Name: イン・ヴィトロ E3ユビキチンリガーゼ関数の解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 6 s
Description: 学ぶE3ユビキチンリガーゼ機能のin vitro解析法。E2酵素特異性、基質選択、ユビキチン転移を評価し、真核生物由来タンパク質の翻訳後修飾メカニズムを解明する。専門機器不要で広く応用可能な生化学的手法です。

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私たちは、重要な議論と原稿に関する有益なアドバイスのために私たちの研究室のメンバーに感謝します。サイズ制限により貴重な貢献を挙げたもので、お詫び申し上げます。この作品は、ドイツ・フォルシュングスゲマイインシャフト(DFG、ドイツ研究財団)-SFB 1218 - プロジェクトン番号269925409とクラスター・オブ・エクセレンスEXC 229/ CECADからTHに支援されています。この作品は、ドイツの卓越性戦略の下でドイツ・フォルシュングスゲミンシャフト(DFG、ドイツ研究財団)によって資金提供されました - EXC 2030 - 390661388と - SFB 1218 - Projektnumber 269925409 T.H. ディース・アルベート・ヴルデ・フォン・デア・ドイセン・フォルシュンスゲマイインシャフト (DFG) イム・ラーメン・デア・ドイメン・エキゼレンツラティー - EXC 2030 - 390661388ウント - SFB 1218 - プロジェクトヌマー: 269925409 T.H.

1. バッファーおよび試薬の調製
注:実験室で手動で調製したバッファーと試薬は以下のとおりです。プロトコルで使用される他のすべてのバッファーおよび試薬は、異なるソースから購入し、メーカーの指示に従って使用されました。
<ol><li>10倍のリン酸緩衝生理食塩分(10x PBS)を準備します。この目的のために、1.37 M塩化ナトリウム(NaCl)、27 mM塩化カリウム(KCl)、80mMの二ナトリウム-リン酸二水和物(Na2HPO4.2H2O)、20mMのリン酸カリウム二水素(KH2PO4)を1Lに2倍蒸留したH2O(dH2 O)を混合します。10x PBSをオートクレーブし、ddH2Oで1x PBS溶液を調製した。<ol>
<li>オートクレーブ処理は121°Cおよび98.9 kPaで15分間行われる。 注:オートクレーブ処理は、すべてのバッファとソリューションに対してこれらの条件下で行われます。特に指示しない場合、溶液は室温(RT)で保存されます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>1X PBSの1 Lに0.1%ツイーンを加えて、PBS-Tween(PBS-T)溶液を1 L調製する。</li>
	<li>0.5 M L-リジンストック溶液の10 mLを、DdH2O. アリコート L-リジン中に溶解して 1 mL の部分で調製し、さらに使用するまで -20 °C で保管します。 注:L-リジンは凍結し、繰り返し解凍することができます。</li>
	<li>EDTAを200mLのddH2Oで溶解して0.25Mエチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)溶液を調製します。<ol>
<li>水酸化ナトリウム (NaOH) で pH を 8.0 に調整します。</li>
		<li>ddH 2 Oで音量を250mLに調整します。</li>
		<li>ソリューションをオートクレーブします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>200 μL アリコートで-20 °Cで BSA を ddH2O. ストアに溶解して、20 mg/mL ウシ血清アルブミン (BSA) 溶液の 10 mL を調製します。 注:BSAは凍結し、繰り返し解凍することができます。</li>
	<li>2-(N-モルフォリノ)エタンスルホン酸(MES)の1 Lを溶解して、50 mM MES、50 mM Trisベース、3.47 mMナトリウムドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、および1.03 mM EDTAを0.9 LのddH2Oで調製します。正しく混合した後、音量を1Lに調整します。<ol>
<li>1x バッファの pH は 7.6 です。pHを酸や塩基で調整しないでください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>10gの粉ミルクを1x PBS-Tに溶解させて、200mLのブロッキング溶液(5%ミルク)を調製します。ブロッキング溶液を4°Cで最長1週間保存してください。</li>
	<li>メーカーの指示に従って、転送バッファの1 Lを準備します( 材料表を参照)。</li>
	<li>2x SDSサンプルバッファーを溶解して、125 mM Trisベース、4%SDS、4%グリセロール、0.03%ブロモフェノールブルー、50 μL/mLのβメルカプトエタノールを50 mL ddH2O. アリコートで1 mLで溶解し、使用するまで-20°Cで保存します。</li>
</ol>2. インビトロ オートユビエキセイアッセイ
<ol><li>アッセイの準備と実行<ol>
<li>タンパク質の特定のモル濃度とタンパク質溶液のタンパク質濃度に基づいて、反応ごとに必要な各試薬の量を計算します。オートユビキタンス反応に従って、100 nM E1、1 μM E2、1 μM E3、および50 μM Ubを使用してください。反応の体積をddH2Oで20μLに調整します。 注:ATPソリューションとユビキタスバッファーは10xストックソリューションとして購入され、1xで使用されました。</li>
		<li>すべての反応のためのピペットスキームを準備します。CHIP、(II)を触媒的に不活性CHIP(H260Q)変異体、(III)個々のユビキタス反応でCHIPを使用せずに機能する能力について、9種類のE2酵素をテストします。</li>
		<li>ピペットのエラーを避けるために、すべての反応に必要なボリュームと1つの余分な反応を含む氷の上にマスターミックスを準備します。反応ごとに必要なマスターミックスの量を計算します。 注:マスターミックス成分は、各反応に等しく必要とされる試薬、 すなわち、E1、E3、Ub、ATP、およびユビキタス化バッファーです。</li>
		<li>ddH2Oとマスターミックスをポリメラーゼ連鎖反応(PCR)チューブに加えます。チューブを氷の上に置いておきなさい。</li>
		<li>E2酵素を添加してユビキタス化反応を開始する前に、PCRサーマルサイクラーを設定し、次のプログラムを使用します: 2 h, 37 °C, 無限に 4 °C.</li>
		<li>各チューブにE2酵素1μMを加え、サンプルをPCRサーマルサイクラーにインキュベートします。</li>
		<li>2時間後、各反応にSDSサンプルバッファーを加え、上下に数回ピペットして混合します。 注: サンプル バッファーの必要なボリュームは、サンプル バッファーのストックの濃度によって異なります。ここでは、2倍のSDSサンプルバッファーの20μLを各反応に添加した。</li>
		<li>サンプルを95°Cで5分間沸騰させ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)を続けます。変性タンパク質を-20°Cで保存します。</li>
	</ol></li>
	<li>ゲル電気泳動とウェスタンブロット<ol>
<li>解凍後、サンプルを約10 s回転させ、SDS-PAGEゲルをロードします。サイズ参照としてタンパク質ラダーを使用します。 注:ここでは、4-12%のビストリス勾配ゲルと3μLのタンパク質ラダーが使用されました。サンプルの体積を分け、各サンプルの20 μLを使用して2つのゲルを均等にロードします。</li>
		<li>サンプルの前面がゲルの底部に到達するように、ゲルを約30〜45分間、160-200 Vでゲルを実行します。</li>
		<li>各ゲルをセミドリーブロッティングバッファーで満たされたプラスチック容器に移し、RTで2〜5分間インキュベートします。</li>
		<li>SDSゲルあたり2枚のゲルサイズのブロッティングペーパーとゲルサイズのニトロセルロース膜を準備し、セミドリーブロッティングバッファーにプレソーキングします。ウェスタンブロット(WB)サンドイッチを下から上にWBチャンバーに組み立てます:ブロッティングペーパー、ニトロセルロース膜、SDS-PAGEゲル、ブロッティングペーパー。</li>
		<li>サンドイッチ層の間に閉じ込められた可能性のある気泡を取り除く。この目的のために、慎重にサンドイッチを数回ロールオーバーするローラーを使用しています。</li>
		<li>チャンバーを閉じ、余分なブロットバッファーを排出します。</li>
		<li>チャンバーをそれぞれのブロッティング装置に入れ、セミドライブロッティング用に次のプログラムを使用します:25 V、1.0 A、30分。</li>
		<li>ブロット膜をブロッキング溶液で満たされたプラスチック容器に移し、RTで30分間インキュベートします。</li>
		<li>ブロッキング試薬を含むPBS-Tの10mLに抗体を添加して一次抗体溶液を調製する( 材料表参照)。 注:抗体の働き濃度は抗体特異的です。この場合、モノクローナルマウス抗ユビキチン抗体を1:5,000の希釈で使用した。第2のゲルについては、PBS-T/ブロッキング試薬においてモノクローナルウサギ抗CHIP抗体を1:5,000に使用した。</li>
		<li>ブロッキング溶液を一次抗体溶液に交換し、ロッカー上で4°Cで一晩インキュベートします。</li>
		<li>PBS-Tで10分間、膜を3回洗浄します。</li>
		<li>各抗体をPBS-Tの10mLに添加して二次抗体溶液を調製した。 注:ここでは、ヤギの抗マウスおよびマウス抗ウサギ抗体は、1:10,000の希釈で使用されます。</li>
		<li>ロッカーのRTで1時間二次抗体で膜をインキュベートします。</li>
		<li>膜をPBS-Tで5分間3回洗浄します。</li>
	</ol></li>
	<li>データ分析<ol>
<li>西洋のブロト検出試薬を、製造者の指示に従って洗浄膜に対して、ワサビペルオキシダーゼ(HRP)共役抗体用の試薬を加え、X線フィルムまたは電荷結合デバイスカメラを用いてHRP信号を捕捉する(図1)。</li>
	</ol></li>
</ol>3. インビトロ 基板のユビキタス化アッセイ
<ol><li>アッセイの準備と実行<ol>
<li>タンパク質の特定のモル濃度とタンパク質溶液のタンパク質濃度に基づいて、反応ごとに必要な各試薬の量を計算します。基板のユビキタス化反応ごとに、100 nM E1、1 μM E2、1 μM E3、1 μM基材、および50 μM Ubを使用します。1xで10x ATP溶液と10xユビキタスバッファーを使用してください。基板のユビキタス化反応の体積をddH2Oで20 μLに調整します。</li>
		<li>すべての反応のためのピペットスキームを準備します。基質のユビキタス性がE3特異的であることを検証する適切な制御反応を含む。タンパク質UNC-45BをCHIPの代表基質として用い、触媒的に不活性なCHIP変異体(H260Q)をコントロールとして使用する。以下の反応を準備する:E1、E2、Ubミックス(Ub、ATP、ユビキタスバッファーを含む)。E1、E2、Ubミックス、UNC-45B;E1、E2、Ubミックス、チップ(H260Q)、UNC-45B;およびE1、E2、Ubミックス、チップ、UNC-45B。</li>
		<li>ピペットのエラーを避けるために、すべての反応に必要なボリュームと1つの余分な反応を含む氷の上にマスターミックスを準備します。反応ごとに必要なマスターミックスの体積を計算します。 注:このアッセイのマスターミックスコンポーネントには、E1、E2、Ub、ATP、およびユビキタスバッファーが含まれます。</li>
		<li>反応成分を次の順序で加える:ddH2O、基質、E3リガーゼ。</li>
		<li>マスターミックスを添加してユビキタス化反応を開始する前に、PCRサーマルサイクラーを設定し、次のプログラムを使用して:2時間、37°C、続いて4°C、無限に。</li>
		<li>各チューブにマスターミックスを加え、サンプルをPCRサーマルサイクラーに指定された期間インキュベートします。</li>
		<li>2時間後、各反応に2倍のSDSサンプルバッファーを加え、上下に数回ピペットして混合します。</li>
		<li>実行後、サンプルを95°Cで5分間沸騰させ、PAGEを続けます。あるいは、変性タンパク質を-20°Cで保存する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ゲル電気泳動とウェスタンブロット<ol>
<li>セクション2.2に記載されているようにゲル電気泳動およびウェスタンブロットを行う。基質およびE3リガーゼの検出に特異的な抗体をそれぞれ使用する。 注:ここでは 、C-myc 遺伝子産物由来のポリペプチドタンパク質タグにUNC-45Bが融合し、モノクローナルマウス抗MYC抗体の使用を可能にする。抗MYCは1:10,000で使用されます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>データ分析<ol>
<li>セクション 2.3 (図 2) の説明に従ってデータ分析を実行します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. リジン放電アッセイ
<ol><li>アッセイの準備と実行<ol><li>E1によるUbによるE2酵素の充電<ol>
<li>タンパク質の特定のモル濃度とタンパク質溶液のタンパク質濃度に基づいて、反応ごとに必要な各試薬の量を計算します。1回の充電反応で、2 μM E1、4 μM E2、4 μM リジンフリーユビキチン(Ub K0)を使用してください。1x で 10x ATP および 10x ユビキタス バッファーを使用します。充電反応の音量をddH20で20μLに調整します。 注:リジンフリーUb K0変異体は、モノユビキティレートE2の排他的な生産を強制するために使用されます。野生型Ubも使用できます。しかし、これは、分析が難しい多様なE2〜Ub修飾(例えば、E2のポリユビティメンテーション)につながる可能性があります。初めて使用する場合、または新しいE2酵素を使用する場合は、E1で達成できるE2上のUb充電のレベルを決定します。充電の歩留まりを決定するには、クーマシー染色を介して充電されていないE2と充電されていないE2を視覚化します。ここでは、UBE2D2とUb K0の等モル比を使用する場合、Ub K0の約半分を確実にUBE2D2〜Ubに変換した(補足図S2A)。</li>
			<li>充電反応のためのピペット処理スキームを準備します。充填反応の体積を、その後選択した放電反応に合わせて調整します( 例えば、個々の放電反応でCHIPとCHIP(H260Q)を使用します。これにより、1回の充電反応の2倍の体積を調製する。 注:初めての使用のために、最適な排出条件を監視するために選択したE3リガーゼの異なる濃度をテストし、ウェスタンブロッティングでそれらを分析します。理想的な条件では、E2からのUbの放電は、それぞれのE2〜Ubタンパク質バンドが消失するまで時間の経過とともに増加します。</li>
			<li>37°Cで15分間の充電反応をインキュベートします。</li>
		</ol></li>
		<li>充電反応の終了<ol>
<li>最終濃度1.8 U/mLでアピローゼを添加して充電反応を停止します。RTで5分間アピラーゼでインキュベーションを行い、その後、30mMの最終濃度でEDTAを添加します。充電反応の音量をddH2Oで30μLに調整します。 注:アピラーゼは、ATP分子をADP(アデノシン二リン酸)分子に変換するために使用されます。E1酵素の活性はATP依存性であるため、E1はもはやE2を充電できない。EDTAは、E1に必要な共因子であるMg2+イオンをクエンチすることによってE1が阻害されることを確実にするためにさらに使用されます。反応を停止するために必要なアピラーゼの体積は、アッセイ条件によって異なる場合があります。アピローゼだけでも既に利用可能なATP分子を消光しているが、アピローゼとEDTAの組み合わせは、E1-UBE2D2対の充電反応を止めるのにより効果的であった。反応を停止することは、アッセイ再現性の重要な因子であるため、効率的な停止は、新しいE1-E2ペアのためにテストする必要があります。この目的のために、充電反応を設定し、それを停止し、特定の時点でサンプルを収集します(例えば、2、5、10、15分後)。E2〜Ubの不変レベルは、反応が停止し、その期間中にチオエステルが安定したことを示す(補足図S2B)。</li>
		</ol></li>
		<li>E2~Ub の E3 による放電<ol>
<li>異なる時間ポイント(t0、t 1、t 2、t 3)に対応する4つのチューブを準備します。 非還元サンプルバッファー(4xリチウムドデシル硫酸(LDS)バッファーの 6.7 μL)を各チューブに加えます。 注: サンプル バッファーでリミッシング 剤を使用しないでください。</li>
			<li>t0の停止した充電反応から6μLを取り出し、ddH2Oで20μLに調整します。</li>
			<li>t0 サンプルを70°Cで10分間インキュベートします。 注意:チオエステルがより高い温度で不安定であるようにインキュベーション時間を延長することによってサンプルを沸騰させないでください。</li>
			<li>放電反応ごとに必要な各試薬の量を計算します。充電したE2の残りの24 μLを使用し、10 mM L-リジン、1 mg/ml BSA、およびE3リガーゼの500 nMを加えます。1xでユビキタスバッファーを使用し、ddH2Oで80 μLに音量を調整します。</li>
			<li>すべての放電反応のためのピペッティングスキームを準備し、CHIP(WT)に加えて制御としてCHIP(H260Q)を使用します。</li>
			<li>ddH2 O、ユビキタスバッファー、BSA、リジン、E3リガーゼ、および荷電E2を次の順序で添加して氷上で放電反応を設定し、反応を開始します。</li>
			<li>RTで放電反応をインキュベートする。</li>
			<li>20 μLの排出反応を各サンプルチューブに移して、5、30、60分後にサンプルを採取します。 注:放電の適切な監視を可能にする適切なタイムポイントは、E2-E3ペア間で異なる場合があります。</li>
			<li>すぐに試料をボルテックスし、70°Cで10分間インキュベートする。</li>
			<li>直接 PAGE を続行します。 注:E2〜Ubチオエステルは、サンプルバッファーで変性した後でも不安定なことができます。したがって、ゲル電気泳動は、アッセイ実行後に直接行われるべきである。</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>ゲル電気泳動とウェスタンブロット<ol>
<li>ゲル電気泳動とウェスタンブロッティングをセクション2.2に記載されているように行います。Ub特異的抗体を使用し、可能であれば、別の種で育てられたE3特異的抗体も使用し、UbとE3リガーゼシグナルを同時に検出できるようにします。</li>
	</ol></li>
	<li>データ分析<ol>
<li>セクション 2.3 (図 3) で説明したデータ分析を実行します。</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

著者には利益相反はありません。

本論文では、E3リガーゼ機能の解析に関するイン ビトロ のユビキタス化法の基礎について述べている。 インビトロ のユビキタス化アッセイを行う場合、一部のE2酵素は、活性部位30に近接して位置する自身のリジン残基に対する活性システインの攻撃に起因して、自己ユビキタス化を行うことができるものもあると考えるべきである。この問題を回避するために、E2変異体の使用は、それぞれのリジン残基がアルギニンと交換される、オートユビキトリメンテーション32に耐性のある触媒活性E2酵素をもたらすことを推奨する。これは、リジン放電アッセイを介してUb転送を監視し、アッセイの再現性を確保する際に特に重要です。もう一つの重要な要因は、E2〜Ubチオスター結合の一過性の性質である。チオスター安定性が インビトロ 用途で可能な限り限界を有する場合、E2の活性システイン残基をセリンと交換して、より安定なE2〜Ubオキシエステル33を生成することができる。初めて使用する場合、ま...

Ubiquitylationは、Ubが基質タンパク質1に共有結合するプロセスです。Ub修飾は、3つの異なる酵素クラス、すなわちUb活性化酵素(E1s)、Ub共役酵素(E2s)、Ubリガシュ(E3s)、およびおそらくUb鎖伸長因子(E4s)2、3、4、5の作用を伴う連続した酵素反応によって触媒される。アデノシン三リン酸(ATP)−マグネシウム(Mg2+)依存性E1によるUbの活性化後、E1の活性部位システインはUbのC末端グリシンを攻撃し、チオエステル複合体(Ub〜E1)を形成する。ATP加水分解から引き出されたエネルギーは、Ubが高エネルギー過渡状態を達成し、次の酵素カスケード全体にわたって維持される。次に、E2酵素は活性化されたUbをその内部触媒システインに転移させ、それによって一過性のUb〜E2チオエステル結合を形成する。続いて、Ubは基質タンパク質に移される。
これは 2 つの方法で実行できます。E3リガーゼは、最初にE2に結合するか、またはE3リガーゼが直接Ubを結合することができる。後者の方法は、E3〜Ub中間体の形成をもたらす。いずれの場合も、Ubは、UbのC末端カルボキシル基と基質のリジンƐ-アミノ基の間にイソペプチド結合を形成することにより基質タンパク質に連結される。ヒトゲノムは、2つのE1、約40 E2、および600以上の推定ユビキチンリガーゼ7をコードする。E3のUb転送機構に基づいて、Ubリガーゼは相同からE6APC末語(HECT)型、本当に興味深い新遺伝子(RING)/Uボックス型、およびリング間のリング(RBR)型リガス8を含む3つのカテゴリに分かれています。本研究では、HSC70相互作用タンパク質のリガーゼ、カルボキシル末テルミナス(CHIP)を含むUボックスを、代表的なE3酵素として用いる。UB〜E3チオエステルを形成するHECT型E3型酵素とは対照的に、CHIPのUボックスドメインはE2〜Ubに結合し、E2酵素8,9から直接Ub/基質転移を促進する。酵素機能のUボックスの重要性に基づいて、非アクティブなCHIP Uボックス変異体CHIP(H260Q)をコントロールとして利用します。CHIP(H260Q) は、その同質E2sに結合できないため、E3リガーゼ活動10を失う。
タンパク質のユビキタス化は、真核細胞の細胞イベントの多数を調節する上で重要な役割を果たしています。Ub分子の基質タンパク質への可逆的な結合によって促進される細胞の結果の多様性は、Ubの分子特性に起因する可能性がある。Ub自体は、さらにユビキタス化のための7つのリジン(K)残基を含むので、異なるサイズおよび/またはトポロジー11を有するUbチェーンタイプの豊富な多様性がある。例えば、基質は、1つのUb分子(モノユビキタンション)または複数のリジン(マルチモノユビキタン化)、さらにはUb鎖(ポリユビキティメンテーション)11で修飾することができる。Ub鎖は、Ubの同じまたは異なるリジン残基を介してホモまたはヘテロタイプのいずれかであり、分岐されたUb鎖9を生じる可能性さえある。したがって、タンパク質のユビキタス化は、特定の情報を提供するUb分子の多様な配置、例えば、共役タンパク質12、13の分解、活性化、または局在化に対して導く。これらの異なるUb信号は、変化する環境ニーズに対応する細胞の能力のための重要な要件である細胞シグナル伝達経路の迅速な再プログラミングを可能にします。
ユビキタス化の中心的な側面は、タンパク質の品質管理に関連しています。誤って折り畳まれたか、または不可逆的に損傷を受けたタンパク質は、タンパク質ホメオスタシスまたはプロテオスタシス14を維持するために、新たに合成されたタンパク質に分解して置き換える必要があります。品質管理E3リガーゼ、CHIPは、損傷したタンパク質9、15、16、17のUb依存分解における分子シャペロンと協力する。それとは別に、CHIPは、筋肉機能と最適レベルからの逸脱がヒトミオパシー18、19、20、21につながるミオシン指向シャペロン、UNC-45B(Unc-45ホモログB)の安定性を調節する。26SプロテアソームによるUNC-45Bの分解は、K48結合ポリユーバ鎖9の付着によって媒介される。基質タンパク質の存在しない場合、CHIPは、リング/UボックスE3ユビキチンリガス24、25の特徴であるオートユビキトリエーション10、22、23を行い、リガーゼ活性26を調節すると考えられる。本論文に記載されたインビトロのユビキタス化アッセイ法の適用は、CHIPと提携するE2酵素を体系的に同定し、CHIPの自由なポリユーブ鎖および/またはオートユビキトリスの形成を促進するのに役立った(プロトコルセクション2)。さらに、チップ依存性UNC-45Bのユビキタス化が認められ、これはE3リガーゼ18、19(プロトコルセクション3)の既知の基質である。最終的に、Ub〜E2チオスターからの活性化されたUbのCHIP依存的な転送を監視した(プロトコルセクション4)。

<table><tbody><tr><td>アマシャンプロトラン0.1&マイクロ;m NC</td><td>GE Healthcare</td><td>10600000</td><td>ニトロセルロース膜</td></tr><tr><td>Anti-CHIP</td><td>Cell Signaling</td><td>2080</td><td>モノクローナルウサギ 抗CHIP抗体、クローン C3B6</td></tr><tr><td>抗MYC</td><td>ロシュ</td><td>OP10</td><td>モノクローナルマウス抗MYC抗体、クローン 9E10</td></tr><tr><td>抗ユビキチン</td><td>Upstate</td><td>05-944</td><td>モノクローナルマウス抗Ub抗体、クローンP4D1-A11</td></tr><tr><td>Apyrase</td><td>Sigma</td><td>A6535-100UN</td><td></td></tr><tr><td>ATP (10x)</td><td>Enzo</td><td>12091903</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A6003-10G</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Roth</td><td>8043.2</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Roth</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td></td><td>Roth P749.2</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Roth</td><td>3904.1</td><td></td></tr><tr><td>LDS サンプルバッファー (4x)</td><td>novex</td><td>B0007</td><td></td></tr><tr><td>L-リジン</td><td>シグマ</td><td>L5501-5G</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Roth</td><td>4256.4</td><td></td></tr><tr><td>MeOH</td><td>VWR 化学薬品</td><td>2,08,47,307</td><td>100%</td></tr><tr><td>Milchpulver</td><td>Roth</td><td>T145.3</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Roth</td><td>P029.3</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 抗酸化剤</td><td>invitrogen</td><td>NP0005</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Transferバッファー (20倍)</td><td>novex</td><td>NP0006-1</td><td></td></tr><tr><td>ページ定規 plus</td><td>サーモフィッシャー</td><td>26619</td><td>タンパク質ラダー</td></tr><tr><td>RotiBlock</td><td>Roth</td><td>A151.1</td><td>ブロッキング試薬</td></tr><tr><td>SDS (20%)</td><td>Roth</td><td>1057.1</td><td></td></tr><tr><td>S1000 サーマルサイクラー</td><td>Bio Rad</td><td>1852196</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot</td><td>Turbo Bio</td><td>Rad 1704150EDU</td><td>トランスファーシステム</td></tr><tr><td>トリスベース</td><td>Roth</td><td>4855.3</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Roth</td><td>9127.2</td><td></td></tr><tr><td>UbcH 酵素セット</td><td>BostonBiochem</td><td>K-980B</td><td>E2 酵素</td></tr><tr><td>ユビキチン</td><td>BostonBiochem</td><td>U-100H</td><td></td></tr><tr><td>ユビキチン活性化酵素 E1</td><td>Enzo</td><td>BML-UW941U-0050</td><td></td></tr><tr><td>ユビキチン化バッファー (10x)</td><td>Enzo</td><td>BML-KW9885-001</td><td></td></tr><tr><td>Whatman あぶらとり紙</td><td>バイオラッド</td><td>1703969</td><td>極厚濾紙</td></tr></tbody></table>

イン・ヴィトロ e3ユビキチンリガーゼ関数の解析

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

ユビキチン(Ub)の共有結合は、基質タンパク質の内部リジン残基(複数可)に、ユビキテリメンテーションと呼ばく、真核生物における翻訳後の最も重要な修飾の1つを表す。ユビキチン活性化酵素(E1酵素)、ユビキチン結合酵素(E2酵素)、ユビキチンリガス(E3酵素)、時にはユビキチン鎖伸長因子(E4酵素)を含む3つの酵素クラスの順次カスケードによって媒介される。ここでは、ユビキチンリガーゼ活性の評価、E2-E3対の連携、および基板選択を可能にする、ユビキタス化アッセイのための インビトロ プロトコルが提供される。協力E2-E3ペアは、E3リガーゼのフリーポリユビキチン鎖および/または自動ユビキトリメンテーションの生成を監視することによってスクリーニングすることができます。基質のユビキタス化は、E3リガーゼの選択的結合によって定義され、 インビトロ 反応のウェスタンブロッティングによって検出することができる。さらに、E2〜Ub排出アッセイが記載されており、機能性E2-E3連携の直接評価に有用なツールである。ここで、ユビキチンのE3依存性転写は、対応するE2酵素からフリーリジンアミノ酸(模倣基質のユビキタス化)またはE3リガーゼ自体の内部リジン(自動ユビキトリメンテーション)に続く。結論として、E3リガーゼ触媒機能に対処するために高速かつ簡単に実行できる3つの異なる in vitro プロトコルが提供されています。

ユビキチンリガーゼCHIPと連携するE2酵素を同定するために、一連のE2候補を個々の インビトロ ユビキトリス反応で試験した。E2-E3ペアの協力は、E3依存性のユビキタス化製品、 すなわちE3リガーゼの自動ユビキタス化および自由なUbポリマーの形成によって監視された。ユビキタス製品は、ウェスタンブロッティングによって分析された。データ解釈は、得られたタンパク質バンドと分子量マーカーのサイズ比較に基づいています。タンパク質のユビキタス化は、ダブルバンドまたは複数の反復バンドの出現を特徴とする特定のバンドパターンの形成につながり、それぞれサイズ差が8.6kDa(単一Ub分子の大きさ)を有する。
ここでは、9つのE2sがユビキタス製品の形成を促進する能力を、野生型CHIP(図1A)、非アクティブなUボックス変異型CHIP(H260Q)(図1B)、またはCHIPなし(補足図S1)の存在下で試験した。E...

本研究は、E3ユビキチンリガーゼ触媒活性の分析のための詳細な インビトロ ユビキトリメンテーションアッセイプロトコルを提供する。組換えタンパク質は 、大腸菌 培養などの原核生物系を用いて発現した。

イン・ヴィトロ E3ユビキチンリガーゼ関数の解析

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...

このプロトコルの全体的な目標は、E2酵素特異性、基質選択およびユビキチン伝達を含むE3リガーゼ機能の重要な重要な側面を分析することである。この技術の主な利点は、すべての真核生物源からのタンパク質を組み換えて発現し、特別な装置を必要とせずにインビトロで研究することができるので、その広い適用性です。リジン放電技術を初めて使用する場合、酵素濃度などのアッセイパラメータを最適化して、選択したE3リガーゼの理想的な排出条件を特定することが重要です。インビトロオートユビキセイ法を実行するには、異なるE2酵素の機能能力をテストするピペッティングスキームを設定し、すべてのユビキタス反応と1つの追加反応のために氷上のマスターミックスを準備します。次に、適切なチューブにE2酵素のマイクロモルを1つ加え、指示された条件下で2時間PCRサーマルサイクラーにサンプルをインキュベートします。インキュベーション後、各反応にSDSサンプルバッファーを加え、数回ピペットで混合します。その後、すぐに摂氏95度で5分間サンプルを沸騰させ、変性タンパク質を摂氏20度で保存します。インビトロ基質のユビキタス化アッセイを行うために、すべての反応に対してピペッティングスキームを調製する。1つの反応に必要なマスターミックスの量を計算した後、氷上のすべての反応のためにマスターミックスを準備し、各チューブにマスターミックスを追加します。それぞれのE3リガを個別に追加します。次に、サンプルを PCR サーマルサイクラーに 2 時間インキュベートします。インキュベーションの最後に、各反応に2回SDSサンプルバッファーを加え、ピペットで数回混合し、サンプルを摂氏95度で5分間沸騰させます。リジン放電アッセイを行うために、充電反応のためのピペッティングスキームを設定し、摂氏37度で15分間充電反応をインキュベートします。充電反応を停止するには、1ミリリットル当たり1.8単位の最終濃度にアピローゼを加え、室温で5分間インキュベートします。インキュベーションの最後に、EDTAを30ミリモルの最終濃度に加え、二重蒸留水を使用して反応量を30マイクロリットルに調整します。E2のユビキタスをE3で排出するには、実験の時点に対応する5つのチューブを設置し、各チューブに6.7マイクロリットルの非還元サンプルバッファーを追加し、停止した充電反応の6マイクロリットルをタイムポイントゼロチューブから取り除き、総体積を26.7マイクロリットルに調整します。放電反応をセットアップするには、二重蒸留水、ユビキリメンテーションバッファー、BSA、リジン、E3リガーゼおよび荷電E2を各反応に加える。選択した期間の後、各放電反応から20マイクロリットルのサンプルを対応するサンプルチューブに移します。その後、すぐにサンプルを渦し、10分間摂氏70度に置きます。この代表的なウェスタンブロット分析では、非アクティブなCHIPは自動ユビキティで表されていませんでした。しかし、E3非依存性ユビキチン製品は、非アクティブCHIPの存在下およびCHIPの不在時に形成された。野生型CHIPはUBE2DおよびUBE2Eファミリーのタンパク質と組み合わせるとオートユビキテニケーション化され、フリーポリウビキチン鎖はUBE2Dファミリーのタンパク質と協力して製造されたが、UBE2Eファミリーのタンパク質とは組み合わされなかった。UBE2N/V1によるユビキチンの結合は、遊離ユビキチン鎖の形成を指示した。UNC-45Bの自己ユビキタス化およびユビキタス化は、野生型CHIPでは観察されたが、CHIPの不活性変異体では観察されなかったため、UNC-45BはCHIPの保存基質として機能することを示している。チップの触媒活性をリジン放電アッセイを用いて分析した場合、未充電のUBE2D2酵素は分子量17キロダルトン、単一ユビキチン分子を有するUBE2D2は分子量約26キロダルトンであった。時刻0では、全ての荷電E2収率が観察された。非アクティブなCHIPの存在下で、UBE2D2の微弱なE3リガーゼ非依存性放電が検出されたが、CHIPの自動ユビティリメンテーションは検出されなかった。野生型CHIPの存在下では、UBE2D2の排出は速く、60分以内に完了し、CHIPのオートユビキトリメンテーションはユビキチンを独自のリジン残基に移すことを示した。限られたE2能力のために、できるだけ早く働き、すぐにSDS-PAGEおよびウェスタンブロッティングが続く排出反応を進める。これらのインビトロのユビキタス性プロトコルに従って、特異的なユビキタスリンケージタイプは、リンケージ特異的抗体を用いてウェスタンブロットを探査することによって同定することができる。

in-vitro-analysis-of-e3-ubiquitin-ligase-function

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

ユビキチンリ ガーゼとは異なりいくつかの相撲 E3 リガーゼが同定されています。この変更された体外sumo 化プロトコルの in vitro再構成法による新規相撲 E3...

体外相撲 E3 リガーゼ活性を研究する sumo 化アッセイ

ユビキチン化は、細胞プロセスで重要な役割を果たし、デュビキチン化によって緊密に調整される翻訳後修飾です。両方の反応の欠陥は、人間の病理の下にある。精製成分を用いてインビトロでユビキチン化・デュビキチン化反応を行うためのプロトコルを提供します。...

ヌクレオソームヒストンのインビトロユビキチン化とデュービキチン化アッセイ

このプロトコルは、治療または表現型などの特定の状態に関連するこれらの種類の翻訳後修飾(PTM)の変化を同定するために、ユビキチン(Ub)およびユビキチン様(Ubls)特異的プロテオームを確立することを目的としています。...

ユビキチンおよびユビキチン様依存性翻訳後修飾のプロファイリングと有意な変化の同定

この原稿の目的は、RING型E3ユビキチンリガーゼの包括的な生化学的および機能的研究の概要を提示することです。このマルチステップパイプラインは、詳細なプロトコルを用いて、試験されたタンパク質の酵素活性を検証し、活性を機能にリンクする方法を示す。...

インビトロとプランタにおけるRING型E3ユビキチンリガーゼの機能特性評価

この方法はユビキチン鎖トポロジーにおけるグローバルな変化の評価を記述する。この評価は、質量分析法に基づく標的プロテオミクスアプローチの適用によって行われます。...

並列反応モニタリングによるユビキチン連鎖解析

ユビキチン化は翻訳後修飾の重要なタンパク質であり、その中で多くのヒト疾患に関与している調節不全である。このプロトコルは、ファージディスプレイを使用して、ユビキチン化の特異性、効率、パターンを制御するE3リガスの活性を結合および調節できる新しいユビキチン変異体を分離する方法を詳述する。...

ファージディスプレイを使用してE3リガーゼ用ユビキチンバリアント変性変性器を開発する

我々は、哺乳動物細胞における特定の基質およびE3ユビキチンリガーゼのユビキチル化アッセイのための詳細なプロトコルを提供する。HEK293T細胞株をタンパク質過剰発現に使用し、ポリユビキチル化基質を免疫沈降によって細胞溶解物から精製し、SDS−PAGEで分解した。イムノブロッティングを用いて、この翻訳後修飾を可視化した。...

哺乳動物細胞溶解物におけるE3ユビキチンリガーゼによる基質ユビキチル化の評価

機能の喪失と獲得がアンジェルマン症候群と自閉症スペクトラム障害の両方に関連している...

Ube3a変異体の機能評価のためのスケーラブルな細胞ベースの方法

このプロトコルでは、組換えタンパク質精製とユビキチン鎖切断アッセイを組み合わせることにより、神経発達障害に関連する遺伝的変異が脱ユビキチン化酵素活性に及ぼす影響を測定する方法を説明しています。...

In vitroユビキチン鎖切断アッセイによる神経発達障害関連脱ユビキチン化酵素の酵素活性の測定

ユビキチン化は細胞内タンパク質機能の重要な調節因子です。ここでは、哺乳類細胞における基質タンパク質のユビキチン化レベルを検出するための2つの細胞溶解法を説明し、それらのユビキチン化レベルの解析効果を比較します。HEK293T細胞内のタンパク質過剰発現は一時的なトランスフェクションによって誘導され、ウビキチン化タンパク質はウェスタンブロット解析によって検出されました。...

SMAD2/SMURF2をモデルとした哺乳類細胞溶解液におけるユビキチン検出の比較戦略

本プロトコルは、哺乳類細胞溶解液または純粋なユビキチン酵素複合体を用いて肺炎 連鎖...

体外受精 細菌のユビキチン化の再構築とVCP/p97媒介の除去

学ぶE3ユビキチンリガーゼ機能のin vitro解析法。E2酵素特異性、基質選択、ユビキチン転移を評価し、真核生物由来タンパク質の翻訳後修飾メカニズムを解明する。専門機器不要で広く応用可能な生化学的手法です。

イン・ヴィトロ E3ユビキチンリガーゼ関数の解析

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