Name: マウス心臓における光遺伝学的マルチサイト光刺激の適用による高度な心調律管理 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: 学ぶマウス心臓の光遺伝学的マルチサイト光刺激法。Langendorff灌流心臓で3×3マイクロLEDアレイを用いて不整脈を終息させる技術を解説。刺激パラメータと照射面積が除細動効率に与える影響を評価し、心電図と光学マッピングでリアルタイムに心臓活動をモニタリングする方法を示す。

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著者らは、実験中の優れた技術サポートに対して、マリオン・クンツェとティナ・アルトハウスに感謝したいと思います。この成果につながる研究は、欧州共同体の第7次枠組みプログラムFP7/2007-2013から助成金契約番号HEALTH-F2-2009-241526で資金提供を受けています。ドイツ心臓血管研究センター、DZHK e.V.(プロジェクトMD28)、パートナーサイトゲッティンゲン、ドイツ研究財団CRC 1002(プロジェクトC03)、マックスプランク協会からも支援を受けました。この研究の一部は、ドイツ研究財団(DFG、助成金番号EXC 1086)が資金提供するBrainLinks-BrainTools、クラスターオブエクセレンスによってサポートされました。

すべての実験は、ドイツの法律、地域の規定、および欧州実験動物科学協会連盟(FELASA)の勧告に従って、動物福祉規則に厳密に従いました。動物実験の承認申請は、担当の動物福祉当局によって承認され、すべての実験は動物福祉担当者に報告されました。
1. 実験準備と材料
<ol><li>光学マッピングのセットアップ メモ: オプティカルセットアップと電気セットアップを 図1に示します。光学および電気のセットアップで使用されるすべてのコンポーネントは、材料の表に詳細に記載されています。<ol><li>LED1とLED2を使用して、不整脈の誘発とバックアップ除細動を行います。ChR26の励起波長のピークである475nm付近の波長λ青色の高出力LEDを選択してください。光スペクトルをさらに狭めるには、470 ± 20 nmのバンドパスフィルターを使用します。 注:データシート20によると、この作業では、LED1とLED2の典型的な放射束は3.9〜5.3Wです。</li>
		<li>中心波長λ赤色=625nm、放射束700mWの光を放射する高出力赤色LED(図1のLED 3)で光学マッピング用の心外膜を照明します21。赤色光は628±20nmのバンドパスフィルターでフィルタリングされ、カットオフ波長λDM = 685nmのロングパスダイクロイックミラー(DM)で反射されます。</li>
		<li>カメラ対物レンズの前にλフィルターカム=775±70 nmの発光フィルターを使用して、心臓活動の蛍光発光のみを記録します。低照度用途に適した高速対物レンズを使用してください。 注:マウスの心臓の細動の頻度は20〜35Hzの範囲です。したがって、1〜2kHz以上の周波数で録画するのに十分な速度のカメラを使用してください。</li>
	</ol></li>
	<li>マイクロLEDアレイ 注:ここで適用されるマイクロLEDアレイは、他の場所でさらに詳しく説明されているように、マイクロシステム処理を使用して実現されます16,17。<ol><li>厚さ5μmのポリイミド(PI)層を4インチのシリコン基板(片面研磨、厚さ525μm)にスピンコートします。</li>
		<li>このPI層を窒素雰囲気下で最高温度450°Cで硬化させる。最高温度を10分間一定に保ちます。</li>
		<li>紫外(UV)リソグラフィーとスパッタを用いて画像反転フォトレジスト(PR)を成膜し、250nmの薄い白金層(Pt)を成膜します。</li>
		<li>このPtベースのメタライゼーションを厚くし、厚さ1μmの金(Au)層を電気めっきし、パターン化されたPRをマスキング層として使用します。</li>
		<li>第2のPI層をスピンコーティングする前に、第1のPI層とAu電気メッキメタライゼーションを備えたウェーハを、PI層の表面を化学的に活性化する酸素プラズマにさらします。</li>
		<li>2番目のPI層を450°Cで再度硬化させ、UVリソグラフィを適用してPR層をパターン化し、パターン化されたPRをマスキング層として使用して反応性イオンエッチング(RIE)により、マイクロLEDチップとインターフェースプリント回路基板(PCB)のアレイのコンタクトパッドを開きます。 注意: このRIEプロセスステップでは、コンタクトパッドの開口部と2次元(2D)マイクロLEDアレイの外形を定義するために、それぞれ200Wと100Wを10分と30分間適用することをお勧めします。</li>
		<li>溶剤とプラズマエッチングを使用してPRを剥がします。さらに厚さ6μmの金層を電気めっきして、コンタクトパッドをさらに厚くします。</li>
		<li>フリップチップボンダーを使用して、マイクロLEDチップをコンタクトパッドに取り付けます。</li>
		<li>酸素プラズマでPI表面を活性化し、マイクロLEDチップを無溶剤接着剤でアンダーフィルします。その後、接着剤を120°Cで12時間硬化させます。</li>
		<li>マイクロLEDチップをカプセル化するには、アルゴンで別のプラズマ処理を行い、薄いフルオロポリマー層を手動で塗布します。この層を80°Cで1時間予備硬化します。</li>
		<li>マイクロLEDアレイを酸素プラズマにさらした後、最終的なカプセル化層としてシリコーンを手動で塗布し、下にあるフルオロポリマー層へのシリコン接着性を向上させるために使用されます。シリコーン層を80°Cと180°Cでそれぞれ1時間硬化させます。これらの最終硬化工程はまた、フルオロポリマー層を完全に硬化させる。</li>
		<li>PI基板のコンタクトパッドを、アレイを外部計測器に相互接続するためのストリップコネクタを備えたプリント回路基板にはんだ付けします。接着剤を使用してPCB上のはんだパッドを覆います。</li>
	</ol></li>
	<li>電気設備<ol><li>心電図(ECG)の記録に適した電極、例えば銀/塩化銀電極または単相活動電位(MAP)電極とECGアンプを使用して、心臓の電気的活動を継続的に監視します。さらに、適切なアクイジションデバイス(AD)を使用して、取得したすべての電気信号を記録します。</li>
		<li>各デバイスに印加される最大電流を管理できる高出力LED(LED 1、LED 2、およびLED 3)に最適なドライバを選択してください。任意関数発生器(AFG)を使用して、LEDドライバの出力を正確に制御します。</li>
		<li>マルチチャネルLEDドライバを使用して、マイクロLEDアレイを流れる電流を制御します。複数の出力を持つAFGもこのタスクに適しています。 注意: 電流をマイクロLEDの最大電流に制限するLEDドライバを選択することをお勧めします, そうしないと、ダイオードが損傷する可能性があります.マルチチャネルマイクロLEDドライバの一例は、別の著作物18に記載されている。必要に応じて、AFGまたはその他のLEDドライバをコンピュータに接続して、マイクロLED設定をリモート制御することができます。この場合、LEDドライバを、汎用インタフェースバス(GPIB)やシリアル接続など、選択した通信プロトコルを使用してコンピュータに接続します。</li>
	</ol></li>
</ol>   

2. 実験手順
<ol><li>溶液調製<ol><li>タイロード溶液の調製:130 mM NaCl、4 mM KCl、1 mM MgCl 2、24 mM NaHCO3、1.8 mM CaCl 2、1.2 mM KH2 PO 4、5.6 mM グルコース、0.1% BSA/アルブミン。</li>
		<li>Low-K+ タイロードの溶液を準備する: Low-K+ タイロードの溶液は、KClの半分の量しか添加されないことを除いて、通常のタイロードの溶液と同じ方法で作成されます(4 mM KClではなく2 mM)。 注:3時間続く実験の場合、通常2〜3 LのLow-K + Tyrod(光学マッピングが実行されている場合はさらにブレビスタチン(ステップ2.1.5)と混合されます)および1〜2Lの通常のTyradeで十分です。</li>
		<li>ピナシジルをLow-K + Thirodeの溶液に加えて、22に記載されているように不整脈誘発のプロセスを容易にし、100 mM濃度を取得します。.ピナシジルを取り扱うときは、保護実験用手袋を着用してください。.</li>
		<li>通常のタイロード溶液で1 mLの50 μM DI-4-ANBDQPQを調製します。光退色を防ぐために染料を光から保護します。</li>
		<li>ブレビスタチンの10 mMストック溶液を作ります。光学マッピングのために、ブレビスタチンを100 mMピナシジル-チロード溶液(ステップ2.1.3)と混合して、5 μM溶液を得ます。ブレビスタチンを取り扱うときは、保護実験用手袋を着用してください。. 注意: 光学マッピングが始まるまで、染料とブレビスタチン溶液の両方を脇に置いておきます。</li>
	</ol></li>
	<li>ランゲンドルフ灌流 注:セットアップは、2つのTyrodeのソリューション用の2つのリザーバーで構成されています。それらは、三方コックを備えたチューブを介してバブルトラップに接続されています。心臓は後でルアーロックコネクタによってバブルトラップに取り付けられ、六角形の水浴に吊り下げられます。次に、水浴は、使用済みのTyrodeの溶液を収集するために廃棄物容器に接続されています。<ol><li>すべての実験の前に、完全に脱塩された水ですべてのチューブを清掃してください。</li>
		<li>実験を開始する前に、両方のTyrode溶液をカルボーゲン(5%CO2および95%O2)で室温で30分間通気します。タイロード溶液のpH値をNaOHで7.4に調整します。</li>
		<li>各Tyrodeの溶液を対応するリザーバーに500 mL充填し、チューブまたはバブルトラップに閉じ込められた気泡が見られなくなるまで、灌流システムにTyrodeの溶液を流して、チューブとバブルトラップを脱気します。</li>
		<li>Carbogenを使用したリザーバーでの実験全体を通してTyrodeの溶液を通気し続け、灌流液のpHが後で灌流中に安定していることを確認します。</li>
		<li>灌流システムを水ヒートポンプで37°Cに加熱します。防水加熱ケーブルなどの追加の発熱体を使用して、水浴内の灌流液温度を一定に保ちます。 注:実験中は、Tyrodeの貯水池が空になる前に補充することが重要です。そうしないと、気泡が心臓に入り、血管を詰まらせて虚血を引き起こす可能性があります。</li>
	</ol></li>
	<li>マウスの準備<ol><li>心臓隔離手順の30分前に500 IEヘパリン0.1 mLを皮下注射します。.</li>
		<li>6 cmのペトリ皿と2 mLのシリンジに氷冷したタイロード溶液を入れます。実体顕微鏡の下に置きます。</li>
		<li>飽和イソフルラン環境でマウスの短時間麻酔を2分間行い、その後すぐに頸部脱臼を行います。. 注:十分な麻酔を確認するためには、負のつま先間反射のチェックが絶対に必要です。</li>
		<li>胸を開き、他の場所23で説明されているように心臓を取り除き、氷のように冷たいTyrodeの溶液を入れた6cmのペトリ皿に入れます。温度低下により心臓の鼓動が減少します。</li>
		<li>他の場所で詳述されているように、実体顕微鏡下で細かい準備を行います23.大動脈を鈍い針に取り付け、縫合材料で血管を固定します。</li>
		<li>対照として、氷のように冷たいTyrodeの溶液を針を通して心臓に注入し、心臓がしっかりと取り付けられていることを確認します。このステップはまた、心臓から残りの血液を洗い流します。</li>
		<li>マウントされた心臓を灌流システムに移します。針をバブルトラップに接続している間、空気が心臓に入るのを防ぐために灌流液が流れていることを確認してください。心臓が水浴中のTyrodeの溶液で覆われていることを確認してください。手順 2.3.4、2.3.5、および 2.3.7 を 図 2 に示します。</li>
		<li>数分以内に心臓が鼓動し始めることを確認してください。心臓を灌流設定に15〜20分間適応させてから、ピナシジルを含む低K + Tyrodeの溶液(ステップ2.1.3)に切り替えます 光学マッピングを実行する場合は、ピナシジルとブレビスタチンを含むlow-K + Tyrodeの溶液(ステップ2.1.5)に切り替えます。</li>
	</ol></li>
	<li>不整脈誘導と光解動<ol><li>良好な信号品質を確保するために、ECG電極の1つを心臓表面のできるだけ近くに配置します。2番目のECG電極をタイロードの溶液に吊り下げます。取得したECGが選択したADによって記録されていることを確認してください。</li>
		<li>マイクロLEDアレイを研究の対象領域、たとえば左心室に配置します。</li>
		<li>灌流をピナシジルを含む低K + チロードに変更し、心臓を15〜30分間灌流します。.</li>
		<li>不整脈を誘発するには、周波数f indが25〜35 Hz、パルス持続時間Windが2〜15 ms、光強度LIopt_indが2.8 mW mm-2の20〜50光パルスの列で、LED1とLED2で心臓を照らします。</li>
		<li>不整脈が誘発されるまでこのプロセスを繰り返します。 注:不整脈は、信号の周波数と形態が通常の洞調律とは異なるため、ECG信号で簡単に識別できます。不整脈が次の5秒以内に終了した場合は、自己終了として分類し、新しい誘導の試みを開始します。</li>
		<li>持続的な不整脈が視覚的に検出されたら、アレイの3つ、6つ、または9つのマイクロLEDを使用して、15 mAのパルス電流Iパルスで異なる幅Wdefおよび周波数fdefのパルスのバーストを適用し、光強度LIμLED = 33.31 ± 2.05 mW mm-2になります。</li>
		<li>5回のマイクロLEDアレイベースの除細動試行後も不整脈が続く場合は、その試みを失敗として分類し、バックアップ除細動を開始します。</li>
		<li>バックアップ除細動には、マイクロLEDアレイに設定されているのと同じタイミングパラメータを使用して、LED1とLED2を使用します。 注:心臓は実験期間全体にわたって虚血性および代謝性ストレスにさらされるため、バックアップ除細動でも不整脈の終了の試みが失敗する可能性があります。これが起こるときはいつでも、灌流溶液を通常のタイロードの溶液に変更し、心臓を5〜10分間回復させます。ECGが洞調律に戻ったら、ステップ2.4.3のプロトコルをもう一度繰り返します。</li>
	</ol></li>
	<li>オプティカルマッピング<ol><li>ステップ2.1.5で調製したブレビスタチン溶液で心臓を灌流し、機械的脱役が発生するまで待ちます。.これは、心臓の鼓動が停止したときに達成されますが、ECG信号はまだ測定可能です。 注:ブレビスタチン溶液を上記の濃度に混合し、心臓をこの溶液で灌流し続けると、実験全体を通して電気的活動から切り離された心臓の機械的活動が維持されます。</li>
		<li>1 mLの電圧色素DI-4-ANBDQPQ(ステップ2.1.4で調製)を、ランゲンドルフ灌流のバブルトラップのボーラスとして与えます。染料が心臓に均一に灌流されるまで5〜10分待ちます。 注意: 録音が行われていないときはいつでも赤色光を消して、染料の光退色を避けてください。録音の信号対雑音比が小さすぎる(集録した信号のノイズが多すぎる)場合は、手順2.1.4と2.5.2を繰り返します。</li>
		<li>カメラを心臓の表面に焦点を合わせ、LED 3をオンにして、1.27 mW mm-2 の光パワーを適用します。</li>
		<li>実験室の照明を消して録音を開始します。取得した信号の周波数を記録されたECGの周波数と比較して、光信号が取得されていることを確認します。これにより、得られた光信号が純粋に心臓の電気的活動に関連していることが保証されます。 注:色素が発する蛍光は非常に一週間であるため、光学マッピングは暗い部屋で行われます。これにより、他の光源からの信号干渉が回避されます。</li>
	</ol></li>
</ol>

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著者は利益相反を宣言していません。

心臓頻脈性不整脈の治療の成功は、心臓治療の鍵です。しかし、不整脈の開始、永続化、終了の根底にある生物物理学的メカニズムは完全には理解されていません。したがって、心臓研究は、不整脈のより穏やかな終了に向けて電気ショック療法を最適化し、それによって患者の生活の質を向上させることを目的としています28,29,30,31。低エネルギーの電気的アプローチは、重篤な副作用の大幅な減少を約束するが、それでも望ましくない筋肉の興奮を誘発する可能性がある。心臓オプトジェネティクスはこの制限を克服し、組織穏やかな終結技術だけでなく、無傷のマウス心臓および細胞培養における渦様励起波の不整脈特異的標的制御を調査するための柔軟なプラットフォームも提供できます32,33。
<p clas...

不整脈時の時空間ダイナミクスの初期の研究により、心細動時の複雑な電気パターンは、渦のような回転励起波によって駆動されることが明らかになりました1。この発見は、不整脈の根底にあるメカニズムについての新しい洞察を与え、心筋の多部位興奮に基づく新しい電気的終結療法の開発につながりました2,3,4。ただし、電界刺激を使用した治療は非局所的であり、筋肉組織を含む周囲のすべての興奮性細胞を神経支配し、細胞および組織の損傷、および耐え難い痛みを引き起こす可能性があります。電気療法とは対照的に、光遺伝学的アプローチは、心筋細胞の活動電位を高い空間的および時間的精度で誘発するための特異的で組織保護的な技術を提供します。したがって、光遺伝学的刺激は、心臓細動中のカオス的活性化パターンの最小限の侵襲的制御の可能性を秘めています。
遺伝子操作5,6,7を介して興奮性細胞に光感受性イオンチャネルロドプシン-2(ChR2)を導入することで、光刺激を使用して興奮性細胞の膜電位の脱分極が可能になりました。ニューロンネットワークの活性化、心臓活動の制御、視力および聴覚の回復、脊髄損傷の治療などを含むいくつかの医学的用途が開発されている8,9,10,11,12,13,14。心臓病学におけるChR2の応用は、そのミリ秒の応答時間15のために大きな可能性を秘めており、不整脈心ダイナミクスの標的制御に非常に適しています。
この研究では、トランスジェニックマウスモデルの無傷の心臓のマルチサイト光刺激が示されています。要約すると、トランスジェニックα-MHC-ChR2マウス株は、欧州共同体の第7次フレームワークプログラムFP7 / 2007-2013(HEALTH-F2-2009-241526)の範囲内で確立され、S.E.Lehnart教授によって親切に提供されました。一般に、α-MHCの制御下でCre-リコンビナーゼを発現するトランスジェニック成体雄C57/B6/Jは、雌の B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm27.1(CAG-COP4*H134R/tdトマト)Hye/Jと対になっていた。心臓STOPカセットは第2世代で欠失したため、子孫は安定したMHC-ChR2発現を示し、心臓感光性コロニーを維持するために使用されました。全ての実験は、36〜48週齢の両性の成体マウスを用いて行われた。照明は、シリコンベースのハウジングおよび短い光ガラスファイバが実装されていないことを除いて、16,17で説明したように製造された3×3マイクロLEDアレイを用いて達成される。心臓アプリケーションでの最初の使用法は18で発見されました。同様の製造技術に基づく線形マイクロLEDアレイが、心臓ペーシング19のための貫通プローブとして適用されている。マイクロLEDは、550μmピッチで3 x 3アレイに配置され、非常に小さな領域で高い空間分解能と高い放射電力の両方を提供します。著者らは、この研究で、新しい抗不整脈治療法を開発するための道を開く可能性のある、用途の広い局所多部位光刺激を示しています。
以下の実験プロトコルには、逆行性ランゲンドルフ灌流ex vivoが含まれ、そのためにカニューレ大動脈が灌流入口として機能します。加えられた灌流圧と心臓収縮のために、灌流液は大動脈から分岐する冠状動脈を通って流れています。提示された研究では、灌流液リザーバーを1 mの高さ(73.2 mmHgに相当)に上げることによって達成される定圧セットアップを使用して心臓を灌流し、2.633 ± 0.583 mL / minの流量になります。実験中、2種類のTyrode溶液が灌流液として使用されます。通常のTyrodeのソリューションは安定した洞調律をサポートしますが、Low-K + Tyrodeのソリューションはピナシジルと混合して、マウスの心臓に不整脈を誘発することができます。六角形のウォーターバスを使用することで、6つの異なる平面窓を通して心臓を観察することができ、屈折による歪みの少ない複数の光学部品の結合が可能になります。

<table><tbody><tr><td>化学成分</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ブレビスタチン</td><td>TargetMol</td><td>T6038</td><td>10 mM 原液</td></tr><tr><td>BSA/アルブミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4919</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td>CaCl2</td></tr><tr><td>カルボゲン</td><td>ヴェストファーレン</td><td></td><td>50 l ボトル</td></tr><tr><td>DI-4-ANBDQPQ</td><td>AAT Bioquest</td><td>21499</td><td>光学マッピング用染料</td></tr><tr><td>グルコース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9434</td><td>C6H12O6</td></tr><tr><td>ヘパリン</td><td>LEO Pharma</td><td></td><td>ヘパリン-ナトリウム レオ 25.000 I.E./5 ml、処方箋でのみ入手可能</td></tr><tr><td>塩酸</td><td>Merck</td><td>1.09057.1000</td><td>HCl、1 M ストック溶液</td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>CP Pharma</td><td></td><td>1 ml/ml、処方箋でのみ入手可能</td></tr><tr><td>マグネシウム塩化物</td><td>メルク</td><td>8.14733.0500</td><td>MgCl2</td></tr><tr><td>リン酸一カリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30407</td><td>KH2PO4</td></tr><tr><td>ピナシチル一水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P154-500mg</td><td>10 mM ストック溶液</td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td>KCl</td></tr><tr><td>重炭酸</td>ナトリウム <td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>NaHCO3</td></tr><tr><td>ナトリウム塩化物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>メルク</td><td>1.09137.1000</td><td>NaOH、1 M ストックソリューション</td></tr><tr><td>電気セットアップ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biopac MP150</td><td>Biopac Systems</td><td>MP150WSW</td><td>データ収集および分析システム</td></tr><tr><td>カスタムメイドの心電図、代替 ECG100C</td><td>Biopac システム</td><td>ECG100C</td><td>心電図アンプ</td></tr><tr><td>ヒーティングケーブルを使用したカスタムメイドのウォーターバスヒーター</td><td>RMSヒーティングシステム</td><td>HK-5,0-12</td><td>ヒーティングケーブル 120W</td></tr><tr><td>六角形のウォーターバス</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LEDドライバ 電源</td><td>Thorlabs</td><td>KPS101</td><td>15 V、2.4 A 電源ユニット、3.5 mmジャックコネクタ付き 1つのK-またはT-Cube用。</td></tr><tr><td>LEDD1B LEDドライバー</td><td>Thorlabs</td><td>LEDD1B</td><td>T-Cube LEDドライバー、最大駆動電流</td></tr><tr><td>MAP、ECG電極</td><td>Hugo Sachs Elektronik</td><td>BS4&nbsp;73-0200</td><td>アイソールテッドハート用ミニECG電極</td></tr><tr><td>マイクロLEDドライバー(例:AFG</td><td>Agilent Instruments</td><td>A-2230</td><td>任意関数発生器(AFG)</td></tr><tr><td>信号発生器</td><td>Agilent Instruments</td><td>A-2230</td><td>AFG</td></tr><tr><td>micro-LEDアレイコンポーネント</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>エポキシ接着剤</td><td>エポキシ技術</td><td>EPO-TEK 353ND</td><td>2成分エポキシ</td></tr><tr><td>フッ素樹脂</td><td>&nbsp;旭硝子(株)</td><td>Cytop 809M</td><td>高透明フッ素樹脂</td></tr><tr><td>画像反転フォトレジスト</td><td>Merck KGaA</td><td>AZ 5214E</td> 高解像度LEDチップ<td>用画像反転レジスト</td></tr><tr><td></td><td>&nbsp;株式会社Cree</td><td>C460TR2227-S2100</td><td>青色マイクロLED</td></tr><tr><td>フォトレジスト</td><td>メルク KGaA</td><td>AZ 9260</td><td>厚ポジフォトレジスト</td></tr><tr><td>ポリイミド</td><td>UBE Industries Ltd.</td><td>U-ワニス S</td><td>ポリイミド溶液</td></tr><tr><td>シリコーン</td><td>NuSil Technology LLC</td><td>MED-6215</td><td>低粘度シリコーンエラストマー</td></tr><tr><td>無溶剤接着剤</td><td>John P. Kummer GmbH</td><td>Epo-Tek 301-2</td><td>低粘度エポキシ樹脂</td></tr><tr><td>光学マッピング</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ブルーフィルター</td><td>クロマテクノロジーコーポレーション</td><td>ET470/40x</td><td>ブルー励起フィルター</td></tr><tr><td>カメラ</td><td>フォトメトリクス</td><td>カスケード 128+</td><td>高性能 EMCCD カメラ</td></tr><tr><td>カメラ 対物レンズ</td><td>Navitar</td><td>DO-5095</td><td>Navitar 高速固定焦点レンズは CCD および CMOS カメラで動作します</td></tr><tr><td>ダイクロイック ミラー</td><td>Semrock</td><td>FF685-Di02-25x36</td><td>685 nm エッジ BrightLine&reg; シングルエッジ標準落射蛍光ダイクロイック ビームスプリッター</td></tr><tr><td>エミシオン フィルター</td><td>Semrock</td><td>FF01-775/140-25</td><td>775/140 nm BrightLine&reg; シングルバンドバンドパスフィルター</td></tr><tr>ヒート<td>シンク</td><td>Advanced Thermal Solutions</td><td>ATSEU-077A-C3-R0</td><td>ヒートシンク - LED スター LED ヒートシンク、直径 45mm、68mm、ブラック/シルバー、ネジ山なしベースプレート ハードウェア</td></tr><tr><td>LED LED 1 および LED 2</td><td>LED Engin Osram</td><td>LZ4-00B208</td><td>ハイパワー LED - シングルカラー ブルー、460 nm 130 lm、700mA</td></tr><tr><td>LED 3</td><td>Thorlabs</td><td>M625L3</td><td>625 nm、700 mW (Min) マウント LED、1000 mA</td></tr><tr><td>レンズ</td><td>LED Engin Osram</td><td>LLNF-2T06-H</td><td>LED 照明レンズ アセンブリ LZ4 レンズ ナロー フラッド ビーム</td></tr><tr><td>パワー メーター用フォトダイオード</td><td>Thorlabs</td><td>S120VC</td><td>標準フォトダイオード パワー センサー</td></tr><tr><td>パワー メーター</td><td>Thorlabs</td><td>PM100D</td><td>コンパクト パワー & エネルギー メーター</td></tr><tr><td>レッド フィルター</td><td>Semrock</td><td>FF02-628/40-25</td><td>ブライトライン&reg;シングルバンドバンドパスフィルタ</td></tr></tbody></table>

マウス心臓における光遺伝学的マルチサイト光刺激の適用による高度な心調律管理

Advanced Cardiac Rhythm Management by Applying Optogenetic Multi-Site Photostimulation in Murine Hearts

心室頻脈性不整脈は、世界中の死亡率と罹患率の主な原因です。高エネルギー電気ショックを用いた電気除細動は、現在、生命を脅かす心室細動の唯一の治療法です。しかし、除細動は耐え難い痛み、組織の損傷、予後の悪化などの副作用をもたらす可能性があり、より穏やかな心調律管理戦略の開発に対する重要な医学的必要性を示しています。エネルギーを低減する電気的アプローチに加えて、心臓オプトジェネティクスは、光感受性膜イオンチャネルと光パルスを使用して心臓の活動に影響を与える強力なツールとして導入されました。本研究では、ランゲンドルフ灌流された無傷のマウス心臓の光刺激を成功させるための堅牢で有効な方法を、3 x 3アレイのマイクロ発光ダイオード(マイクロLED)を適用したマルチサイトペーシングに基づいて説明します。心外膜電圧波の同時光学マッピングにより、領域特異的刺激の効果を調査し、新たに誘発された心臓活動を現場で直接評価することができます。得られた結果は、除細動の有効性が心不整脈の間の光刺激のために選択されたパラメータに強く依存することを示している。心臓の照明領域が重要な役割を果たすことが実証されます 終了の成功と、 不整脈パターンを変更するための照明中の心臓活動の標的制御をどのように達成できるか。要約すると、この技術は、心調律のリアルタイムフィードバック制御に向かう途中で現場でのメカニズム操作を最適化する可能性を提供し、領域特異性に関して、非特異的な電気ショックアプリケーションの使用と比較して心臓系への潜在的な害を減らすための新しいアプローチを提供します。

このプロトコルは、LED 1とLED 2(図1)によって生成された光刺激パルスを使用して、無傷のマウス心臓に心室性不整脈を誘導し、周波数f indは25 Hz〜35 Hz、パルス持続時間Windは2ミリ秒から10ミリ秒です。このような急速な光パルスの目的は、心臓のリズムを捉えることではなく、心臓活動のバランスを崩して不規則な電波を発生させ、不整脈を促進することです。電気刺激による誘導よりも光で不整脈を誘発することの利点は、ECGにアーチファクトが引き起こされないことであり、取得した信号を制限なく後分析し、急速なペーシング中の心臓の電気的応答を評価する可能性を提供し、この事実はまた、光除細動中の心臓の挙動を観察する可能性を提供する。これは、電気誘導法や除細動法では不可能です。それにもかかわらず、使用されるセットアップが、例えば、場所の制約のために、外部の高出力LEDの使用を許可しない場合、他の場所3、22、<sup cl...

本研究では、トランスジェニックチャネルロドプシン-2(ChR2)マウスの無傷マウス心臓の心調律を、マイクロLEDアレイによる局所光刺激と心外膜電位の同時光学マッピングを用いて制御する方法を報告する。

Ventricular tachyarrhythmias are a major cause of mortality and morbidity worldwide. Electrical defibrillation using high-energy electric shocks is ...

身体的に最も根底にある心臓細動と除細動は完全には理解されていません。オプトジェネティクスは、適切に制御された環境で心臓現象についてより多くの洞察を得る方法を提供できます。マイクロLEDを使用した局所光刺激により、特定の心臓組織領域の革新が可能になります。この標的刺激は、心臓に優しい抗算術療法法を開発するための新しいツールです。示されたプロトコルは、心不整脈中、特に終了中の心臓の行動を研究するために使用できます。将来的には、開発された技術は、より臨床的に関連性のある大型動物モデルの研究に使用できます。すべての実験の前に、すべてのチューブを完全に脱塩水で洗浄してください。甲状腺溶液をカルボゲンで室温で30分間通気し、水酸化ナトリウムと塩酸でpHを7.3に調整します。灌流システムを水ヒートポンプで摂氏37度に加熱します。防水加熱ケーブルなどの追加の発熱体を使用して、水浴内の灌流液温度を一定に保ちます。各甲状腺溶液500ミリリットルを対応するリザーバーに追加し、チューブまたはバブルトラップに閉じ込められた気泡が見られなくなるまで甲状腺溶液を灌流システムに通すことによって、チューブとバブルトラップを脱気します。実験全体を通して、カルボゲンを含むリザーバーで甲状腺溶液を通気し続け、灌流液のpHが後で灌流中に安定していることを確認します。心臓を取り除いた後、実体顕微鏡下で微細な調製を行う。大動脈を鈍い針に取り付け、縫合材料で血管を固定します。対照として、氷冷した甲状腺溶液を針を通して心臓に注入し、心臓がしっかりと取り付けられていることを確認します。取り付けられた心臓を灌流システムに移し、針をバブルトラップに接続している間、空気が心臓に入るのを防ぐために灌流液が流れていることを確認します。心臓が水浴中の甲状腺溶液で覆われていること、および数分以内に鼓動していることを確認してください。良好な信号品質を確保するために、ECG電極の1つを心臓表面のできるだけ近くに配置します。2番目のECG電極を甲状腺溶液に吊り下げ、ECGが記録されていることを確認します。マイクロLEDアレイを対象領域に配置します。ペネシルで灌流を低カリウム甲状腺に変更し、心臓を15〜30分間熟読します。不整脈を誘発するには、25〜35ヘルツの周波数、2〜15ミリ秒のパルス持続時間、および2.8ミリメートルあたり2.8ミリメートルの光強度で20〜50の光パルスの列でLED1とLED2で心臓を照らします。不整脈が誘発されるまでこのプロセスを繰り返します。持続的な不整脈が視覚的に検出されたら、アレイの3つ、6つ、または9つのマイクロLEDを使用して、15ミリアンペアピアのパルス電流でさまざまな幅と周波数のパルスのバーストを適用します。5回のマイクロLEDアレイベースの除細動試行後も不整脈が続く場合は、その試みを失敗として分類し、同じタイミングパラメータを持つLED1とLED2を使用してバックアップ除細動を開始します。心臓をブレビスタチン溶液で灌流し、心臓の鼓動が停止したときに達成される機械的脱役が起こるまで待つが、ECG信号は依然として測定可能である。1ミリリットルの電圧染料、染料4-A-N-B-D-Q-P-Qをランゲンドルフ灌流のバブルトラップのボーラスとして与え、染料が心臓を均一に熟読できるように5〜10分待ちます。LED 3 をオンにします。カメラを心臓の表面に焦点を合わせ、1.27ミリメートルあたり1.27ミリワットの光パワーを適用します。実験室の照明を消して記録を開始し、取得した信号の周波数を記録されたECGの周波数と比較することにより、光信号が取得されていることを確認します。異なる周波数、マイクロLEDの数、およびパルス持続時間を使用した一連の実験を11匹のマウスでテストし、1〜20ミリ秒のパルスが異なる成功率で除細動できることを実証しました。除細動周波数18ヘルツと20ヘルツでパルス持続時間が1ミリ秒と20ミリ秒の9つのLEDの成功率が大幅に増加し、これは、誤差間隔がプラスマイナス4ポイントゼロ3ヘルツのすべての不整脈の分析平均不整脈周波数22.55に近い。ここでは、14ヘルツの周波数での2つの異なる除細動の試みと、ECG記録とそれぞれのスペクトログラムを示します。30ミリ秒のパルスによる除細動の例では、光刺激が始まるまで不整脈の支配的な周波数がわずかに増加します。VFはVTに変換され、支配周波数が14ヘルツに低下した後、終了に失敗し、24ヘルツの支配周波数で不整脈行動に戻ります。2番目の例では、セグメント1は、23ヘルツの支配周波数のVTと、光刺激が始まるまでの高調波成分を示しており、パルス幅は20ミリ秒です。セグメント3は、3.5ヘルツの基本周波数と結果として生じる高調波の正常な正弦リズムにつながる正常な終端を示しています。高速カメラによる光学マッピングは、正常な洞調律中の心臓の単一拍動中に蛍光強度の変化を示した。灌流の長さは、心臓を健康に保つためのすべての条件、すなわち温度、pH値、および酸化を一定に保つ必要があります。システム内の気泡が心臓に損傷を与える可能性があるため、チロイド溶液が空にならないことが特に重要です。マイクロリアリティアレイは大きな柔軟性を提供します。不整脈を適切に終結させるために、心臓のさまざまな場所をターゲットにしたり、1回の実験で複数のアレイを組み合わせたりすることもできます。

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Research

JoVE Journal

Medicine

医学

この記事では、電位差色素（ジ- 8 -...

ランゲンドルフ灌流ラット心臓の光学的マッピング

この記事では、パノラマのイメージングシステムを用いてランゲンドルフ灌流ウサギの心臓、およびデュアル（電圧とカルシウム）画像診断法で光学マッピング実験を実施するための基本的な手順について説明します。...

ランゲンドルフ灌流ウサギの心臓のMultiparametric光学マッピング

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マウスの心臓の活動電位およびカルシウムトランジェントの光学的マッピング

このプロトコルを記述する高時空分解能、膜電位のデュアル録音を含む光学マッピング システムを利用したマウスの心房の電気生理学的評価と Ca2...

高解像度光学マッピングとマウスの心房の電気生理学的評価

ここでは、心臓内の自律神経系の変調とその基本的な電気生理学、不整脈原性、および前のヴィヴォ蛍光セットアップを使用してキャンプのダイナミクスに及ぼす影響の評価のためのプロトコルを提案する.

心臓電気生理学、不整脈原性Ex Vivo蛍光システムで心臓内のニューロンの影響

本研究の目的は、翻訳動物モデルを用いて心臓動態を調べる方法を確立することにあった。記述された実験的アプローチは、孤立した無傷の豚の心臓モデルにおける電気的活動を評価するための電気生理学的研究と共に二重放出眼電図を組み込む。...

元ヴィヴォ・ランゲンドルフ・パーフュード・ハーツの眼電図と電気生理学研究

ウサギ心筋細胞におけるGtACR1活性化の電気機械効果を評価するプロトコルを提示する。細胞分離、培養、アデノウイルス伝達、パッチクランプ、炭素繊維技術による機能実験に関する詳細な情報を提供します。...

光遺伝学的変調型心筋細胞活性の電気機械評価

本プロトコールは、OCT画像化および光遺伝学的心臓ペーシングのために、心臓においてeNpHR2.0またはReaChRオプシンを発現するショウジョウバエメラノガスターの生成を記載する。ショウジョウバエOCTイメージングおよび心拍調節のための詳細な指示は、異なる発達段階における生きた動物における回復可能な心停止、徐脈、および頻脈のシミュレーションを含む、報告されている。...

ショウ ジョウバエのメラノガスター モデルの開発による心機能のイメージングと光遺伝学的制御

このプロトコルは、高い時間的および空間的分解能の膜貫通電圧および細胞内Ca2+...

カテコールアミン作動性多形性心室頻拍の RyR2R2474S ノックインマウスの心臓の二重色素光学マッピング

このプロトコルは、トランスジェニックマウス心臓の内因性心臓ニューロンの光遺伝学的刺激の方法を示しています。記載されているアプローチは、 ex vivo...

切除灌流マウス心臓における内因性心臓自律神経ニューロンの光遺伝学的活性化

光を使って心臓の細胞や組織を制御することで、非接触で刺激を受けることができるため、細胞の自然な状態や機能を保つことができるため、基礎研究や治療への応用に有用なアプローチとなっています。...

非遺伝的光刺激によるCa2+ 伝播を研究するための心臓微小生理学的システム

学ぶマウス心臓の光遺伝学的マルチサイト光刺激法。Langendorff灌流心臓で3×3マイクロLEDアレイを用いて不整脈を終息させる技術を解説。刺激パラメータと照射面積が除細動効率に与える影響を評価し、心電図と光学マッピングでリアルタイムに心臓活動をモニタリングする方法を示す。

マウス心臓における光遺伝学的マルチサイト光刺激の適用による高度な心調律管理

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