4倍のチェッカーボード:薬物の組み合わせを研究するための三次元チェッカーボードの変形
2021年7月24日
このプロトコルは、1回の実験で4つの薬剤の間で得ることができるすべての可能な組み合わせを研究する方法を説明します。この方法は、標準の96ウェルプレートマイクロ希釈アッセイと、結果を評価するための分数抑制濃度(FICs)の計算に基づいています。
クワッドチェッカーボードは、4つの薬剤を組み合わせることで得られるすべての可能な組み合わせを研究する手法であり、耐性微生物、主にMDRまたは多剤耐性微生物としても知られる耐性微生物の治療法を見つけることが重要です。この技術は労働集約的ではなく、翌日または潜伏期間終了後に結果を得ることができます。これに加えて、これら4つの薬とすべてを組み合わせることによって得られる特定の非常に限られた組み合わせだけでなく、すべての可能な組み合わせを1つの実験で研究することができます。
これに加えて、この手法は、微生物学だけでなく、微生物学でさえも、複数の学問分野で使用できます。抗菌剤だけでなく、異なる抗菌剤間のあらゆる可能な組み合わせを研究することができます。微生物学の部分に加えて、抗がん剤間、植物抽出物と薬物間、さらには分子有効分子治療パネル間の組み合わせを研究するために使用できます。
準備場所4 96、テープを使用して正方形を形成するために互いに隣り合った井戸プレート、一緒にテープでそれらの底をテープで固定します。この手順を繰り返して、それぞれに 4 つのプレートを含む 4 つのパネルを取得し、それらに 1、A 2、A three、および A Four という名前を付けます。50マイクロリットルのミューラーを追加します。
ヒントと1696の列2と列11の間の井戸にブロス、4つのパネルの井戸プレートは、ネガティブコントロールとして機能する井戸H 12に200マイクロリットルのミューラーヒントンブロスを追加します。4つのパネルの1696ウェルプレートでは、1つの50マイクロリットルのミューラーヒントンブロスをウェルに追加し、1696ウェルプレートの4つのパネルの1696ウェルプレートでポジティブコントロールウェルとして機能し、15mlで円錐形のチューブにセフォタキシムの連続希釈を行います。滅菌蒸留水。
式C one V 1はC 2 V 2に等しいという式に従って、薬物のストック溶液から除去される体積を計算します。15mlの滅菌蒸留水から計算された容量を取り出し、同じ容量の薬物ストック溶液を円錐管ピペット50マイクロリットルの調製された薬物溶液に列11および列12の各ウェルに加え、ウェルH 12を除いて、列11から50マイクロリットルを取り出し、列10の対応するウェルに入れることにより、段階希釈を開始し、 そして、10から列2に到達するまで、列2から取り出された50マイクロリットルが廃棄されます。4つのパネルの1696ウェルプレートのそれぞれについて、段階希釈を繰り返します。
10 mLの円錐形チューブに2つのアミカ段階希釈剤を投与します。滅菌蒸留水。薬物の原液から除去する体積を計算します。
10 mLの滅菌蒸留水から計算された容量を取り出し、同量の薬物ストック溶液をコニカルチューブに追加します。.別の96ウェルプレートを取り、ローズGとこのプレートの間のウェルに100マイクロリットルの滅菌ミューラーヒントンブロスを追加し、このプレート B.In、以前に準備した薬物の100マイクロリットルを追加します。2、列G.Diluteの井戸への解決策は、RO G.Andの各井戸から百マイクロリットルを取ることにより、列Gから列B.Repeatの井戸から100マイクロリットルを廃棄し、これらの手順を繰り返して、8つの別々の96ウェルプレートの薬物2を4つのパネルピペットにピペット50マイクロリットルの薬物2に転送し、列GとBの間のウェルから4枚のパネル内の各プレートに対応するウェルは、1枚、96枚プレートに100マイクロリットルの薬剤が2枚入っています。
これは、1つのパネル医薬品に2つのプレートを入れるのに十分です。14mlの滅菌蒸留水で4つの異なる円錐形のチューブに加えて、ロースの3つのライブ。薬物の原液から除去する体積を計算します。
各チューブから14mlの滅菌蒸留水から計算された容量を取り出し、対応する薬物の量を追加します。3番目の薬物の必要濃度を調製した後、50マイクロリットルを取り、対応するプレートの列BとG、および列2と12の間の対応するウェルに追加します。Cの各パネルで、1つは4つのPに対応し、1つのプレートと4つのパネルCは4つのPに対応し、2つのプレートと4つのパネルC3は4つのPに対応し、3つのプレートと4つのパネルとC4は4つのPに対応し、4つのプレートと4つのパネルと4つのパネルは4つのPに対応し、4つのパネルと4つのパネルは、円錐形のチューブに4つのトリメトプリムスルファメトキサゾールを追加し、14mlを追加します。
蒸留水に努めてください。薬物の原液から除去する体積を計算します。各チューブの14mlの滅菌蒸留水から計算された容量を取り出し、必要な量の薬物を追加します。
4番目の薬物の必要濃度を調製した後、50マイクロリットルを取り、行BとG、および列2と12の間の対応するウェルに追加します。対応するパネル内の4枚のプレートのうち、Cの1枚がパネル1に対応し、Cの2枚がパネル2に対応し、Cの4枚がパネル4に対応し、パネル3が対応し、C4がパネル4に対応する。滅菌ループトランスファーを使用したI-E-S-B-Lに等しい細菌接種物の調製と添加。
細菌性分離物の1つのコロニーは、以前にプレート上で2mlの滅菌ミューラーヒントンブロスと渦に培養された濁度をチェックし、密度を使用して0.5マクファーランドであるべき濁度を確認します 滅菌尿カップにA TML滅菌ミューラーヒントンブロスを追加します 0.5マクファーランド接種物から尿カップに細菌接種物を追加します 式C 1 V 1はC 2 V 2に等しく、V 1は800マイクロリットルに等しいパイプピペット50マイクロリットルの接種溶液と、無菌制御であるH 12を除く各ウェルに、パネルを摂氏37度で一晩インキュベートします。この図はパネルAのものを表しています。カラードウェルはバクテリアの増殖を封じ込めるウェルで、黒い矢印は増殖中のウェルを表しています。
プレート1、プレート2、プレート3に成長インターフェースがありません。プレート4のトリメトプリムスルファメトキサゾールの8つ以上のMICに加えて、セフォタキシムとレボフロキサシンのいくつかのサブマイクに加えて、アミカシンの8つ以上のMICを含むD列に阻害があることがわかります。この組み合わせを含む象限には細菌の増殖が見られないことに気付きます。
これは、このプレートには、成長を完全に阻害するレボフロキサシンのMICがあるためです。図1 Bはパネル2を表しています。このパネルでは、細菌増殖の阻害がRDにも見られ、セフォタキシムとレボフロキサシンの亜種に加えて、アミカシンの1つ以上のMICとトリメトプリムスルファメトキサゾールの4MICの1つ以上が含まれています。
この図では、セフォタキシムとレボフロキサシンのサブマイクが数個含まれている列Cと列Dに細菌の増殖抑制が見られ、トリメトプリムスルファメトキサゾールの半分のMICに加えて、行CのアミカシンのMICが1つ以上、行DのアミカシンのMICが1つ以上、D列のアミカシンのMICが1つ以上、図1DはパネルAの4を表していることがわかります。このパネルには、トリメトプリムスルファメトキサゾールのMICが1つあり、セフォタキシム、アミカシン、レボフロキサシンの濃度が数倍です。この図では、この阻害がシートFICのトリメトプリムスルファメトキサゾールの1つのMICの効果である組み合わせを含む象限で、細菌の増殖が完全に抑制されていることがわかります。
この表には、最終的なサウンドFICと、取得された値の解釈が表示されます。結論として、Qチェッカーボード法は、1回の実験で4つの薬物間のすべての可能な組み合わせを研究します。結果は翌日に取得され、Excelテンプレートを使用して簡単かつ迅速に解釈されます。
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概要
このプロトコルは、1回の実験で4つの薬物のすべての可能な組み合わせを研究するための四重チェッカーボードとして知られる方法を概説しています。主に、96ウェルプレート微量希釈アッセイを使用して効果的な評価を行う多剤耐性微生物の治療に対処することを目的としています。
主要な研究要素
研究分野
- 微生物学
- 薬理学
- 薬剤耐性
背景
- この方法は、耐性微生物に対する治療法を探索するために重要です。
- さまざまな微生物学的薬剤や抗がん剤にも適用可能です。
- 迅速な結果を得るための効率的な実験を促進します。
使用される方法
- 四重チェッカーボード技術
- 薬物希釈と連動した細菌接種培養の準備
- 96ウェル微量希釈プレートの使用
主な結果
- すべての薬物組み合わせを1回の実験で合成できます。
- 結果は迅速で、多くの場合、培養の翌日には利用可能です。
- 様々な耐性株に対する効果的な治療法を特定する可能性があります。
結論
- この研究は、薬物相互作用を体系的に評価する技術を実証しています。
- 耐性感染症に対する微生物学と治療戦略の進歩に重要な意味を持ちます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
The quadruple checkerboard (Q-checkerboard) enables comprehensive, high-throughput evaluation of four-drug combinations, directly addressing the challenge of multi-drug resistance in discovery-stage anti-infective and oncology pipelines. By maximizing combinatorial coverage in a single experiment, this method accelerates mechanistic de-risking and supports predictive confidence for portfolio triage. Its rapid turnaround and scalability make it a strategic asset for early-stage combination therapy development and translational research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic interrogation of therapeutic hypotheses involving multi-agent regimens.
- Supports functional validation of drug synergy and antagonism across diverse compound classes.
- Facilitates biological de-risking by mapping combinatorial effects on resistant phenotypes.
- Provides actionable data for predictive confidence and early portfolio prioritization.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, quantitative systems for downstream screening of drug interactions.
- Standardizes assay conditions for reproducibility and cross-study comparability.
- Delivers high-content, quantitative outputs suitable for rapid compound evaluation.
- Enables scalable, multiplexed screening workflows for combination optimization.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro combination data with translational biomarker strategies for resistant pathogens.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation of combination regimens.
- Informs risk-adjusted advancement decisions for multi-agent therapeutic candidates.
- Provides mechanistic insight into combinatorial efficacy and resistance suppression.
Pipeline & Workflow Integration
The Q-checkerboard method integrates at the intersection of early discovery, lead identification, and preclinical combination assessment, enabling seamless transition from hypothesis testing to translational validation.
- Discovery Biology: Supports robust hypothesis testing and pathway clarification for multi-drug strategies.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts for high-throughput combination evaluation.
- Analytics: Provides FIC index calculations and growth inhibition metrics for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical models for resistant organism targeting.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, adaptable platform for diverse drug classes and research areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in combination therapy development.
- Operational Value: Streamlines workflows, enhances reproducibility, and enables rapid data generation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by de-risking early-stage combinations.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of multi-agent regimens.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microdilution techniques and combinatorial assay design.
- Demands precise liquid handling and analytical infrastructure for high-throughput data capture.
- Benefits from standardized protocols and cross-team alignment for reproducibility.
- Adaptable to various drug classes and biological systems with appropriate validation.
- Complexity necessitates careful planning to minimize error and maximize data integrity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduciton
1:29
Panels Preparation
2:49
Drug 1, Cefotaxime, Serial Dilution
4:06
Drug 2, Amikacin, Serial Dilution
5:33
Transfer of Drug 2 to the Four Panels
5:56
Drug 3, Levofloxacin, Addition
6:55
Drug 4, Trimethoprim- Sulfamethoxazole, Addition
7:48
Preparation and Addition of Bacterial Inoculum E.coil ESBL
8:55
Results
10:53
Conclusion
