マウス心臓における光遺伝学的マルチサイト光刺激の適用による高度な心調律管理

身体的に最も根底にある心臓細動と除細動は完全には理解されていません。オプトジェネティクスは、適切に制御された環境で心臓現象についてより多くの洞察を得る方法を提供できます。マイクロLEDを使用した局所光刺激により、特定の心臓組織領域の革新が可能になります。

この標的刺激は、心臓に優しい抗算術療法法を開発するための新しいツールです。示されたプロトコルは、心不整脈中、特に終了中の心臓の行動を研究するために使用できます。将来的には、開発された技術は、より臨床的に関連性のある大型動物モデルの研究に使用できます。

すべての実験の前に、すべてのチューブを完全に脱塩水で洗浄してください。甲状腺溶液をカルボゲンで室温で30分間通気し、水酸化ナトリウムと塩酸でpHを7.3に調整します。灌流システムを水ヒートポンプで摂氏37度に加熱します。

防水加熱ケーブルなどの追加の発熱体を使用して、水浴内の灌流液温度を一定に保ちます。各甲状腺溶液500ミリリットルを対応するリザーバーに追加し、チューブまたはバブルトラップに閉じ込められた気泡が見られなくなるまで甲状腺溶液を灌流システムに通すことによって、チューブとバブルトラップを脱気します。実験全体を通して、カルボゲンを含むリザーバーで甲状腺溶液を通気し続け、灌流液のpHが後で灌流中に安定していることを確認します。

心臓を取り除いた後、実体顕微鏡下で微細な調製を行う。大動脈を鈍い針に取り付け、縫合材料で血管を固定します。対照として、氷冷した甲状腺溶液を針を通して心臓に注入し、心臓がしっかりと取り付けられていることを確認します。

取り付けられた心臓を灌流システムに移し、針をバブルトラップに接続している間、空気が心臓に入るのを防ぐために灌流液が流れていることを確認します。心臓が水浴中の甲状腺溶液で覆われていること、および数分以内に鼓動していることを確認してください。良好な信号品質を確保するために、ECG電極の1つを心臓表面のできるだけ近くに配置します。

2番目のECG電極を甲状腺溶液に吊り下げ、ECGが記録されていることを確認します。マイクロLEDアレイを対象領域に配置します。ペネシルで灌流を低カリウム甲状腺に変更し、心臓を15〜30分間熟読します。

不整脈を誘発するには、25〜35ヘルツの周波数、2〜15ミリ秒のパルス持続時間、および2.8ミリメートルあたり2.8ミリメートルの光強度で20〜50の光パルスの列でLED1とLED2で心臓を照らします。不整脈が誘発されるまでこのプロセスを繰り返します。持続的な不整脈が視覚的に検出されたら、アレイの3つ、6つ、または9つのマイクロLEDを使用して、15ミリアンペアピアのパルス電流でさまざまな幅と周波数のパルスのバーストを適用します。

5回のマイクロLEDアレイベースの除細動試行後も不整脈が続く場合は、その試みを失敗として分類し、同じタイミングパラメータを持つLED1とLED2を使用してバックアップ除細動を開始します。心臓をブレビスタチン溶液で灌流し、心臓の鼓動が停止したときに達成される機械的脱役が起こるまで待つが、ECG信号は依然として測定可能である。1ミリリットルの電圧染料、染料4-A-N-B-D-Q-P-Qをランゲンドルフ灌流のバブルトラップのボーラスとして与え、染料が心臓を均一に熟読できるように5〜10分待ちます。

LED 3 をオンにします。カメラを心臓の表面に焦点を合わせ、1.27ミリメートルあたり1.27ミリワットの光パワーを適用します。実験室の照明を消して記録を開始し、取得した信号の周波数を記録されたECGの周波数と比較することにより、光信号が取得されていることを確認します。

異なる周波数、マイクロLEDの数、およびパルス持続時間を使用した一連の実験を11匹のマウスでテストし、1〜20ミリ秒のパルスが異なる成功率で除細動できることを実証しました。除細動周波数18ヘルツと20ヘルツでパルス持続時間が1ミリ秒と20ミリ秒の9つのLEDの成功率が大幅に増加し、これは、誤差間隔がプラスマイナス4ポイントゼロ3ヘルツのすべての不整脈の分析平均不整脈周波数22.55に近い。ここでは、14ヘルツの周波数での2つの異なる除細動の試みと、ECG記録とそれぞれのスペクトログラムを示します。

30ミリ秒のパルスによる除細動の例では、光刺激が始まるまで不整脈の支配的な周波数がわずかに増加します。VFはVTに変換され、支配周波数が14ヘルツに低下した後、終了に失敗し、24ヘルツの支配周波数で不整脈行動に戻ります。2番目の例では、セグメント1は、23ヘルツの支配周波数のVTと、光刺激が始まるまでの高調波成分を示しており、パルス幅は20ミリ秒です。

セグメント3は、3.5ヘルツの基本周波数と結果として生じる高調波の正常な正弦リズムにつながる正常な終端を示しています。高速カメラによる光学マッピングは、正常な洞調律中の心臓の単一拍動中に蛍光強度の変化を示した。灌流の長さは、心臓を健康に保つためのすべての条件、すなわち温度、pH値、および酸化を一定に保つ必要があります。

システム内の気泡が心臓に損傷を与える可能性があるため、チロイド溶液が空にならないことが特に重要です。マイクロリアリティアレイは大きな柔軟性を提供します。不整脈を適切に終結させるために、心臓のさまざまな場所をターゲットにしたり、1回の実験で複数のアレイを組み合わせたりすることもできます。