的処置は非常に侵襲的であり、炎症を最小限に抑えることができるが45の炎症を引き起こすことが報告されている。さらに、脳の窓の手術によって誘発される免疫応答は、手術後2〜4週間で解決することが観察された23,24,25.また、特に過度の力や速度で行う場合、掘削プロセスは、熱、振動、および加圧の発生による下層組織への損傷を引き起こす可能性があります。頭蓋窓の手術および多光子イメージングもまた、脳温度47に影響を与える観察されている。これらの制限は、手付かずの頭蓋窓の慎重な作成、慢性頭蓋窓を有する動物の適切な回復、およびフィードバック制御を備えた加熱源を使用した規範的な体温の維持を通じてある程度減少することができる。第2に、撮像深さは、使用する顕微鏡および対物レンズによって制限される。例えば、海馬などのより深い脳構造における超音波マイクロバブル治療の効果は、上皮質組織48の除去や皮質浸透と組み合わせたマイクロレンズの使用などのより侵襲的な手段なしには研究できない。長時間の作業距離を持つ対物レンズを使用すると、この問題をある程度解決できますが、光の貫通は深度が高い場合にも制限されます。
このプロトコルの代表的な画像は野生型げっ歯類から取得されたが、提示された実験手順は、アルツハイマー病31などのトランスジェニック動物および疾患モデルにも適用することができる。超音波誘発神経変調などのBBB変調と無関係の超音波実験も、このプロトコル33,34を用いて監視することができる。他の可能な用途は、超高速カメラ50と共焦点顕微鏡を組み合わせるなど、異なる顕微鏡または検出器のセットアップを使用することによって達成することができる。光漂白と光毒性は、励起量が大きいため、共焦点顕微鏡では比較的悪いですが、超高速イメージングは、脳の毛細血管内皮細胞-マイクロバブル相互作用を高時間分解能で視覚化することを可能にし、超音波マイクロバブルBBB治療を促進するメカニズムをさらに照らすことができます。結論として、説明されたプロトコルは、超音波マイクロバブルBBB実験によって誘導される血管および細胞効果をリアルタイムで監視する方法を提供し、これらの治療を駆動するメカニズムをさらに決定するツールを提供するとともに、超音波マイクロバブル治療に対する脳実質の下流応答を照らす。

神経疾患を治療するための重要な課題は、血液脳関門(BBB)の存在です。BBBは、親水性、荷電、極性、および大きな(>400 Da)分子が脳のパレンチマ1に入るのを制限する。脳のパレンチマにBBB全体の治療を提供するために現在使用される1つの方法は、頭蓋内注射の立体的な使用である2.調査中の他の侵襲性の低い方法は、BBB3を介して受容体媒介性送達のための薬物を設計する、または鼻腔内注射4 または過浸透性溶液の投与などの標的領域の空間精度において制限されるなどの使用される技術の複雑さによって妨げられる。
超音波を全身に注入されたマイクロバブルと組み合わせて使用することは、超音波造影剤であり、BBB6の透過性を一過性に増加させる非侵襲的手段として開発されている。焦点を合わせたトランスデューサ7またはトランスデューサ8,9のステアブルなフェーズドアレイを使用することにより、超音波は、オフターゲット効果を最小限に抑え、ミリメートルレベルの精度で脳内の選択された領域を標的にすることができます。超音波マイクロバブル治療は、磁気共鳴画像法ガイダンス7、10、11、12、13、14または立体的フレーム15を使用して、各被験者の脳解剖学にカスタマイズすることができる。さらに、マイクロバブル16,17,18からの音響放射をモニタリングすることで、BBB透過性の増加の程度をリアルタイムで制御することができます。超音波マイクロバブル治療の安全性と実現可能性を調査する臨床試験は、現在世界中で進行中です(例えば、ClinicalTrials.gov 識別子NCT0418764)。
超音波マイクロバブルBBB治療は、典型的には、BBB透過性の増加を誘発する治療を確認することによって評価され、コントラスト強化された磁気共鳴画像法で視覚化されるか、またはインビボイメージングまたはエクスビボ構造における色素外除術によって可視化される。しかし、ほとんどの顕微鏡分析は、超音波マイクロバブル治療の完了後にex vivoを行い、それにより超音波暴露中および直後に動的生物学的応答を欠く。超音波暴露中に行われるリアルタイムイメージングは、超音波マイクロバブルBBB治療を促進するメカニズムと下流応答を理解するのに役立ち、治療用途に対する理解を深める可能性があります。さらに、生体内イメージング技術を用いた慢性頭蓋窓の使用は、超音波マイクロバブル治療の時間的側面を評価するための縦方向の研究を可能にするであろう。
このプロトコルの目的は、げっ歯類の急性および慢性研究のための超音波マイクロバブル治療のリアルタイムマルチフォトン画像化を行うために必要な外科的および技術的処置を記述することです(図1)。これは2つの部分で達成される:最初に、生体内のイメージ投射を可能にする頭蓋窓を作成し、第2に、同時超音波処理および画像化を可能にするために、上にリングトランスデューサーを取り付ける。頭蓋窓は、神経血管結合20、β-アミロイド病原性21、および神経免疫学22のインビボイメージングのために神経科学者によって広く使用されてきた。このプロトコルでは、マウスおよびラットの頭蓋骨に急性(非回復)および慢性(回復)頭蓋窓を作成するための外科的処置が記載されている。頭蓋窓の方法論、特に慢性実験については、23,24,25が十分に文書化されている。既存の文献と一致するために、用語「急性」と「慢性」は、このプロトコル全体で使用されます。インビボイメージング用のリングトランスデューサの設計も以前に説明されている26。これらの技術の利用可能性と超音波マイクロバブル治療のリアルタイムイメージングから得ることができる洞察にもかかわらず、この技術を使用して文献を正常に公開した研究ラボは非常に少ない26,27,28,29,30,31,32 .このように、このプロトコルでは、これらのリアルタイム超音波マイクロバブル実験を行う外科的および技術的詳細が記載されている。BBB実験に対して指定された超音波処理および画像化パラメータが最適化されている一方、脳への超音波暴露の他の効果、例えば、神経変調33,34、βアミロイドプラークモニタリング31、および免疫細胞応答32は、この技術を用いても調べることができる。

<table><tbody><tr><td><強>リングトランスデューサーの配置</強></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>アガロース(粉末)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>ビーカーまたは三角フラスコ(50 ml)</td><td>VWR</td><td>213-0462または214-1130</td><td></td></tr>シア<tr><td>ノアクリレート接着剤(ゲル)</td><td>ロックタイト</td><td>1363589</td><td></td></tr><tr><td>ガラスカバースリップ(13 mm)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>CB00130RA120MNT0</td><td>リングトランスデューサー用のカバースリップ。</td></tr><tr><td>ホットプレートまたは電子レンジ</td><td>コーニング</td><td>PC-400D</td><td>アガロース溶液を加熱します。</td></tr><tr><td>PBS (1X)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>リングトランスデューサ</td>ー <td>カスタムメイド カスタム</td><td></td><td>メイド 例:https://doi.org/10.1109/ULTSYM.2014.0518</td></tr><tr><td>ゴム栓</td><td>VWR</td><td>217-0867</td><td></td></tr><tr><td>Animal preparation and Drugs</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bupivacaine*A</td><td>Aspen</td><td>169912</td><td>用量: 1 mg/kg、s.c.、切開部位に局所麻酔薬を注射。</td></tr><tr><td>ブプレノルフィン*A</td><td>Indivior</td><td>521634</td><td>用量マウス:0.05-0.1 mg / kg、皮下、オピオイド、手術前に投与します。</td></tr><tr><td>ブプレノルフィン*A</td><td>Indivior</td><td>521634</td><td>用量ラット:0.01-0.05 mg/kg、s.c.</td></tr><tr><td>カルプロフェン*C</sup</td><td>>ファイ</td><td>ザーDIN 02255693</td><td>用量:5 mg/kg、s.c.、NSAID、術後投与。</td></tr><tr><td>脱毛クリーム</td><td>Veet</td><td>N / A</td><td>トリミング後の完全な毛皮除去用。</td></tr><tr><td>デキサメタゾン*C</sup</td><td>>サンド</td><td>DIN 00664227、2301</td><td>用量:3 mg/kg、すなわち、コルチコステロイドは、脳浮腫を軽減し、手術前に投与します。</td></tr><tr><td>エンロフロキサシン*C</td><td>Bayer</td><td>DIN:02249243</td><td>用量:5mg / kg、i.p.、抗生物質、術後に投与します。</td></tr><tr><td>毛皮クリッパーAesculap</td><td></td><td>90200714</td><td>Exacta / Isis。</td></tr><tr><td>加熱パッド</td><td>Physitemp Instruments INC</td><td>HP-1M</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>バクスター</td><td>ESDG9623C</td><td>用量: 3% 誘導、1% メンテナンス; 麻酔薬。</td></tr><tr><td>Meloxicam*A</td><td>Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH</td><td>25388</td><td>用量マウス:2-3 mg/kg、s.c.、NSAID、手術前に投与します。</td></tr><tr><td>Meloxicam*A</td><td>Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH</td><td>25388</td><td>用量ラット: 1 mg/kg, s.c.</td></tr><tr><td>パルスオキシメータ</td><td>STARR Life Sciences Corp</td><td>N/A</td><td>MouseOx.</td></tr><tr><td>定位固定装置フレーム</td><td>Kopf</td><td>Kopf 900</td><td></td></tr><tr><td>滅菌眼科用軟膏</td><td>Th&eacute;ビス</td><td>コティアーズ</td><td>597562</td>。</tr><tr><td>尾静脈カテーテル (24 G)</td><td>BD Neoflon</td><td>391350</td><td></td></tr><tr><td>* 使用前に獣医師と投与量と投与の種類について話し合ってください。 A 急性の窓手術の場合、C 慢性の窓手術の場合。マウスとラットの用量は、特に指定がない限り同じです。</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>頭蓋窓配置のための材料と機器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>アルコール綿棒</td><td>BD</td><td>326895</td><td></td></tr><tr><td>湾曲した細かい手術用ハサミ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14002-12</td><td></td></tr>綿<tr><td>または繊維のない綿棒</td>ケ<td>ムトロニクス</td><td>CX50</td><td></td></tr><tr><td>シアノアクリレート接着剤(ゲル)</td><td>ロックタイト</td><td>1594457(ゲル)、230992(液体)</td><td>利用できない場合は、液体シアノアクリレート接着剤を極細のアクリレート粉末と混合できます。</td></tr><tr><td>歯科用セメント</td><td>ラング デンタル</td><td>ジェットセット-4 義歯修理パッケージ</td><td></td></tr><tr><td>デンタルマイクロモーターハンドドリル</td><td>FOREDOM</td><td>K.1070-2</td><td>2.35mmコレット付き高速ロータリーマイクロモーターキット。</td></tr><tr><td>鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11152-10、11370-40</td><td></td></tr><tr><td>ガラスカバースリップ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>CB00050RA120MNT0 (5 mm)</td><td>マウスの頭蓋窓。</td></tr><tr><td>ガラスカバースリップ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>CB00080RA120MNT0 (8 mm)</td><td>ラットの頭蓋窓。</td></tr><tr><td>マイクロドリルバリ (0.5 mm)</td><td>Meisinger</td><td>HM71005 (0.5 mm)</td><td></td></tr><tr><td>マイクロドリルバリ (0.7 mm)</td><td>Meisinger</td><td>HM71007 (0.7 mm)</td><td></td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>Nikon</td><td>SMZ645</td><td></td></tr><tr><td>外科用ゼラチンスポンジ</td><td>Ethicon</td><td>MS0005</td><td></td></tr><tr><td>Vetbond ティッシュ接着剤</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>計量ボート/トレイ</td><td>VWR</td><td>10803-148</td><td></td></tr> <tr><td>*オートクレーブは、慢性的な頭蓋窓手術のために、オートクレーブ、ツール、材料、およびガウンをドレープし、滅菌手術用手袋を使用します。</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>多光子顕微鏡</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20倍水浸対物レンズ</td><td>Olympus</td><td>XLUMPLFLN20 XW</td><td>開口数1.0、作動距離2.0mm。</td></tr><tr><td>蛍光デキストラン(例:FITC 70 kDa)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>46945</td><td>推奨10 kDa-2 MDa.</td></tr><tr><td>MaiTai DeepSee Ti:Sapphire レーザー発振器</td><td>Spectra-Physics</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>SliceScope 顕微鏡</td><td>Scientifica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasound treatment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 dB RF Amplifier</td><td>E&I</td><td>2100L</td><td></td></tr><tr><td>マッチング回路</td><td>カスタムメイド カスタム</td><td>メイド</td><td>カスタムメイド。</td></tr><tr><td>Microbubbles</td><td>Bracco Imaging</td><td>N/A</td><td>SonoVue (Bracco Imaging, ヨーロッパ).用量1 ml / kg。</td></tr><tr><td>Microbubbles</td><td>Lantheus N</td><td>/A</td><td>Definity (Lantheus Medical Imaging, North America).用量0.02-0.04 ml / kg。</td></tr><tr><td>信号発生器</td><td>Agilent Technologies</td><td>33500B</td><td></td></tr></tbody></table>

リアルタイムの生体内多光子顕微鏡で、血液脳関門透過性を高める、集中超音波治療とマイクロバブル治療を可視化

Real-Time Intravital Multiphoton Microscopy to Visualize Focused Ultrasound and Microbubble Treatments to Increase Blood-Brain Barrier Permeability

血液脳関門(BBB)は、脳への薬物の正常な送達のための重要な課題です。マイクロバブルの存在下での超音波暴露は、BBBの透過性を一時的かつ局所的に増加させる有効な方法として出現しており、BBBを介した薬物のパラおよびトランス細胞輸送を促進する。超音波マイクロバブル治療中に血管系をイメージングすることは、脳内の超音波マイクロバブル治療のメカニズムとダイナミクスに関する貴重で新しい洞察を提供します。
ここでは、環トランスデューサと20倍の対物レンズを合わせた頭蓋窓を用いた生体内多光子顕微鏡の実験手順を提示する。このセットアップは超音波マイクロバブルの処置の間に脳の高い空間的および時間的決断のイメージ投射を可能にする。脳への光学的アクセスは、開いた頭蓋骨窓を介して得られる。簡単に言えば、頭蓋骨の直径3〜4mmの部分を取り除き、脳の露出した領域はガラスカバースリップで密封される。2番目のガラスカバースリップに取り付けられた0.82 MHzリングトランスデューサーが上部に取り付けられています。アガロース(1%w/v)は、超音波の伝播を妨げる気泡を防ぐために、トランスデューサーのカバースリップと頭蓋窓を覆うカバースリップの間に使用されます。無菌手術と抗炎症対策がとられると、超音波マイクロバブル治療およびイメージングセッションを数週間にわたって繰り返し行うことができます。蛍光デキストランコンジュゲートは、静脈構造を可視化し、超音波マイクロバブル誘導効果(例えば、漏れ動態、血管変化)を定量するために静脈内に注入される。この論文では、頭蓋窓の配置、リングトランスデューサの配置、イメージング手順、一般的なトラブルシューティング手順、および方法の利点と制限について説明します。

成功した超音波マイクロバブル治療は、血管内から血管外空間への蛍光デキストランの外開法によって検出され得る(図8)、BBB透過性の増加を示す。リングトランスデューサの圧力フィールドに応じて、パイル血管および/または毛細血管が影響を受けます。
超音波マイクロバブル治療によって誘導される血管変化を評価するために、対象となる血管の直径を、超音波マイクロバブル処理の前、中、および後に測定することができる(図9)。これは、市販のソフトウェア(例えば、オリンパスフルビューソフトウェア)で手動で行うことができます。画像取得中に、ボーラスデキストラン注射およびラインスキャンも血流を評価するために使用することができます30,41。薬物送達の代表的なモデルとしてデキストラン漏れの運動を評価するために、MATLAB26,27,29,41などのツールを用いて血管内空間と血管外空間間の信号強度を評価することができる(図10)。
画像処理は、ImageJ/FIJI を使用して実現できます。ImageJ/FIJIはMATLABと互換性があり、血管の変化や蛍光性物体間の長さや距離(例えば、血管へのβアミロイドプラーク)などの生物学的画像解析で一般的な分析を行うのに適したオープンソースソフトウェアです。ImageJ/FIJI で作成された画像処理パイプラインは、カスタムマクロを記述することで自動化できます。
血管の3Dセグメンテーションや細胞追跡などのより複雑な解析は、より高度な半自動ソフトウェアを使用して達成できます(図11)。セグメンテーションの後、血管を細動脈、小枝、毛細血管として、直径、分岐、トートのパターン、および流れ方向に基づいて分類するなど、より具体的な分析を行うことができます 42,43。機械学習アルゴリズムは、血管のセグメンテーションを自動化するために開発されました22,44。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62235/62235fig1v4.jpg"> 図1:生体内多光子超音波マイクロバブル脳実験の一般的なワークフロー。 このプロトコルに記載された生体内多光子超音波マイクロバブル脳実験の一般的なワークフローが示されている。(A)(A1)マウスおよび(A2)ラットの動物調製、(B)デキストラン注射、(C)マイクロバブル注射、(D)前処理イメージング、(E)治療およびイメージング、(F)後処理イメージングおよびデータ分析。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62235/62235fig1v4large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62235/632235fig02.jpg"> 図2:3Dプリント金型の断面と上図(A)金型の断面。シアノアクリル酸接着剤の薄い層がリングトランスデューサの上面に塗布され、カバースリップが上に置かれます。スタンプは、カバースリップやリングトランスデューサーに圧力をかけてもしっかりと適用するために使用できます。(B) 金型のトップビュー。ノッチは、準備されたトランスデューサの除去を容易にするために、金型に追加することができます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62235/632235fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62235/632235fig03.jpg"> 図3:超音波のセットアップ。 超音波実験のための典型的なハードウェアが示されている。超音波パラメータは、信号発生器によって設定され、トリガされ、アンプによって増幅されます。パワーメーターは、信号をマッチングボックスに送信する前に前方および反射力を記録するために使用できます。特に明記されていない限り、すべての接続はBNCケーブルを使用して実現されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62235/632235fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62235/632235fig04.jpg"> 図4:毛皮の除去と頭皮の除去の領域. (A)毛皮の除去は目の間から開始し、首の前半分まで伸びる必要があります。(B)頭皮除去は、頭頂骨を露出するのに十分であるべきである。出血は続行する前に停止する必要があります。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62235/632235fig04large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62235/632235fig05.jpg"> 図5:頭蓋ウィンドウの概要 頭蓋の窓は頭頂骨の上に置かれている。(A) 頭蓋窓の輪郭を頭蓋骨に描き、穴あけ加工を助けることができる。(B)頭蓋窓の輪郭は、コンパクトな骨を通して掘削した後に見ることができます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62235/632235fig05large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62235/632235fig06.jpg"> 図6:頭蓋窓とトランスデューサの位置合わせ。 (A)頭蓋窓は頭頂骨に作成される。骨の島が取り除かれ、下の脳が露出した。(B)ガラスカバースリップがシアノアクリル酸接着剤を使用して頭蓋骨に密封されると、頭蓋窓が完成します。(C)トランスデューサは頭蓋窓を中心にし、シアノアクリル酸接着剤を使用して接着する。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62235/632235fig06large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62235/632235fig07.jpg"> 図7:対物レンズとトランスデューサの位置決 め(A,B)対物レンズは、リングトランスデューサに中央に配置されています。(C)蛍光デキストランで満たされた血管は、眼球を通して、蛍光の下で見える。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62235/632235fig07large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62235/632235fig08.jpg"> 図8:BBB透過性の増加を誘導する超音波マイクロバブルの最大投影マルチフォトン画像。 超音波マイクロバブル治療後の血管系(A)前および(B)の最大投影画像。成功した超音波マイクロバブル治療は、治療後のBBB透過性の増加を観察することによって確認することができ、蛍光デキストランの外蒸気(矢印)として視覚化される。スケールバー:50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62235/632235fig08large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62235/62235fig9v4.jpg"> 図9:超音波マイクロバブル治療によって誘発される血管調節の分析。 超音波マイクロバブル治療の前、中、および後の脳血管の最大投影画像。マイクロバブルはすべての画像に存在します。(A)前処理条件と比較して、超音波マイクロバブル治療中に(B)明確な血管調節が観察され得る(赤い矢印)。BBB透過性の増加を媒介する超音波マイクロバブルは、血管内空間(黄色の矢印)への血管内からの蛍光デキストランの漏出からの治療後にも明らかである。(C)超音波をオフにすると、血管径は前処理、ベースラインサイズに戻る。(D)血管の変化は、超音波マイクロバブル処理の前、中、および後に対象血管の直径をプロットすることによって分析することができる。スケールバー:100 μm(未発表の作品) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62235/62235fig9v4large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62235/62235fig10v4.jpg"> 図10:超音波マイクロバブル治療に続く漏れ動態の分析。 BBB透過性の上昇は、血管内から血管外空間への蛍光デキストランの漏出として可視化される。BBB透過性の変化は、(A)前および(B)超音波マイクロバブル治療後に取得した画像スタックを比較する場合に明らかである。(C)漏れ動態は、血管外区画(黄色の長方形)におけるデキストランの強度、体積、速度を追跡することによって分析できます。スケールバー:50μm(未発表作品) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62235/62235fig10v4large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62235/632235fig11.jpg"> 図11:多光子顕微鏡XYZスタックの血管セグメンテーション. (A)トランスジェニックEGFPラットにおける血管の深さ(XYZ)スタック。血管は、テキサス赤70kDaデキストラン(赤)の静脈内注射を介して可視化される。緑色チャネルは、蛍光細胞および組織自己蛍光を示す。(B)血管の3D再構成を作成し、血管の種類に応じて色分けして、型特異的な分析を容易にする。静脈/静脈は青色、動脈/細動脈は赤、毛細血管はシアンです。スケールバー:50 μm。ビットプレーン・イマリスを使用して作成された再構築。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62235/632235fig11large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

このプロトコルは、血液脳関門透過性を高めるために、焦点を合わせて超音波およびマイクロバブル治療中にげっ歯類脳の生体 内 多光子蛍光イメージングをリアルタイムで可能にする外科的および技術的処置を記述する。

The blood-brain barrier (BBB) is a key challenge for the successful delivery of drugs to the brain. Ultrasound exposure in the presence of microbubbles ...

マイクロバブルの存在下での超音波暴露は、一過性および局所的に血液脳関門の透過性を増加させる有効な方法として出現している。通常、血液脳関門は、いくつかの脳疾患のための潜在的な薬物の送達を妨げる。超音波処理の際、注入されたマイクロバブルは振動を開始し、血管壁に緊張を誘発し、タイトな接合を開き、最終的には薬物が血液脳関門を越えることを可能にする前臨床モデルでは、超音波およびマイクロバブル治療の効果は、コントラスト強化された磁気共鳴画像法または色素ex vivoの血管の血管の血管切断を研究することによってしばしば研究される。このアプローチの欠点は、超音波暴露の間および直後のリアルタイム応答を取得できないことです。脳の生体内多光子イメージングは、リアルタイムでこれらの効果を研究する機会を与えます.以下のビデオでは、頭蓋窓をマウスに配置し、頭蓋骨に取り付けられたリングトランスデューサを使用して超音波マイクロバブル処理を行う方法について段階的な説明を紹介します。この手順は、同時超音波処理および生体内マルチフォトンイメージングを可能にする。頭蓋窓手術と超音波マイクロバブル治療に必要な材料を準備を開始します。このビデオでは、急性非回復頭蓋窓手術を示します。慢性回復頭蓋窓手術には、殺菌されたツールおよび材料、無菌の外科スペース、および適切な薬物が必要である。手術前麻酔と鎮痛を投与する。頭の毛皮を取り外します。動物を立体的なフレームに入れる。デキストランおよびマイクロバブルの注入のための尾静脈にカテーテルを挿入する。熱源を使用して、動物のコア温度を37度に保ちます。ここでは、ぬるま湯で満たされた手袋を使用しています。頭皮を取り除くために、鉗子を使って目の間の皮膚を持ち上げ、矢状縫合に沿って切ります。綿棒で頭蓋骨の外表面を覆う骨膜を取り除きます。その後、頭蓋骨の頭蓋窓の所望の位置をマークし、アウトラインに沿って掘削を開始します。掘削中に頭蓋骨が過熱するのを防ぐために、注射器を使用して頭蓋骨に生理食い物を滴下するか、生理食音に浸した外科スポンジを塗布します。頭蓋骨の掘削と冷却の間で交互に。骨の島に穏やかな圧力を加えることによって掘削の進捗状況を確認しなさい。鉗子のペアを使用して、骨の島を削除します。生理的に浸された外科用スポンジを使用して、脳が湿っていることを確認します。頭蓋窓を配置するには、カバースリップの片側に生理焼言を一滴置き、頭蓋骨の穴の上に操縦します。カバースリップの周囲に接着剤の層を広げて頭蓋骨に取り付けます。接着剤が完全に乾燥したら、窓にアガロース溶液を堆積させ、トランスデューサーを上に置きます。トランスデューサーと頭蓋窓の間にアガロースが最小限になるように、しっかりとした圧力を加えます。アガロースがJell-O様の一貫性に冷却されたら、トランスデューサのカバースリップの周囲から余分なアガロースを切り取ります。トランスデューサのカバースリップの周囲に接着剤の層を広げ、頭蓋骨に付着させます。接着剤が完全に乾燥した後、顕微鏡の対物レンズの下に動物を配置します。目的がトランスデューサやカバースリップと衝突しないことを確認します。多光子顕微鏡で視野を選択します。血管系のイメージングスキャンを設定し、超音波処理を開始します。このプロトコルでは、0.82メガヘルツの駆動周波数で動作するリングトランスデューサ、0.2~0.4の10ミリ秒周期、および1~4ヘルツ間のパルス繰り返し周波数を使用します。ソノヴューマイクロバブルは、1キログラムあたり1ミリリットルの用量で注入される。成功した超音波マイクロバブル治療は、血管内から血管外空間への蛍光デキストランの外挿によって検出することができ、BBB透過性の増加を示す。薬物送達の代表的なモデルとしてデキストラン漏れの運動を評価するために、MATLABなどのツールを用いて血管内空間と血管外空間間の信号強度を評価することができる。超音波マイクロバブル処理によって誘導される血管変化を評価するために、対象となる血管の直径は、超音波マイクロバブル処理の前、中、および後に測定することができる。画像解析は、ImageJ、FIJI、プログラミングツールなどのソフトウェアを使用して行うことができます。ここでイマリスは血管のセグメンテーションと分類に使用されました。リングトランスデューサと組み合わせた脳の生体内多光子顕微鏡検査は、超音波マイクロバブル処理によって誘導される効果を、高い空間的および時間的分解能でリアルタイムに監視する方法を提供する。定量的および定性的なデータは、例えば、血管外挿運動および血管変化を研究するために得ることができる。ここで提示される実験方法は、いくつかの研究モデルおよび様々な超音波用途に適用することができる。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

マイクロバブルのInsonationは減少時間平均音響パワーで、同様に治療薬の標的化送達のための腫瘍切除のための有望な戦略である。本研究の目的は、皮下C6神経膠腫への非熱的血管アブレーションとペイロードの配信を最大にするためには、低いデューティサイクルの超音波パルス化戦略とナノキャリアを開発することである。...

コントラストの超音波は、薬剤ベアリングナノ粒子デリバリーと微小血管アブレーションを経由してマウスの神経膠腫の治療を対象と

血液脳関門（BBB）のマイクロバブル媒介集束超音波の乱れは、脳の非侵襲的な標的薬物送達のための有望な技術です。...

ラットモデルでの経頭蓋集束超音波を用いた血液脳関門のMRI誘導破壊

このビデオでは、マイクロバブル媒介集束超音波(FUS)を使用して一時的な開口部を作成することにより、血液脳関門(BBB)を一時的に破壊する方法について説明しています。これらの一過性の局所BBB開口部は、最終的には、より大きなサイズの薬物分子を脳実質に直接送達するために使用できます。...

フォーカス超音波を用いたマイクロバブル媒介血液脳関門開口:超音波処理によりマウスの血液脳関門に局在性一過性開口を作製する技術

本研究は、ラットの脳に対して非侵襲的な高周波超音波および光音響ベースのイメージングを行うための新しいプロトコルを説明しています。これにより、動物の頭蓋骨に自然に存在する頭蓋骨孔に信号を向けることにより、深部皮質下領域とその血管パターンを効率的に視覚化します。...

非侵襲的実質細胞、血管および代謝高周波超音波および光音響ラット脳深部イメージング

このプロトコルは、単一細胞の解像度で、生体内で 、リアルタイムで多細胞相互作用の延長タイムラプスイメージングを実行するための多光子顕微鏡の使用を記載しています。...

腫瘍微小環境におけるリアルタイム多細胞ダイナミクスの拡張タイムラプス生体内イメージング

マイクロバブル剤を用いた集中超音波は、血液脳関門を局所的かつ一過性に開くことができる。この技術は、血液脳関門を越えて幅広い薬剤を送達するために使用されてきた。この記事では、MRI...

ラットモデルにおける集中超音波を用いた位置特異的血液脳関門開口へのベンチトップアプローチ

血液脳関門(BBB)は、マイクロバブル媒介性集中超音波(FUS)で一時的に破壊することができる。ここでは、非超音波専門家がアクセス可能なモジュラーFUSシステムを使用して、高スループットBBBのインビボでの開口のためのステップバイステッププロトコルについて説明する。...

げっ歯類における血液脳関門開口のためのハイスループット画像誘導定型神経ナビゲーションと集中超音波システム

このプロトコルは、集束超音波血液脳関門(BBB)の開口部、結果として生じる遺伝子発現の評価、および組織学的検査による化学遺伝学的受容体の神経調節活性の測定による遺伝子送達に必要なステップを描写します。...

脳構造を標的とし、化学遺伝学的神経調節を評価するための集束超音波誘発血液脳関門開口部

提示されたプロトコルは、超音波誘発薬物送達用途のために設計された蛍光標識マイクロバブルの応答を特徴付けるために使用することができ、その活性化メカニズムとその生物効果を含む。本論文では、関連する長さとタイムスケールを捉えるために実施されるイン ビトロ および インビボ...

超音波誘発薬物放出のための蛍光標識マイクロバブルの特性評価のためのマルチタイムスケール顕微鏡法

白血球および血小板の動員は、動脈形成中の側副動脈の効果的な成長に必要な必須成分を構成する。多光子顕微鏡は、動脈形成中の白血球の動員と血管外漏出を研究するために、 in vivoで...

マウス後肢モデルにおける動脈形成中の白血球動員モニタリングのための多光子生体内イメージング

この研究では、頸静脈カテーテル法を受けた生きたラットを利用して血液脳関門(BBB)の開口部を監視する、磁気共鳴画像法(MRI)と低強度パルス焦点式超音波(FUS)を組み合わせたプロトコルについて説明しています。...

前臨床焦点式超音波システムによるラットの血液脳関門開口部のモニタリング

学ぶ 多光子顕微鏡を用いたマウス脳のリアルタイムイメージング法。集中超音波とマイクロバブル治療による血液脳関門透過性の変化を可視化し、薬物送達の効果を評価する手法です。

リアルタイムの生体内多光子顕微鏡で、血液脳関門透過性を高める、集中超音波治療とマイクロバブル治療を可視化

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