Name: 免疫細胞による一過性ピコニュートン受容体力をマッピングするためのDNA張力プローブ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: 学ぶDNA張力プローブを用いた免疫細胞の一過性ピコニュートン受容体力マッピング法。蛍光顕微鏡で可視化・定量化し、ロック機構により短寿命の力イベントを記録・解析できる。

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この作業は、NIH Grants R01GM131099、NIH R01GM124472、およびNSF CAREER 1350829の支援を受けました。pMHCリガンドに関するNIHテトラマーファシリティに感謝します。この研究は、Emory Comprehensive Glycomics Coreによって部分的にサポートされました。

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<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+integrins+exhibit+anisotropic+mechanosensing+and+harness+piconewton+forces+to+mediate+platelet+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Platelet integrins exhibit anisotropic mechanosensing and harness piconewton forces to mediate platelet aggregation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (2), 325-330 (2018).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinetics+of+two-dimensional+TCR+and+pMHC+interactions+determine+T-cell+responsiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The kinetics of two-dimensional TCR and pMHC interactions determine T-cell responsiveness.</a> Nature. 464 (7290), 932-936 (2010).</li>
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<li>Hui, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+costimulatory+receptor+CD28+is+a+primary+target+for+PD-1-mediated+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">T cell costimulatory receptor CD28 is a primary target for PD-1-mediated inhibition.</a> Science. 355 (6332), 1428-1433 (2017).</li>
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</ol>

著者は利益相反を宣言しません。

ここで提供される詳細な手順を使用して、免疫細胞によって産生される受容体張力をマッピングおよび定量するためのDNAヘアピン張力プローブ基板を調製することができます。細胞がDNAヘアピンテンションプローブ基板にプレーティングされると、受容体が化学的および機械的にリガンドを感知し、後者はプローブによって検出されるため、細胞は着地、付着、拡散します。ただし、場合によっては、細胞が広がることができないことがあります(図 7A)または張力信号の生成に失敗します。これは多くの場合、表面化学の問題の結果であり、トラブルシューティングが必要です(テーブル 1).低いリガンド密度は、細胞拡散の失敗をもたらす最も一般的な問題の1つである。これは、分解されたリガンド、分解されたDNA鎖、APTESおよび/またはLA-PEG-NHSなどの加水分解試薬、凝集した金ナノ粒子、または不十分なガラスカバーガラス洗浄などの複数の要因の結果である可能性があります。成功した実験と失敗した実験の基質バックグラウンド蛍光強度を比較することにより(...

免疫細胞は、標的細胞の表面を連続的に這い回って抗原を探し、その表面をスタッディングすることにより、病原体や癌細胞から防御します1,2。抗原認識は、T細胞受容体(TCR)と標的細胞の表面に発現するペプチド主要組織適合遺伝子複合体MHC(pMHC)複合体との間の結合時に開始される。TCR-pMHC認識は2つのモバイルセル間の接合部で発生するため、機械的な力を受けることが長い間疑われてきました。さらに、これはTCR活性化のメカノセンサーモデルにつながり、TCR力がその機能に寄与することを示唆しています3,4。機械的な力がいつ、どこで、どのようにT細胞の機能に寄与するかを理解するには、T細胞によって伝達される分子力を視覚化するツールを開発することが不可欠です。伝統的に、牽引力顕微鏡(TFM)やマイクロピラーアレイなどの方法が細胞力を調べるために使用されます5,6。しかし、TFMおよびマイクロピラーアレイの力感度はナノニュートン(nN)スケールであるため、細胞受容体によって伝達される分子ピコニュートン(pN)力を研究するには不十分なことがよくあります7。検出力と空間分解能を向上させるために、私たちの研究室は、ポリエチレングリコール(PEG)ポリマーを使用して最初に合成された分子張力プローブの開発を開拓しました7。分子張力プローブは、蛍光色素と消光物質に隣接する拡張可能な分子「バネ」(PEG、タンパク質、DNA)で構成され、表面に固定されています。プローブの末端に力を加えるとプローブが伸長し、蛍光色素と消光物質が分離され、強い蛍光シグナルが生成されます(図1A)8,9,10。
過去10年間にわたり、核酸11、タンパク質10、およびポリマー8から作られたスプリングエレメントを備えたさまざまなクラスの分子張力プローブのライブラリを開発してきました。これらの中で、DNAベースのテンションプローブは、最高のS/N比と最大の力感度を提供し、数pNから~20pNまで簡単に調整できます11。これらのリアルタイムDNAテンションプローブを使用して、線維芽細胞、癌細胞、血小板、免疫細胞など、さまざまな種類の細胞によって生成される分子力を研究しています11,12,13。この原稿では、従来の蛍光顕微鏡を使用してpN力分解能で分子受容体力をマッピングするために、表面上でDNA張力プローブを合成および組み立てるためのプロトコルについて説明します。現在の手順には、蛍光レポーターを導入するための核酸の化学修飾が含まれていますが(図1B)、修飾および精製手順の多くはカスタムDNA合成会社に委託できることに注意することが重要です。したがって、DNA張力プローブ技術は容易であり、より広範な細胞生物学およびメカノバイオロジーコミュニティが利用できます。
簡単に言うと、DNA張力センサーを組み立てるために、DNAヘアピンを一方のアームの蛍光リガンド鎖ともう一方のアームのクエンチャーアンカー鎖にハイブリダイズし、ガラス基板に固定化します(図1C、リアルタイム張力)。機械的な力がない場合、ヘアピンは閉じられ、蛍光は消光します。しかし、加えられた機械的な力がF1/2 (50%の確率で展開する平衡時の力)よりも大きい場合、ヘアピンは機械的に溶け、蛍光シグナルが発生します。
リアルタイムDNA張力センサーに基づいて、免疫細胞上の受容体とその天然リガンドとの間の相互作用を研究するのに特に役立つ蓄積された力をマッピングするためのプロトコルについても説明します。これは、免疫受容体がしばしば短命結合を示すためである3,14。蓄積された力は、開いたDNAヘアピンに優先的に結合し、機械的引っ張りイベントに関連する蛍光シグナルの保存を可能にする「ロック」鎖を使用して画像化されます(図1C、ロック張力)。ロッキングストランドは、ヘアピンの機械的に誘発された融解時に露出する不可解な結合部位を結合し、ヘアピンの再折り畳みをブロックして張力信号を格納し、蓄積された張力マップを生成することによってヘアピンを開いた状態にロックするように設計されています。さらに、ロッキング鎖は8ヌクレオチドのトーホールドで設計されており、その完全な補体である「ロック解除」鎖とのトーホールドを介した鎖置換反応を可能にします。ロック解除ストランドを追加すると、バインドされたロックストランドがヘアピン構造から剥がされ、保存されているテンション信号が消去され、ヘアピンがリアルタイム状態にリセットされます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62348/62348fig01.jpg"> 図1:最先端の分子張力プローブのスキーム 。 (A)リアルタイム分子張力プローブの一般的な設計、(B)DNAベースの張力プローブ構築のための鎖、および(C)設計されたDNAベースの張力プローブと、リアルタイム状態とロック状態の間のそれらの切り替え。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62348/62348fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
メインプロトコルは、オリゴヌクレオチド調製、表面処理、イメージング、およびデータ分析の4つの主要なセクションで構成されています。このプロトコルは、ナイーブで活性化されたOT-1 CD8+ T細胞、OT-II CD4 + 細胞、およびハイブリドーマにおいて私たちの研究室や他の人々によって首尾よく実証されており、T細胞受容体、プログラム細胞死受容体(PD1)、およびリンパ球機能関連抗原1(LFA-1)力を含むさまざまな免疫細胞受容体を調べるために適用できます。OT-1 CD8+ ナイーブT細胞は、この論文の細胞株の例として使用されています。

<table><tbody><tr><td>&nbsp;3-ヒドロキシピコリン酸 (3-HPA)</td><td>Sigma</td><td>56197</td><td>maldi-TOF-MS matrix</td></tr><tr><td>&nbsp;mPEG-SC</td><td>バイオケペグ</td><td>MF001023-2K</td><td>表面調製</td></tr> <tr><td>(3-アミノプロピル) トリエトキシシラン</td><td>アクロス</td><td>AC430941000</td><td>表面調製</td></tr><tr><td>10x 赤血球溶解バッファー</td><td>バイオレジェンド</td><td>00-4333-57</td><td>バッファー</td></tr><tr><td>8.8 nm 金ナノ粒子、タンニン酸</td><td>ナノコンポジックス</td><td>カスタマイズ注文</td><td>表面調製</td></tr><tr><td>Atto647N NHS エステル</td><td>シグマ</td><td>18373-1MG-F</td><td>蛍光色素、オリゴ調製</td></tr><tr><td>Attofluor Cell Chamber, for microscopy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A7816</td><td>imaging</td></tr><tr><td>BD Syringes only with Luer-Lok</td><td>BD bioscience</td><td>309657</td><td>cells</td></tr><tr><td>biotinylated anti-mouse CD3e</td><td>ebioscience</td><td>13-0031-82</td><td>抗体/リガンド</td></tr><tr><td>ビオチン化pMHCオボアルブミン (SIINFEKL)</td><td>NIH Tetramer Core Facility at Emory University</td><td>NA</td><td>抗体/リガンド</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>シグマ</td><td>735078001</td><td>ブロック 非特異的相互作用</td></tr><tr><td>セルストレーナー</td><td>Biologix</td><td>15-1100</td><td>細胞</td></tr><tr><td>カバースリップ ミニラック、テフロン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>C14784</td><td>表面調製</td></tr><tr><td>Cy3B NHS エステル</td><td>GE</td><td>ヘルスケア PA63101</td><td>蛍光色素、オリゴ調製</td></tr><tr><td>ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)</td><td>コーニング</td><td>21-031-CM</td><td>緩衝</td></tr><tr><td>エタノール</td>シ<td>グマ</td><td>459836</td><td>表面調製</td></tr><tr><td>ハンクSigma</td><td></td> <td>H8264</td><td>バッファー</td></tr><tr><td>過酸化水素</td><td>Sigma</td><td>H1009</td><td>表面調製</td></tr><tr><td>LA-PEG-SC</td><td>Biochempeg</td><td>HE039023-3.4K</td><td>表面調製</td></tr><tr><td>Midi MACS (LS) スタートアップキット</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-301</td><td>細胞</td></tr><tr><td>マウス CD8+ T 細胞分離キット</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-104-075</td><td>細胞</td></tr><tr><td>Nanosep MF遠心装置</td><td>ポール研究所</td><td></td><td>ODM02C35 オリゴ調製</td></tr><tr><td>No.2 丸いガラスカバースリップ</td><td>VWR</td><td>48382-085</td><td>表面調製</td></tr><tr><td>NTA-SAM</td><td>同人堂 分子技術</td><td>N475-10</td><td>表面調製</td></tr><tr><td>P2ゲル</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1504118</td><td>オリゴ調製</td></tr><tr><td>スフリン酸</td><td>EMD ミリポアコーポレーション</td><td>SX1244-6</td><td>表面調製</td></tr><tr><td>Sulfo-NHS acetate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26777</td><td>表面調製</td></tr><tr><td><強>装置</強></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AgilentAdvanceBio オリゴヌクレオチド C18 カラム、4.6 x 150 mm、2.7 &mu;m</td><td>653950-702</td><td></td><td>オリゴヌクレオチド調製</td></tr><tr><td>Barnsteadナノ純水精製システム</td><td>サーモフィッシャー</td><td></td><td>水</td></tr><tr><td>CFI Apo 100&times;NA 1.49 対物</td><td>ニコン</td><td></td><td>顕微鏡</td></tr><tr><td>Cy5 cube</td><td>CHROMA</td><td></td><td>顕微鏡</td></tr><tr><td>進化 電子増量電荷結合素子 (EMCCD)</td><td>フォトメトリクス</td><td></td><td>顕微鏡</td></tr><tr><td>高速液体クロマトグラフィー</td><td>Agilent 1100</td><td></td><td>オリゴヌクレオチド調製</td></tr><tr><td>Intensilight 落射蛍光源</td><td>ニコン</td><td></td><td>顕微鏡</td></tr><tr><td>マトリックス支援レーザー脱離・イオン化飛行時間型質量分析計(MALDI-TOF-MS)</td><td>ボイジャー STR</td><td></td><td>オリゴヌクレオチド調製</td></tr><tr><td>ナノドロップ2000 紫外可視分光光度計</td><td>サーモフィッシャー</td><td></td><td>オリゴヌクレオチド調製</td></tr><tr><td>ニコンエクリプス Ti倒立顕微鏡</td><td>ニコン</td><td></td><td>顕微鏡</td></tr><tr><td>ニコンパーフェクトフォーカスシステム</td><td>ニコン</td><td></td><td>顕微鏡</td></tr><tr><td>NIS Elementsソフトウェア</td><td>ニコン</td><td></td><td>顕微鏡</td></tr><tr><td>クワッドバンド TIRF 405/488/561/647 cube</td><td>CHROMA</td><td></td><td>顕微鏡</td></tr><tr><td>RICM cube</td><td>CHROMA</td><td></td><td>顕微鏡</td></tr><tr><td>488 nm(50 mW)、561 nm(50 mW)、640 nm</td>の<td>コヒーレント</td><td></td><td>顕微鏡</td></tr><tr><td>TRITC cube</td><td>CHROMA</td><td></td><td>顕微鏡</td></tr><tr><td><ストロング>オリゴ名</ストロング></td><td><ストロング>5 '修飾/3 '修飾</ストロング></td><td><ストロング>シーケンス(5 '〜3 ')</ストロング></td><td><ストロング>使用</ストロング</td></tr><tr><td>>15merアミンロッキングストランド</td><td><ストロング>5 '修飾:</ストロング>モディフィケーションなし <ストロング>3 '修飾: /3AmMO/</td><td>AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA</td><td>ロック リアルタイム テンション シグナル</td></tr><tr><td>15mer Atto647N ロッキング ストランド</td><td>5' モディフィケーション:</ストロング> Atto647N 3' モディフィケーション: /3AmMO/</td><td>AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA</td><td>ロッキング リアルタイム テンション シグナル</td></tr><tr><td>15mer ノンフルオレッセント ロッキング ストランド</td><td>5' 変更: 変更なし 3' 変更: 変更なし</td><td>A AAA AAC ATT TAT AC</td><td>定量分析用のリアルタイム張力信号ロック</td></tr><tr><td>4.7 pN ヘアピンストランド</td><td>5' 変更: 変更なし 3' 変更: 修飾なし</td><td>GTGAAATACCGCAGATGCGT TTGTATAAATGTTTTTTTTTCATTTATat ACTTTAAGAGCGCCACGTAGCC CAGC</td><td>ヘアピンプローブ</td></tr><tr><td>アミンリガンド鎖</td><td>5' 修飾: /5AmMC6/ 3' 修飾: /3Bio/</td><td>CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT</td><td>ヘアピンプローブ</td></tr><tr><td>BHQ2 アンカーストランド</td><td>5' 修飾: /5ThiolMC6-D/ 3' 修飾: /3BHQ_2/</td><td>TTTGCTGGGCTACGTGGCGCTCTT</td><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;ヘアピンプローブ</td></tr><tr><td>Cy3B リガンドストランド</td><td>5' 修飾: Cy3B 3' 修飾: /3Bio/</td><td>CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT</td><td>ヘアピンプローブ</td></tr><tr><td>ストランドのロック解除</td><td>5' 修飾: 修飾なし 3' 修飾:</ストロング>修正なし</td><td>タグタグGTAGGTTAATGTTTTTTc</td>累積<td>張力信号のロックを解除</td></tr></tbody></table>します

免疫細胞による一過性ピコニュートン受容体力をマッピングするためのdna張力プローブ

DNA Tension Probes to Map the Transient Piconewton Receptor Forces by Immune Cells

隣接する2つの細胞間の接合部および細胞と細胞外マトリックス間の接合部で伝達される機械的な力は、発生から免疫学に至るまでの多くのプロセスを調節するために重要です。したがって、分子スケールでこれらの力を研究するためのツールを開発することが重要です。私たちのグループは、細胞によって生成され、特定のリガンドに伝達される力を定量化および視覚化するための一連の分子張力センサーを開発しました。最も感度の高いクラスの分子張力センサーは、核酸ステムループヘアピンで構成されています。これらのセンサーは、蛍光色素と消光物質のペアを使用して、力によるDNAヘアピンの機械的伸長と展開について報告します。DNAヘアピン張力センサーの課題の1つは、張力の終了時にヘアピンが急速に折りたたまれて可逆的であるため、過渡力を記録するのが難しいことです。本稿では、機械的情報の「保存」を可能にするために「ロック」して折り畳みを防止できるDNA張力センサーを準備するためのプロトコルについて説明します。これにより、非常に過渡的なピコネウトン力の記録が可能になり、ロックを除去する相補的核酸を添加することで、その後「消去」することができます。リアルタイムの張力マッピングと機械的情報保存を切り替えるこの能力は、T細胞が免疫機能の一部として一般的に使用する、弱く、短命で、存在量の少ない力を明らかにします。

代表的な表面品質管理画像を示します(図4)。高品質の表面は、RICMチャネルでクリーンなバックグラウンドを持ち(図4B)、Cy3Bチャネルで均一な蛍光強度を持つ必要があります(図4C)。同じイメージング機器と同一の蛍光イメージング取得条件では、DNAプローブで実験を行う場合、バックグラウンド蛍光強度は毎回一貫して再現性があるはずです。個々の実験の各セットの前に、表面品質管理のマーカーとして使用することをお勧めします。
この論文では、ニワトリオボアルブミンを特異的に認識するOT-1ナイーブCD8+細胞をモデル細胞型とする代表的なデータ(図5)を示します。CD3ε抗体はシステムのポジティブコントロールとして含まれており、同族抗原pMHC N4(SIINFEKL)が例として使用されています。細胞を、抗CD3εまたはpMHC N4の...

この論文では、DNAベースのテンションプローブを使用して免疫細胞によって加えられる受容体力を画像化するための詳細なプロトコルについて説明します。このアプローチは、受容体の力>4.7pNをリアルタイムでマッピングし、時間の経過とともに力を積分することができます。

免疫細胞による一過性ピコニュートン受容体力をマッピングするためのDNA張力プローブ

Mechanical forces transmitted at the junction between two neighboring cells and at the junction between cells and the extracellular matrix are critical ...

このプロトコルは、細胞、特に免疫細胞によって生成される分子力をマッピングする方法を提供します。このプロトコルは、メカノバイオロジーにおけるメカノトランスダクションの研究に関心のあるラボにとって重要です。この技術の主な利点は、非常に簡単で、従来の蛍光顕微鏡を使用して不死化細胞および初代細胞における力伝達を定量化できることです。まず、25ミリメートルのカバーガラスを50ミリリットルのビーカーのポリテトラフルオロエチレンラックに置き、カバーガラスを水に浸して3回すすぎます。等量のエタノールと水を混合し、ラックとカバーガラスを含むビーカーにこの溶液40ミリリットルを加えます。次に、パラフィルムテープを使用してビーカーを密封します。超音波洗浄機で15分間ビーカーを超音波処理してカバーガラスを洗浄し、超音波処理後に液体を廃棄します。次に、ラックとカバーガラスを含むビーカーを水で少なくとも6回すすぎ、残っている有機溶剤を取り除きます。新鮮なピラニア溶液を調製するには、50ミリリットルのビーカーに30ミリリットルの硫酸を加え、10ミリリットルの過酸化水素をゆっくりと加えます。ガラスピペットの端を使用してピラニア溶液を静かに混合します。エッチングを開始するには、カバーガラスを保持しているラックをピラニア溶液の入ったビーカーに移し、室温で30分間インキュベートしてカバーガラスをクレンジングしてヒドロキシル化します。次に、スチールまたはポリテトラフルオロエチレンピンセットを使用してラックを清潔な50ミリリットルのビーカーに移し、水で6回すすぎます。水を完全に除去するには、カバーガラスを保持しているラックを40ミリリットルのエタノールを入れた50ミリリットルのビーカーに浸します。その後、エタノールを廃棄する。次に、ラックを3%アミノプロピルトリエトキシシランを含むエタノール40ミリリットルに室温で1時間浸し、カバーガラス上のヒドロキシル基との反応を開始します。カバーガラスの表面を40ミリリットルのエタノールに浸して6回すすぎ、摂氏80度のオーブンで20分間乾燥させます。カバーガラスがペトリ皿の内側に滑り込まないように、ペトリ皿の内側の底をパラフィルムテープで覆います。次に、アミンで覆われたカバーガラスを、DNA張力プローブで機能化する側を上に向けて配置します。将来の使用のために摂氏20度でカバーガラスを覆います。カバーガラス上のアミン基を変更するには、リポ酸PEG NHSおよびmPEG NHSを追加し、ペトリ皿を室温で1時間インキュベートします。インキュベーションの終わりに、表面を水で3回すすいでください。その後、1ミリリットルのスルホ-NHS-アセテート1ミリグラムを含む100マイクロリットルの0.1モル重炭酸ナトリウムをサンドイッチカバースリップのセットに加え、不動態化が起こる

dna-tension-probes-to-map-transient-piconewton-receptor-forces-immune

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

我々は、グローバルまたはローカライズされたひずみ申込みに応じて、単一の、生きている付着細胞で誘導核と細胞骨格の変形を測定するために二つの独立した、顕微鏡ベースのツールを紹介。これらの技術は、核の剛性を（すなわち、変形能）を決定すると、核と細胞骨格との間の細胞内力伝達を調べるために使用されます。...

相間細胞核の力学特性を探査する生物物理学的なアッセイ：基板の歪みのアプリケーションおよびマイクロニードル操作

このビデオでは、生体膜力プローブ(BFP)を使用して、受容体とリガンド間の力を測定しています。この手法では、プローブビーズ上に結合したpMHCと標的細胞上のTCRとの間の結合を切断するために必要な圧力をモニタリングすることにより、相互作用を検出することができます。...

受容体-リガンド相互作用を定量するための生体膜力プローブ

このビデオは、ポリエチレングリコールアンカー金ナノ粒子とDNAヘアピンテンションプローブを使用して、免疫細胞によって加えられる受容体力を評価する方法を示しています。CD8陽性T細胞の相互作用は、プローブのアンフォールディングをトリガーし、蛍光を発しながら、鎖をロックしてシグナルを維持し、免疫細胞が加える力を定量化します。...

DNAベースのテンションプローブを使用して、免疫細胞によって加えられる受容体の力を評価する

我々は部分的に軸索の膜に付着した光学的に捕捉されたプローブで行わ同時力分光測定によってレーザーディセクタで損傷された軸索の緊張放出を測定した。開発された実験プロトコルは、培養基板に軸索の接着性を評価します。...

ピコニュートンとミリ秒の分解能で基板への軸索の接着性を評価するために、レーザー誘起軸索病変の間にテンションリリースの測定

私たちは、単一のTリンパ球におけるカルシウムシグナル伝達のリアルタイムイメージングと、力制御された単一の受容体-リガンド結合速度の測定を同時に行うための技術について説明します。...

蛍光生体膜フォースプローブ：単一細胞上の受容体 - リガンド速度論の同時定量との結合によって誘導される細胞内シグナル伝達

最近、多くのFRETベースの力のバイオセンサーが開発され、細胞内力のタンパク質特異的な解決が可能になりました。このプロトコルでは、核骨格-細胞骨格(LINC)複合体タンパク質Nesprin-2Gのリンカー用に設計されたこれらのセンサーの1つを使用して、核LINC複合体に対するアクトミオシン力を測定する方法を示します。...

原子力LINCコンプレックス全体に機械的な力を測定するために、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）-forceのバイオセンサーを使用するためのプロトコル

このプロトコルでは生きている細胞の核に直接制御力を適用するマイクロ...

核と細胞骨格との間の機械的統合を測定するための直接力プローブ

ここでは、プロトコルを提案フェルスター共鳴の同時使用のため力感受性の測定を有効にするタンパク質ダイナミクスを測定するため退色後蛋白質負荷と蛍光の回復を測定するエネルギー転送ベースのテンション...

蛍光技術の組み合わせを用いた生細胞内力感受性タンパク質ダイナミクスの測定

インテグリンの緊張は、様々 な細胞機能に重要な役割を果たしています。統合テンション センサーとインテグリンの緊張はピコニュートン (pN)...

イメージング インテグリン張力と細胞の力でサブミクロン解像度統合テンション センサーで

この定義されたプロトコルは、 in...

ヒト好中球細胞外トラップ放出のリアルタイムハイスループット顕微鏡定量とアンタゴニストの薬理学の評価

この方法では、リガンドを提示する固定化されたDNA二本鎖を切断する細胞の傾向を測定して、相対的な細胞牽引力を報告します。破裂した蛍光オリゴを細胞内に送達し、フローサイトメトリーで解析して、細胞の機械的履歴を記録します。これにより、細胞メカノフェノタイピングの文脈で細胞力発生のハイスループット測定が可能になります。...

DNAテンションプローブの細胞内破壊と送達に基づく細胞メカノタイプのハイスループットフローサイトメトリー測定

学ぶDNA張力プローブを用いた免疫細胞の一過性ピコニュートン受容体力マッピング法。蛍光顕微鏡で可視化・定量化し、ロック機構により短寿命の力イベントを記録・解析できる。

免疫細胞による一過性ピコニュートン受容体力をマッピングするためのDNA張力プローブ

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