Name: ヒト多能性幹細胞からの血原性内皮細胞の指向性分化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 23 s
Description: 学ぶ、ヒト胚性幹細胞から血原性内皮細胞を誘導分化させる方法。FACSによる表面マーカー分離とコロニー形成アッセイで造血能を評価し、血管から造血への遷移を研究する。再生医療への応用も期待される。

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著者は開示するものは何もありません。

本明細書では、マウスフィーダーおよび無血清2D培養システム(図1)を用いて、約1週間でヒト胚性幹細胞から血原性内皮細胞を作製するステップを概説する。このプロトコルは、Sriramら(2015)によって記述された方法を拡張して、原始EC38を取得します。CD31+ CD45-ECの原始的な性質と仕様の可能性は、これらの細胞をDLL4コーティングプレート上で培養し、動脈仕様と一致する遺伝子発現変化を観察することによって実証されます(図3)。さらに、動脈同一性の獲得は後期G1細胞周期停止と関連しており(図3)、これは以前の研究と一致しています27。0.5 μM RA、25 ng/mL BMP4、および50 ng/mL VEGF-Aの存在下でさらに3日間始始ECを培養した後、CFU赤血球、BFU赤血球、CFU顆粒球/マクロファージ...

内皮細胞(EC)は、人体全体および操作された組織で複数の機能を果たす細胞の不均一な集団です。これらの機能には、他の細胞型(心筋細胞1、骨芽細胞2)をサポートおよび調節することに加えて、血液と組織の間に選択的バリアを形成し、組織形成を支援することが含まれます3。正常な発達中の成熟ECの分化には、多様なシグナル伝達経路が必要です。原始ECは中胚葉前駆細胞に由来し、成熟した動脈、静脈、毛細血管、リンパの表現型4に向けて指定されます。さらに、胚性卵黄嚢および胚性大動脈-生殖腺-中腎(AGM)領域のECの小さなサブセットも、胎児の肝臓と胎児の骨髄に移動する造血幹および前駆細胞(HSPC)を生じさせ、そこで出生後に留まり、生涯を通じてすべての血球タイプを生成します4。多様なEC表現型は、すべての組織の発生と維持に不可欠です。
したがって、ECとその誘導体は、ヒトの発生および/または疾患のモデル化およびメカニズムの解明、ならびに再生医療および組織工学の応用を目的とした研究の重要な要素です5,6,7,8。ただし、これらのタイプの研究の主な制限は、必要な量で主要なヒトECが利用できないことです。治療用途の大部分には、最低3 x 108 ECが必要になると推定されています6。この問題を解決するために、ヒト胚性幹細胞(hESC)およびヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)は、それらの多様な系統の可能性および多数の子孫を生成する能力のために提案されている6,9。
実際、hESCまたはhiPS細胞に由来する細胞の有用性は、疾患モデリングおよび薬物スクリーニングに焦点を当てた複数の研究で実証されている10、11、12。Organ-on-a-Chip(OOC)技術は、細胞や組織を3次元の足場に統合することにより、人体の生理機能をより忠実に再現するために使用されてきました。さらに、複数の個々のOOC(いわゆるボディオンチップまたはヒューマンオンチップ、BOC / HOC)の接続は、マイクロフルイディクスを介して達成でき、関心のある器官間のクロストークを可能にします13、14、15。血管系などの支持組織は、OOCおよびBOC / HOCの重要な要素です。血管系を組み込むことは、組織全体にわたる栄養素、酸素、およびパラクリン因子の輸送を可能にし、それによって必要な組織特異的微小環境を促進する3,12。したがって、動脈、静脈、リンパ、および血発生ECなどの成熟ヒトECを導出する方法は、これらの組織工学的アプローチを前進させるために不可欠です。
hESCまたはhiPS細胞からヒト始原性または前駆細胞ECを誘導するためのステップを詳述した複数のプロトコルが公開されている5、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26.これらのプロトコルの多くは、ESC/iPS細胞と間質細胞のマウスフィーダー層との胚様体(EB)形成または共培養に依存しています。これらの戦略は、EC収率が低く、および/またはマウス細胞によるヒトECの汚染により、困難で時間がかかる傾向があります。間質細胞を使用せずに2D培養に厳密に依存するプロトコルは、多くの場合、長い誘導を必要とし、誘導のために成長因子および/または阻害剤の複雑な組み合わせを利用し、細胞分離後の拡張期間が長くなる、またはこれらの因子の組み合わせを有する。in vivoでの成熟ECタイプの導出に関与するシグナル伝達経路および因子に関する知識の進歩は、簡単で堅牢なin vitro分化プロトコルの基礎を提供します。
以前は、発生中のマウス動脈および血原性ECの仕様におけるNotchおよびレチノイン酸(RA)シグナル伝達経路の重要な役割がそれぞれ特定されていました。Notchシグナル伝達経路は、動脈EC表現型の仕様と維持において複数の役割を果たします。マウス網膜血管新生モデルを用いた研究では、流体せん断応力がNotch-Cx37-p27シグナル伝達軸を誘導し、G1細胞周期停止を促進する経路が同定され、動脈EC仕様27が可能になりました。細胞周期の状態は、細胞が遺伝子発現および表現型の変化を誘発することができる特定のシグナルを受け入れる明確な機会の窓を提供することによって、細胞の運命決定において役割を果たすと仮定されている28。このNotchを介したG1停止により、エフリンB2、Cx40、DLL4、Notch1、およびNotch 4などの動脈ECに富む遺伝子の発現が可能になりました(29,30でレビュー)。また、血原性EC仕様は、RAシグナル伝達を介してインビボで促進されることも示されている31,32。追加の研究では、RAシグナル伝達の下流で、c-KitとNotchの発現がp27をアップレギュレートし、マウス卵黄嚢とAGM33の血原性仕様を可能にすることが確認されました。マウスの血原性ECは、内皮(すなわち、CD31、KDR)および造血(すなわち、c-Kit、CD34)マーカーの両方の発現によって最小限に同定することができる4。最後に、血原性ECは内皮から造血への移行(EHT)を受けてHSPCを形成し、すべての血球タイプを生じさせる可能性があります4,34,35。
最近の研究では、この同じシグナル伝達階層がヒト血原性EC仕様を促進できるかどうかをテストしました。そのために、hESCから血発生性ECを誘導するための血清およびフィーダーフリーの2D培養プロトコルが開発され、これらの血発生性ECはCD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-カドヘリン- CD45-として単一細胞レベルで特徴付けられました。この研究では、FUCCIレポーターコンストラクト(H9-FUCCI-hESC)を発現するH9-hESCを使用して、さまざまな細胞周期状態を識別する蛍光ユビキチン化細胞周期インジケーター(FUCCI)レポーターも利用しました36。これらの細胞を用いた研究では、RAがECにおける早期G1細胞周期停止を促進し、初期のG1状態がin vitroでの血原性仕様を可能にすることが実証された37。本明細書では、これらのヒト血原性内皮細胞の分化のための詳細なプロトコールおよびそれらの同一性を確認するアッセイが提供される。この簡単な方法は、ヒト血球発生のメカニズムの将来の研究のために、この特殊なECのサブセットを生成するための有用な手段を提供します。

<table><tbody><tr><td>15 cmディッシュ</td><td>コーニング</td><td>430599</td><td>組織培養処理</td></tr><tr><td>35 mmディッシュ</td><td>コーニング</td><td>430165</td><td>組織培養処理済み</td></tr><tr><td>6ウェルプレート</td><td>コーニング</td><td>3516</td><td>組織培養処理済み</td></tr><tr><td>抗菌試薬 ブランド名:Normocin</td><td>Invitrogen</td><td>ant-nr-1</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R&D systems</td><td>233-FB-025</td><td>を 50 ng/mL</td></tr><tr><td>で使用 BMP4</td><td>BioLegend</td><td>595202</td><td>25 ng/mL</td></tr><tr><td>で使用 牛血清アルブミン (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600-1</td><td></td></tr><tr><td>Cell Detatchment Solution ブランド名: Accutase</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7920</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド (DMSO)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>D2650-100mL</td><td></td></tr><tr><td>ディスパーゼ</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7913</td><td></td></tr><tr><td>DLL4</td><td>R&D systems</td><td>1506-D4/CF</td><td>recombinant human; 10 &mu;g/mL</td></tr><tr><td>DMEM:F12</td><td>Gibco</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(PBS)</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>内皮細胞増殖培地 ブランド名:EGM-2 内皮細胞増殖培地-2 BulletKit (EGM-2)</td><td>ロンザ</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>FACS チューブ</td><td>コーニング</td><td>352235</td><td>ポリスチレン丸底、フィルターキャップ付き</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清(FBS)</td><td>ジェミニバイオ</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>フィブロネクチン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>33016015</td><td>4 &mu;g/cm2</td></tr><tr><td>GSK3i/CHIR99021</td><td>ステムジェント</td><td>04-0004-02</td><td>10 mM ストック; 5 &mu;M</td></tr><tr><td>Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>塩酸 (HCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144S-500</td><td></td></tr><tr><td>Matrix protein&nbsp; ブランド名: Matrigel</td><td>Corning</td><td>356230</td><td>成長因子が減少しました。ロットの分析証明書を参照して、タンパク質(マトリゲル)濃度を決定してください。この濃度は、1 mgのタンパク質を含むマトリゲルの体積を計算するために必要です。</td></tr><tr><td>メチルセルロースベースの培地 ブランド名:MethoCult H4435 Enriched</td><td>Stemcell Technologies</td><td>4435</td><td></td></tr><tr><td>多能性幹細胞分化培地 ブランド名:STEMdiff APEL 2</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5270</td><td></td></tr><tr><td>多能性幹細胞:H1、H9、H9-FUCCI</td><td>WiCell</td><td>WA09(H9)、WA01(H1)</td><td>ヒト;H9-FUCCI は、ケンブリッジ幹細胞研究所の Ludovic Vallier 博士の研究室から入手しました</td></tr><tr><td>Protein-Free Hybridoma Medium (PFMH)</td><td>Gibco</td><td>12040077</td><td></td></tr><tr><td>Retinoic Acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R2625-50mg</td><td>を 0.5 &μ;M</td></tr><tr><td>逆転写マスターミックス ブランド名: iScript 逆転写スーパーミックス</td><td>BioRad</td><td>1708840</td><td></td></tr><tr><td>RNA 抽出キット ブランド名: RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム (NaOH)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS255-1</td><td></td></tr><tr><td>幹細胞増殖培地 ブランド名: mTeSR1</td><td>Stemcell Technologies</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>SYBRグリーンマスターミックス ブランド名:iTaqユニバーサルSYBRグリーンマスターミックス</td><td>BioRad</td><td>1725121</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA</td><td>ギブコ</td><td>25299956</td><td>0.25%</td></tr><tr><td>VEGF<サブ>165</サブ>(VEGF-A)</td><td>PeproTech</td><td>100-205</td><td>ng / mL</td></tr><tr><td>での使用&-CD31-FITC</td><td>BioLegend</td><td>303104</td><td>2 &mu;g/mL*</td></tr><tr><td>&α;-CD34-パシフィックブルー</td><td>バイオレジェンド</td><td>343512</td><td>2 &mu;g/mL*</td></tr><tr><td>&α;-CD45-APC/Cy7</td><td>BioLegend</td><td>304014</td><td>2 &mu;g/mL*</td></tr><tr><td>&α;-c-Kit-APC</td><td>BioLegend</td><td>313206</td><td>2 &mu;g/mL*</td></tr><tr><td>&α;-Flk-1-PE/Cy7</td><td>BioLegend</td><td>359911</td><td>2 &mu;g/mL*</td></tr><tr><td>&α;-VE-カドヘリン-PE</td><td>バイオレジェンド</td><td>348506</td><td>2 &mu;g/mL*</td></tr><tr><td>* 抗体蛍光標識は、使用するセルソーターに基づいて最適化する必要があります。ここでは、この研究で利用された最終的な濃度を示します。</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ヒト多能性幹細胞からの血原性内皮細胞の指向性分化

Directed Differentiation of Hemogenic Endothelial Cells from Human Pluripotent Stem Cells

血管は体のすべての組織に遍在し、多様な機能を果たしています。したがって、血管内腔を覆う成熟血管内皮細胞のヒト多能性幹細胞からの誘導は、多数の組織工学および再生アプリケーションにとって非常に重要です。in vivoでは、始原内皮細胞は中胚葉系譜に由来し、動脈、静脈、毛細血管、血発生、リンパなどの特定のサブタイプに対して特定されます。血原性内皮細胞は、発生中に造血幹細胞と前駆細胞を生じさせ、それが生涯を通じてすべての血液系統を生成するため、特に興味深いものです。したがって、in vitroで血原性内皮細胞を生成するシステムを作成することは、内皮から造血への移行を研究する機会を提供し、ヒト血液製剤のex vivo産生とヒトドナーへの依存の減少につながる可能性があります。前駆細胞および始原内皮細胞の誘導にはいくつかのプロトコルが存在するが、ヒト幹細胞からの十分に特徴付けられた血原性内皮細胞の生成は記載されていない。ここでは、GSK3β阻害剤(CHIR99021)に応答して形成された原始的な筋細胞による分化プロトコル、bFGFによる中胚葉誘導、BMP4およびVEGF-Aによる始原内皮細胞の発生促進、そして最後にレチノイン酸による血原性内皮細胞仕様の約1週間でヒト胚性幹細胞から血原性内皮細胞を誘導する方法を紹介します。このプロトコルは、それらの分子調節と内皮から造血への移行をさらに理解するために使用できる血原性内皮細胞の明確に定義された集団を生み出し、下流の治療アプリケーションに適用できる可能性があります。

hESC由来の始原ECおよび血原性ECの仕様を概説した模式図と、めっき後24時間後の細胞の代表的な画像を図1に示します。仕様に従い、始原ECおよび血原性ECは、それぞれ5日目および8日目にFACS精製される。原始ECはCD31+ CD45-と定義され、血原性ECはCD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-カドヘリン-CD45-と定義される。始原ECおよび血原性EC精製のための代表的なフローサイトメトリーゲーティング戦略を図2に示します。細胞は、CD45の陰性発現およびCD31の陽性発現に基づいて最初にゲーティングされ、精製された始原ECを得る(図2A)。精製された血原性ECを得るために、細胞は図2Aのように最初にゲー...

ここに提示されるのは、約1週間でヒト多能性幹細胞から血原性内皮細胞を指向的に分化させるための簡単なプロトコルです。

Blood vessels are ubiquitously distributed within all tissues of the body and perform diverse functions. Thus, derivation of mature vascular endothelial ...

このプロトコルは、ヒト血原性内皮細胞の十分に特徴付けられた集団を生成する方法を詳述する。これらの細胞は、分子調節および内皮から造血への移行を研究するために利用することができる。まず、ヒト胚性幹細胞を4日間培養し、始原内皮細胞に分化させます。5日目に、細胞の上に培地を吸引します。次に、ウェルあたり1ミリリットルのDMEM / F-12で細胞を穏やかに洗浄します。ウェルあたり1ミリリットルの新たに調製した血原性内皮細胞分化培地を加え、摂氏37度および5%二酸化炭素で24時間細胞をインキュベートします。6日目および7日目に、細胞の上の培地をウェルあたり1ミリリットルの新たに調製した均質な内皮細胞分化培地と交換し、細胞をさらに24時間インキュベートします。8日目。細胞を剥離して洗浄した後、氷上の微量遠心チューブに均等に分割し、それぞれが1ミリリットルあたり10〜5番目の細胞の1倍の密度で最低600マイクロリットルの細胞を含みます。必要に応じて細胞を含むチューブに抗体を加え、光から保護された氷上で30分間インキュベートします。1000倍Gおよび摂氏4度で5分間遠心分離することにより、細胞をペレット化します。上清を除去し、ペレットを600マイクロリットルの氷冷選別バッファーに再懸濁します。5ミリリットルのFACSチューブのメッシュフィルターキャップを通してサンプルを濾し、光から保護された氷上に細胞を保存して、細胞を即座に選別します。FACSによって血原性内皮細胞を単離するには、まずCD45陰性細胞集団をゲートする。次にCD45陰性集団内で、CD31陽性細胞をゲートする。次にCD31陽性集団内で、VEカドヘリン陰性細胞集団のためのゲート。そして、VEカドヘリン陰性集団内で、c-Kit陽性細胞のゲート。c-Kit陽性集団から、CD34陽性細胞集団をゲートする。そして最後にCD34陽性細胞集団から、KDR陽性細胞を同定・採取する。造血前駆細胞の増殖のために処方されたメチルセルロースベースの培地に血原性内皮細胞を播種した後、コロニー形成ユニット-赤血球コロニー、およびいもち病形成ユニット-赤血球コロニーを8日目にカウントします。コロニー形成ユニット-顆粒球-マクロファージおよびコロニー形成ユニット-顆粒球、赤血球、マクロファージ、およびメガカリオサイト。多能性造血前駆細胞コロニーは14日目にカウントされます。播種された1000個の血原性内皮細胞当たり、約20個のコロニー形成単位が生成される。内皮細胞形態を有する細胞も培養物中に見える。これらは、単一細胞レベルで多系列造血前駆細胞を生じさせる血原性内皮細胞です。このプロトコルは、約1週間でヒト血原性内皮細胞を作製できる2D血清およびマウスフィーダーフリー培養システムです。

directed-differentiation-hemogenic-endothelial-cells-from-human

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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Tリンパ球に向かって誘導多能性幹細胞の分化の指示

このビデオでは、ヒトiPS細胞を脳の微小血管内皮細胞に分化するための多段階のプロセスを示しています。得られた分化細胞は、タイトジャンクションを特徴とする脳の微小血管内皮細胞に密接に類似しているため、脳疾患の研究に最適です。...

ヒト人工多能性幹細胞の脳微小血管内皮細胞への分化

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ヒト多能性幹細胞からドーパミン作動性ニューロンの分化を監督

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ヒト多能性幹細胞における転写因子の過剰発現によって、造血内皮と血液の直接誘導

ここで、提示ひと多能性幹細胞 (hPSC) 培養のプロトコル、CD34 に hPSCs を区別するために使用される+造血前駆細胞。このメソッドは、排他的に決定的なまたは原始的な造血プログラムのいずれかのセルを指定するカノニカル WNT...

ひと多能性幹細胞からプリミティブかつ決定的な造血前駆細胞の分化を監督

ここで、フィーダーおよびキセノフリー状態でヒト多能性幹細胞から血原性内皮を正確に形成するプロトコルを提示する。この方法は、疾患のモデリングと治療化合物のスクリーニングに幅広い応用を持つことになります。...

フィーダーとゼノフリーの定義条件におけるヒト多能性幹細胞からの血原性内皮分化

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転写因子の強制発現によるヒト線維芽細胞のヘモジェニックリプログラミング

本稿の目的は、多能性幹細胞からのヒト肝前駆物質分化を誘導する標準化されたアプローチを提供することです。すぐに使用できるメディア製剤を用いたこの手順の開発は、生物医学の研究と翻訳のためのヒト肝細胞を生成する容易なシステムをユーザーに提供する。...

定義された分化系を用いた多能性幹細胞からの肝前駆体仕様

ここでは、多能性幹細胞を脳微小血管内皮細胞(BMEC)様細胞に分化させるプロトコルである拡張内皮細胞培養法(EECM)について述べる。これらの細胞は内皮細胞接着分子発現を示すため、in...

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このプロトコルは、人工多能性幹細胞(iPS細胞)からのヒト破骨細胞の微分を示し、破骨細胞および破骨細胞の前駆細胞の性格描写のための方法を記述する。...

ヒト人工多能性幹細胞からの破骨細胞の分化と特性評価

学ぶ、ヒト胚性幹細胞から血原性内皮細胞を誘導分化させる方法。FACSによる表面マーカー分離とコロニー形成アッセイで造血能を評価し、血管から造血への遷移を研究する。再生医療への応用も期待される。

ヒト多能性幹細胞からの血原性内皮細胞の指向性分化

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