リアルタイムの生体内多光子顕微鏡で、血液脳関門透過性を高める、集中超音波治療とマイクロバブル治療を可視化

マイクロバブルの存在下での超音波暴露は、一過性および局所的に血液脳関門の透過性を増加させる有効な方法として出現している。通常、血液脳関門は、いくつかの脳疾患のための潜在的な薬物の送達を妨げる。超音波処理の際、注入されたマイクロバブルは振動を開始し、血管壁に緊張を誘発し、タイトな接合を開き、最終的には薬物が血液脳関門を越えることを可能にする前臨床モデルでは、超音波およびマイクロバブル治療の効果は、コントラスト強化された磁気共鳴画像法または色素ex vivoの血管の血管の血管切断を研究することによってしばしば研究される。

このアプローチの欠点は、超音波暴露の間および直後のリアルタイム応答を取得できないことです。脳の生体内多光子イメージングは、リアルタイムでこれらの効果を研究する機会を与えます.以下のビデオでは、頭蓋窓をマウスに配置し、頭蓋骨に取り付けられたリングトランスデューサを使用して超音波マイクロバブル処理を行う方法について段階的な説明を紹介します。

この手順は、同時超音波処理および生体内マルチフォトンイメージングを可能にする。頭蓋窓手術と超音波マイクロバブル治療に必要な材料を準備を開始します。このビデオでは、急性非回復頭蓋窓手術を示します。

慢性回復頭蓋窓手術には、殺菌されたツールおよび材料、無菌の外科スペース、および適切な薬物が必要である。手術前麻酔と鎮痛を投与する。頭の毛皮を取り外します。

動物を立体的なフレームに入れる。デキストランおよびマイクロバブルの注入のための尾静脈にカテーテルを挿入する。熱源を使用して、動物のコア温度を37度に保ちます。

ここでは、ぬるま湯で満たされた手袋を使用しています。頭皮を取り除くために、鉗子を使って目の間の皮膚を持ち上げ、矢状縫合に沿って切ります。綿棒で頭蓋骨の外表面を覆う骨膜を取り除きます。

その後、頭蓋骨の頭蓋窓の所望の位置をマークし、アウトラインに沿って掘削を開始します。掘削中に頭蓋骨が過熱するのを防ぐために、注射器を使用して頭蓋骨に生理食い物を滴下するか、生理食音に浸した外科スポンジを塗布します。頭蓋骨の掘削と冷却の間で交互に。

骨の島に穏やかな圧力を加えることによって掘削の進捗状況を確認しなさい。鉗子のペアを使用して、骨の島を削除します。生理的に浸された外科用スポンジを使用して、脳が湿っていることを確認します。

頭蓋窓を配置するには、カバースリップの片側に生理焼言を一滴置き、頭蓋骨の穴の上に操縦します。カバースリップの周囲に接着剤の層を広げて頭蓋骨に取り付けます。接着剤が完全に乾燥したら、窓にアガロース溶液を堆積させ、トランスデューサーを上に置きます。

トランスデューサーと頭蓋窓の間にアガロースが最小限になるように、しっかりとした圧力を加えます。アガロースがJell-O様の一貫性に冷却されたら、トランスデューサのカバースリップの周囲から余分なアガロースを切り取ります。トランスデューサのカバースリップの周囲に接着剤の層を広げ、頭蓋骨に付着させます。

接着剤が完全に乾燥した後、顕微鏡の対物レンズの下に動物を配置します。目的がトランスデューサやカバースリップと衝突しないことを確認します。多光子顕微鏡で視野を選択します。

血管系のイメージングスキャンを設定し、超音波処理を開始します。このプロトコルでは、0.82メガヘルツの駆動周波数で動作するリングトランスデューサ、0.2~0.4の10ミリ秒周期、および1~4ヘルツ間のパルス繰り返し周波数を使用します。ソノヴューマイクロバブルは、1キログラムあたり1ミリリットルの用量で注入される。

成功した超音波マイクロバブル治療は、血管内から血管外空間への蛍光デキストランの外挿によって検出することができ、BBB透過性の増加を示す。薬物送達の代表的なモデルとしてデキストラン漏れの運動を評価するために、MATLABなどのツールを用いて血管内空間と血管外空間間の信号強度を評価することができる。超音波マイクロバブル処理によって誘導される血管変化を評価するために、対象となる血管の直径は、超音波マイクロバブル処理の前、中、および後に測定することができる。

画像解析は、ImageJ、FIJI、プログラミングツールなどのソフトウェアを使用して行うことができます。ここでイマリスは血管のセグメンテーションと分類に使用されました。リングトランスデューサと組み合わせた脳の生体内多光子顕微鏡検査は、超音波マイクロバブル処理によって誘導される効果を、高い空間的および時間的分解能でリアルタイムに監視する方法を提供する。

定量的および定性的なデータは、例えば、血管外挿運動および血管変化を研究するために得ることができる。ここで提示される実験方法は、いくつかの研究モデルおよび様々な超音波用途に適用することができる。