極低温電子断層撮影の最適化戦略
March 19th, 2021
極低温電子断層撮影における大規模なデータ収集の需要の高まりには、高スループット画像取得ルーチンが必要です。ここでは、断層データ収集の時間効率とスループットを最大化することを目的とした高度な取得戦略の最近の開発を実装するプロトコルを説明します。
大規模なデータ収集セッションの設定は、チルトシリーズの取得に使用できる残りの顕微鏡時間を大幅に短縮できる時間のかかる手順です。この方法により、大規模な自動断層撮影データ取得を迅速に設定し、収集対象の慎重な選択を必要とする断層撮影実験の時間効率を最大化できます。ダミーの SerialEM インスタンスを開くことから始めます。
最初のグリッドの正方形がマップされたら、SerialEM ナビゲーターメニューオプションのマージを使用して、ダミーの SerialEM インスタンスのモンタージュを表示します。ナビゲーターウィンドウをダブルクリックして、グリッドの正方形マップを開きます。マップを検索し、ダミーの SerialEM ナビゲーターオプションを使用して、対象のターゲットに画像取得ポイントを追加します。
新しい正方形をマッピングした後、ナビゲーターファイルを保存し、ナビゲーターを再度マージします。すべてのグリッドの正方形がマップされるまで続けます。ここでも、ナビゲーターファイルをダミーの SerialEM インスタンスとマージします。
ダミーのシリアルEMメニューからPi EM仮想マップスクリプトを実行します。ツールを選択し、仮想アンカー マップを選択します。グリッドの正方形マップのサイズと量、ビューマップとプレビュー マップのビニングによっては、時間がかかる場合があります。
顕微鏡の性能を正しく行うために、同じ倍率とビームサイズを使用してデータを取得します。CTF.挿入し、客観的な絞りを中心にして、シリアルEMの昏睡のないアライメントを実行します。
CTFとGIFクイックチューンによってシリアルEM正しい乱視を実行します。SerialEM で、新しいナビゲーターファイルを開きます。すべての A ポイントを選択解除します。
最初のビュー マップを選択します。折りたたみを選択します。A を 2 回クリックし、折りたたみを解除します。
最初のビュー マップの位置を選択します。Shift T キーを押してから、最後のビュー マップ位置を選択して、Shift T をもう一度押します。ファイルのプロパティで単一フレームイメージを選択してダイアログを開きます。
次のファイルプロパティダイアログで、イメージングのニーズと計測器の設定に応じて、必要なパラメータを選択します。プロンプトが表示されたら、番号を付けて名前を付け、保存をクリックします。最初の TS 位置に傾斜シリーズ コントローラを設定します。
完了したら、[OK]をクリックして、この取得項目の後のすべてのチルトシリーズにこれらのパラメータを設定します。すべてのプレビュー マップが TS として選択され、ファイル名が番号付きになりました。必要に応じて、各ターゲットのフォーカス/トラック距離を設定します。
ビュー マップをダブルクリックしてロードします。ナビゲーターリストでプレビューマップを選択します。次に、ナビゲーターウィンドウで「フォーカスの編集」を選択します。
低線量のコントロールパネルでは、領域間軸を選択解除して、試験を位置決めし、ステージの傾き軸に沿って焦点を合わせます。ロードされたビュー マップの目的の領域をクリックして、この傾斜シリーズのフォーカストライアル位置を設定し、ナビゲーターアイテムに TSP が設定されていることを確認します。すべての項目に対して手順を繰り返します。
各チルトシリーズの前に実行されるスクリプトPreTomoのフォーカス範囲を編集します。SerialEMチルトシリーズメニューで、TSでスクリプトを実行し、各チルト中に使用中のスクリプトのスクリプト番号を選択します。窒素タンクのレベルと、オートローダーターボが選択されているかどうかを確認します。
データストレージの空き容量を確認してください。SerialEM ファイルメニューで、ログファイルの連続保存を選択解除します。各チルトシリーズは、独自のログファイルを取得します。
ナビゲーションメニューの項目で取得をクリックした後、スクリプトPreTomoを実行します。主タスク取得チルトシリーズを選択し、PostTomoの後にスクリプトを実行を選択します。最後に列のバルブを閉じるを選択し、最後に電子メールを送信し、その後、移動をクリックします。
71の適当な正方形が、より低い倍率でグリッドマップ上で選択された。中位拡大マップは、直接視覚化し、関心のあるサンプルの同定を可能にする設定で取得されました, この場合のコロナウイルス.取得時間は1平方あたり3分、合計で3時間45分であった。
最初の正方形マップが作成されると、ダミーの SerialEM インスタンスを別のコンピュータで開き、正方形マップを視覚化し、傾斜系列の取得に適したターゲットにポイントを追加しました。SerialEM低線量が設定され、参照ビューとプレビュー画像が撮影され、マップとして保存されました。後者のマップは、ダミーの SerialEM インスタンスですぐに使用され、対応する正方形のマップ イメージから仮想ビューと仮想プレビューを生成できます。
仮想ビュー マップは、ターゲットの初期センタリングに使用され、その後、仮想プレビュー マップを使用して実際の傾斜系列取得倍率で最終的なセンタリングが実行されました。ユーザーは、サンプルの風景を探索するのに十分な時間を与える必要があります。いくつかのマップを検索した後、データを収集するための良質な領域のためのより良い感触を開発します。
概要
この記事では、大規模データ収集の必要に対応して、冷凍電子トモグラフィーの効率性を向上させるために設計されたプロトコルを提示します。この方法は、傾斜シリーズ撮影中の高いスループットを確保するために撮像セットアップを最適化することにより、顕微鏡の利用率を大幅に向上させます。
主要な研究要素
研究分野
- 冷凍電子トモグラフィー
- 高スループット画像取得
- 顕微鏡技術
背景
- 大規模データ収集の需要の増加
- 時間のかかるセットアップは効果的な顕微鏡時間の制限になる可能性があります
- 効率的なトモグラフィックデータ収集方法の重要性
使用した方法
- 自動トモグラフィデータ取得プロトコル
- グリッドスクエアマッピングのナビゲーションのためのSerialEMの利用
- ターゲットセンタリングのための仮想マップの実装
主な結果
- データ取得のために71のグリッドスクエアが特定されました
- 合計取得時間3時間45分の効率的なデータ収集
- コロナウイルスサンプルを効果的に可視化する能力が実証されました
結論
- この研究は、トモグラフィーにおける高スループットイメージングへの合理化されたアプローチを示しています
- 結果は、生物学研究における取得効率の最大化の重要性を強調しています
よくある質問
Executive Industry Relevance
Efficient cryogenic electron tomography (cryoET) data acquisition is critical for high-resolution structural biology, enabling rapid and reproducible 3D analysis of macromolecular complexes. Automated workflows using SerialEM and PyEM streamline grid mapping and target selection, maximizing microscope utilization and reducing operational bottlenecks. These advances directly impact early discovery and structural validation pipelines in biopharma R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Accelerates structural interrogation of biological assemblies in near-native states.
- Supports functional target validation by enabling high-throughput acquisition of tilt series.
- Improves predictive confidence in macromolecular complex analysis for portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Enables preparation of validated 3D structural datasets for downstream screening workflows.
- Standardizes acquisition routines, enhancing reproducibility and quantitative output quality.
- Facilitates scalable, automated data collection for reliable compound evaluation platforms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns structural data acquisition with disease-relevant systems, such as viral particles.
- Ensures continuity from discovery-stage imaging to preclinical structural validation.
- Reduces risk in translational research by supporting robust, high-throughput data generation.
Pipeline & Workflow Integration
This automated cryoET workflow integrates from early discovery through lead identification and preclinical research, supporting structural hypothesis testing and target de-risking.
- Discovery Biology: Enables rapid hypothesis testing and pathway clarification via high-resolution 3D imaging.
- Screening: Provides reproducible, quantitative tilt series datasets for assay readiness.
- Analytics: Delivers standardized measurements and readouts for comparative structural analysis.
- Translational Research: Supports biomarker alignment and preclinical continuity when imaging disease-relevant complexes.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, reusable platform for automated tomography data acquisition across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in structural studies.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and throughput of data acquisition sessions.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by maximizing instrument time.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of structurally validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryoEM instrumentation and data analysis software.
- Depends on access to high-end transmission electron microscopes and computational infrastructure.
- Demands cross-team standardization of acquisition parameters and data management practices.
- May require adaptation for different sample types or grid formats.
- Operational limitations include manual input for initial target selection and quality assessment.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:38
Selecting the Targets
1:31
Generate Virtual Maps
2:07
Microscope Tuning
2:43
Set up Navigator
4:05
Set the Focus/Track Positions
5:00
Set up Additional Scripts
5:27
Run
6:19
Results: Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition
7:46
Conclusion
