ヒトCRISPR設計CAR-T細胞の製造
March 15th, 2021
ここでは、CRISPR Cas技術を用いてCAR-T細胞を改変する原発ヒトT細胞における遺伝子編集プロトコルを紹介する。
本研究室のプロトコルは、ヒトゲノム編集とCAR T細胞療法の組み合わせを可能にします。実験室のプロシージャは高効率の3つまでの遺伝子を標的にするCRISPR-Cas9のアプローチである。そして最後に、私たちのアプローチは、ヒトの臨床試験に翻訳することができます。
記載された方法は、他のCAR構築物および標的遺伝子に適用することができる。この技術の基礎は、より大きな規模に翻訳され、さらなる発展のために学術的および業界の協力者に翻訳されるほど堅牢です。このプロトコルを初めて試す場合は、正確なインキュベーション時間を可能にするために、ガイドRNAスクリーン内のグループ数を制限してください。
記載されているように培養条件と播種密度に従い、私たちの経験において重要であることが証明されています。まず、健康なボランティアドナーから自家末梢血単核細胞(PBMC)を取得し、市販のCD4およびCD8選択キットを使用してCD4およびCD8陽性T細胞を単離する。CD4陽性細胞とCD8陽性T細胞を1対1の比率で組み合わせ、R10で1ミリリットル当たり300万個の細胞をインキュベートし、各ヒトIL7とヒトIL15の1ミリリットル当たり5ナノグラムを摂氏37度で一晩補う。
翌日、T細胞と遠心分離機をGの300倍で500万~1000万個の細胞を5分間数える。すべての上清を捨て、減らされた血清最低の必須媒体で細胞のペレットを洗う。メーカーの指示に従って、100マイクロリットルの核愛情溶液でペレットを再中断します。
細胞を洗浄しながら、リボヌクレオタンパク質、またはRNP複合体を調製し、Cas9ヌクレアーゼの10マイクログラムを室温で10分間10分間単導RNAの5マイクログラムでインキュベートする。単一ガイドRNAを含まないモックコントロールを含む。再懸濁した細胞をRNP複合体と組み合わせ、4マイクロモルエレクトロポレーションエンハンサーの4.2マイクロリットルを加えます。
よく混ぜてエレクトロポレーションキュベットに移します。パルスコードEH111を使用して細胞を電気ポレートし、R10で1ミリリットル当たり500万個の細胞をインキュベートし、12ウェルプレートで48時間摂氏30度で1ミリリットル当たり5ナノグラムを補う。インキュベーション後、T細胞の活性化および拡張を進めます。
標準的なプライマー設計ソフトウェアに PCR アンプリコンのシーケンスを入力して、シーケンシング プライマーを設計します。設計ソフトウェアは、サンガーシーケンシングに適した複数のプライマーシーケンスを提案します。インデルの周りの良好なシーケンシング品質を確保するために、gRNAカット部位の上流または下流の少なくとも150塩基対をアンプリコンと結合する前方および逆プライマーを選択します。
TIDE分析を使用して、ゲノムレベルでのノックアウト効率を検出します。このアルゴリズムは、シーケンストレースからインデルのスペクトルを正確に再構築し、Rの二乗値を計算します。活性化後、T細胞は培養中に拡大され、将来の研究のために凍結保存される。
拡張中、母集団の倍増と体積変化は、モックと編集されたCAR Tセルの両方のプロトコル全体で追跡されます。拡大中の増殖と活性化に有意な変化は検出されなかった。細胞が凍結保存されると、CAR発現のレベルは、モック編集およびノックアウトCAR T細胞の両方のさらなる機能研究のために決定された。
有意な変化は認められない。ノックアウト効率は複数の技術を用いて決定することができる。これらの代表的なフローサイトメトリープロットでは、PDCD1およびTRAC lociを単一ガイドRNAを用いて標的化し、複数の健康なドナー間でのPDCD1単一ガイドRNAに対して90%、TRAC単導路RNAに対して98%の効率を示した。
Cas9とガイドRNAのモル比が正確であることを確認することが重要です。処置の間、細胞は常に摂氏4度に保たれ、長期間エレクトロポレーション溶液に残されてはならない。CAR保存後、CRISPRが設計したCAR T細胞は、細胞毒性アッセイ、サイトカイン産生、および共遺伝学的または異種腫瘍マウスモデルなどのインビトロおよびインビボ機能アッセイに使用できます。
CRISPR Cas9技術を用いた当社のアプローチは、現在臨床試験に応用されています。このアプローチは、世界中の何百万人もの子供と大人に影響を与えるヘモグロビンオファチーなどの非悪性遺伝性疾患と同様に、癌の両方に使用することができます。
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概要
この記事では、CRISPR-Cas技術を使用して一次ヒトT細胞で遺伝子編集を行うプロトコルを提示し、CAR-T細胞を改変するための方法を紹介します。この方法論により、複数の遺伝子を効率的にターゲットにすることが可能となり、臨床応用への道を開きます。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 遺伝子編集
- 免疫療法
- CRISPR技術
背景
- ヒトゲノム編集は急速に進歩している分野です。
- CAR-T細胞療法は様々ながんの治療に有望性を示しています。
- CRISPR-Cas9は正確な遺伝子改変のための強力なツールです。
- これらの技術を組み合わせることで治療効果を高めることができます。
研究の目的
- T細胞の遺伝子を編集するための堅牢なプロトコルを開発すること。
- 改善された効力のためのCAR-T細胞の改変を可能にすること。
- これらの方法を臨床試験に適用するための促進。
使用された方法
- 遺伝子ターゲティングのためのCRISPR-Cas9技術。
- 最適な遺伝子編集のためのガイドRNAのスクリーニング。
- T細胞の改変に合わせたインキュベーションプロトコル。
- 様々なCARコンストラクトへの方法の適用。
主要な結果
- 最大3つの遺伝子を同時にターゲットにする高い効率。
- 異なるCARコンストラクトに適応可能な方法。
- 学術および産業環境での拡張可能性の可能性。
- 臨床試験の準備を支持する成功な予備結果。
結論
- このプロトコルは、高度なCAR-T細胞療法の基盤を提供します。
- 堅牢な技術は様々な研究コンテキストに適用できます。
- 将来の研究は、これらの方法の最適化と検証に焦点を当てます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
CRISPR-engineered CAR-T cell production enables multiplex gene editing for next-generation adoptive cell therapies, directly addressing biological de-risking and target validation challenges in immuno-oncology pipelines. This protocol supports robust, scalable workflows for functional interrogation of gene targets and CAR constructs, facilitating predictive confidence at key discovery and translational inflection points. Its universal applicability positions it as a reusable platform for both hematological and solid tumor R&D portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional knockout of candidate genes to clarify mechanistic roles in T cell biology.
- Supports multiplexed hypothesis testing for pathway de-risking and target prioritization.
- Facilitates rapid lead gRNA selection and validation for translational continuity.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, reproducible CAR-T cell populations for downstream functional assays.
- Provides quantitative knockout efficiency metrics via TIDE analysis and flow cytometry.
- Prepares engineered cells for high-throughput cytotoxicity and cytokine screening platforms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns engineered CAR-T cells with in vitro and in vivo disease-relevant models for efficacy testing.
- Enables continuity from gene editing through preclinical validation and functional assessment.
- Supports risk-adjusted advancement decisions for clinical translation of novel CAR-T constructs.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates from early discovery through lead identification and preclinical validation, supporting iterative target interrogation and functional screening.
- Discovery Biology: Provides a platform for null hypothesis testing and mechanistic de-risking of gene targets in T cells.
- Screening: Standardizes CAR-T cell preparation for reproducible, quantitative assay outputs.
- Analytics: Enables precise measurement of knockout efficiency and CAR expression for comparative analyses.
- Translational Research: Bridges engineered cell production with in vivo efficacy and biomarker studies.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, adaptable workflow for diverse CAR constructs and gene targets across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CAR-T development.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable gene editing workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling robust target validation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of CAR-T assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in T cell isolation, CRISPR-Cas9 editing, and flow cytometry analytics.
- Demands access to electroporation instrumentation and validated analytical platforms.
- Necessitates strict adherence to culture conditions and reagent ratios for reproducibility.
- Adaptable to various CAR constructs and gene targets with appropriate gRNA design.
- Practical limitations include cell viability and editing efficiency variability across donors.
