ヒト多能性幹細胞からの血原性内皮細胞の指向性分化
2021年3月31日
ここに提示されるのは、約1週間でヒト多能性幹細胞から血原性内皮細胞を指向的に分化させるための簡単なプロトコルです。
このプロトコルは、ヒト血原性内皮細胞の十分に特徴付けられた集団を生成する方法を詳述する。これらの細胞は、分子調節および内皮から造血への移行を研究するために利用することができる。まず、ヒト胚性幹細胞を4日間培養し、始原内皮細胞に分化させます。
5日目に、細胞の上に培地を吸引します。次に、ウェルあたり1ミリリットルのDMEM / F-12で細胞を穏やかに洗浄します。ウェルあたり1ミリリットルの新たに調製した血原性内皮細胞分化培地を加え、摂氏37度および5%二酸化炭素で24時間細胞をインキュベートします。
6日目および7日目に、細胞の上の培地をウェルあたり1ミリリットルの新たに調製した均質な内皮細胞分化培地と交換し、細胞をさらに24時間インキュベートします。8日目。細胞を剥離して洗浄した後、氷上の微量遠心チューブに均等に分割し、それぞれが1ミリリットルあたり10〜5番目の細胞の1倍の密度で最低600マイクロリットルの細胞を含みます。
必要に応じて細胞を含むチューブに抗体を加え、光から保護された氷上で30分間インキュベートします。1000倍Gおよび摂氏4度で5分間遠心分離することにより、細胞をペレット化します。上清を除去し、ペレットを600マイクロリットルの氷冷選別バッファーに再懸濁します。
5ミリリットルのFACSチューブのメッシュフィルターキャップを通してサンプルを濾し、光から保護された氷上に細胞を保存して、細胞を即座に選別します。FACSによって血原性内皮細胞を単離するには、まずCD45陰性細胞集団をゲートする。次にCD45陰性集団内で、CD31陽性細胞をゲートする。
次にCD31陽性集団内で、VEカドヘリン陰性細胞集団のためのゲート。そして、VEカドヘリン陰性集団内で、c-Kit陽性細胞のゲート。c-Kit陽性集団から、CD34陽性細胞集団をゲートする。
そして最後にCD34陽性細胞集団から、KDR陽性細胞を同定・採取する。造血前駆細胞の増殖のために処方されたメチルセルロースベースの培地に血原性内皮細胞を播種した後、コロニー形成ユニット-赤血球コロニー、およびいもち病形成ユニット-赤血球コロニーを8日目にカウントします。コロニー形成ユニット-顆粒球-マクロファージおよびコロニー形成ユニット-顆粒球、赤血球、マクロファージ、およびメガカリオサイト。
多能性造血前駆細胞コロニーは14日目にカウントされます。播種された1000個の血原性内皮細胞当たり、約20個のコロニー形成単位が生成される。内皮細胞形態を有する細胞も培養物中に見える。
これらは、単一細胞レベルで多系列造血前駆細胞を生じさせる血原性内皮細胞です。このプロトコルは、約1週間でヒト血原性内皮細胞を作製できる2D血清およびマウスフィーダーフリー培養システムです。
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概要
本記事では、ヒト胚性幹細胞から約1週間で造血内皮細胞を誘導するための詳細なプロトコルを紹介します。この手法により、内皮造血転換の研究に不可欠であり、再生医療や血液製剤の製造への応用が期待される、十分に特性解析された細胞集団を生成することが可能になります。
研究の主要構成要素
科学分野
- 幹細胞生物学
- 血管生物学
- 造血
- 組織工学
背景
- 血管は組織の機能に不可欠であり、血管内皮細胞によって裏打ちされています。
- 造血内皮細胞は、発生過程において造血幹細胞および前駆細胞を生じさせる特殊なサブタイプです。
- これらの細胞をin vitroで生成することは、血液細胞の発達の研究や潜在的な治療への応用のために有用です。
- 既存の内皮細胞誘導プロトコルでは、ヒト幹細胞から十分に特性解析された造血内皮細胞を得ることはできていません。
研究目的
- ヒト胚性幹細胞から造血内皮細胞を生成するための再現性のあるプロトコルを確立すること。
- in vitroにおける分子調節および内皮細胞から造血細胞への転換（endothelial-to-hematopoietic transition）の研究を可能にすること。
- 後続のアプリケーションに適した、フィーダーフリーかつ無血清のシステムを提供すること。
使用方法
- ヒト胚性幹細胞の培養および8日間にわたる段階的な分化。
- 特定の成長因子および低分子化合物（例：GSK3β阻害剤、bFGF、BMP4、VEGF-A、レチノイン酸）を用いた中胚葉および内皮系への誘導。
- 表面マーカー（CD45-、CD31+、VE-cadherin-、c-Kit+、CD34+、KDR+）に基づく造血内皮細胞の連続的なゲーティングおよび単離のためのフローサイトメトリー（FACS）。
- 造血能を評価するためのメチルセルロースベース培地におけるコロニー形成アッセイによる機能評価。
主な結果
- 本プロトコルにより、1週間以内に定義された造血内皮細胞集団が得られます。
- 造血内皮細胞1000個あたり約20個のコロニー形成単位が生成され、強力な造血能が示されます。
- 赤芽球系および多能性造血前駆細胞の両方のコロニーが観察されます。
- 培養中に内皮細胞の形態が維持されており、細胞の同一性が確認されます。
結論
- このフィーダーフリーかつ無血清のプロトコルにより、胚性幹細胞からヒト造血内皮細胞を効率的に作製できます。
- 本手法は、内皮細胞から造血細胞への転換およびその分子調節に関するin vitro研究を促進します。
- 本手法は、潜在的なex vivo血液製剤作製のプラットフォームを提供し、ヒトドナーへの依存を低減させます。
よくある質問
産業上の重要性
ヒト多能性幹細胞から造血内皮細胞への指向性分化は、造血発達のモデリングおよび血液系譜のex vivoでの生成における重大なボトルネックを解消します。この手法により、内皮造血転換のメカニズム的なリスク低減が可能となり、初期段階の細胞治療や再生医療パイプラインにおける予測精度への信頼性が向上します。本プロトコルのフィーダーフリーかつ無血清の設計は、企業のR&Dポートフォリオにおける再現性とスケーラビリティを向上させます。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期創薬およびターゲットバリデーション
- 内皮細胞から造血細胞への転換を制御する分子経路の解析を可能にします。
- 血球系の分化決定に影響を与える因子の機能的なターゲット検証をサポートします。
- 造血開発における候補ターゲットの予測的なリスク低減を促進します。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 下流の機能解析のために、標準化され十分に特性解析された細胞集団を提供する。
- 定義された前駆細胞からの造血コロニー形成の定量的な評価を可能にする。
- 内皮細胞または造血細胞への分化運命に影響を与える調節因子の再現性のあるスクリーニングをサポートする。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 疾患に関連する造血欠損をin vitroでモデル化するためのプラットフォームを構築します。
- 血球生成戦略の発見から前臨床検証までの連続性を可能にします。
- リスク調整された細胞ベースの治療概念の進展を支援します。
パイプラインおよびワークフローの統合
本プロトコルは、メカニズム研究および機能解析に向けた造血内皮細胞の堅牢な生成と単離を可能にすることで、発見から前臨床に至る一連の研究プロセスへと統合されます。
- 探索生物学：血液細胞系の出現における分子調節に関する仮説検証をサポートします。
- スクリーニング：比較分析に適した、再現性のある定量的なコロニー形成出力を提供します。
- 分析：客観的な読み取りのために、フローサイトメトリーに基づくゲーティングとコロニー定量化を提供します。
- トランスレーショナルリサーチ：in vitroモデリングと造血能の前臨床評価を橋渡しします。
- エンタープライズ利用：さまざまな幹細胞株や疾患モデルに適応可能な、スケールアップ可能なフィーダーフリーシステムを提供します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：造血系リネージモデリングおよびターゲットバリデーションにおける予測信頼性を向上させます。
- 運用的価値：細胞分化ワークフローの標準化、再現性、および拡張性を高めます。
- 戦略的価値：細胞治療および再生医療プログラムにおけるGo/No-Go判断を改善します。
- ポートフォリオへの影響：初期段階の細胞ベース治療候補剤のリスク調整済み優先順位付けを可能にします。
実施上の注意点
- ヒト多能性幹細胞の培養および分化プロトコルの専門知識が必要です。
- マルチパラメーター細胞分取用のフローサイトメトリー装置へのアクセスが不可欠です。
- ゲーティング戦略およびコロニー定量化におけるチーム間の標準化が必要です。
- プロトコルの最適化により、さまざまなヒト幹細胞株に適応可能です。
- 検証済みの抗体パネルおよびメチルセルロースベースの機能解析に依存します。
