Name: 脂質膜動態と膜タンパク質相互作用に対するユニークなプローブとしての中性子スピンエコー分光法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: 学ぶ中性子スピンエコー分光法を用いた脂質膜動態の解析手法。ナノ秒スケールの膜変動と膜タンパク質相互作用を測定し、膜バイオ物理学の理解を深めるためのデータ収集・解析プロトコルを解説します。

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R.アシュカーはM.ナガオ、L.-Rに感謝します。スティンタシウ、およびP.ゾルニエツクは、多くの有用な議論とそれぞれのビームライン上のNSE実験で頻繁に支援を行う。著者らは、NISTおよびORNLにおける中性子スピンエコー分光計の使用を認めている。NISTのNSE分光計は、国立標準技術研究所と国立科学財団とのパートナーシップである高解像度中性子散乱センターによって支えられている。DMR-1508249.ORNLのスマレーション中性子源のNSE分光計は、米国エネルギー省基礎エネルギー科学局の科学ユーザー施設部門によって支えられている。オークリッジ国立研究所は、米国DOE契約No.の下でUT-Battelle,LLCによって管理されています。DE-AC05-00OR22725.

著者らは利益相反を宣言せず、開示するものは何もない。

NSEは、様々な条件下での脂質膜のメソスコピックダイナミクスを測定する上で強力かつユニークな技術です。NSEの有効利用は、サンプルの品質、中性子のコントラスト、および特定のサンプルに対してプローブ可能なアクセス可能なダイナミクスの範囲に依存します。したがって、NSE実験を成功させ、高品質なデータを収集するには、いくつかの重要なステップが必要です。NSE実験中に中性子ビーム時間を有効に使用するための重要なステップは、NSE実験の前にラボベースの方法でリポソーム懸濁液を特徴付けることだ。エカデミテの場合、押出リポソームのサイズ分布(または拡散定数)は、動的光散乱(DLS)によって決定され、個々のラボまたは共用施設84で容易に入手できる。クライオ電子顕微鏡法は、リポソーム懸濁液のクライオミクロトム化切片上の高解像度顕微鏡画像を有効に使用して、リポソーム単層体65、ドメイン形成85、86、またはナノ粒子<sup class="xref...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/62396">Neutron Spin Echo Spectroscopy as a Unique Probe for Lipid Membrane Dynamics and Membrane-Protein Interactions</a>. The Introduction, Protocol, and Representative Results sections have been updated.
In the Introduction, the fith pargraph was updated from:
Besides direct access to the length and time scale of membrane dynamics, NSE has the inherent capabilities of neutron isotope sensitivity52. Specifically, the ability of neutrons to interact differently with the isotopes of hydrogen, the most abundant element in biological systems, results in a different neutron scattering length density,34 or NSLD (the equivalent of the optical index of refraction50), when protium is substituted by deuterium. This enables an approach known as contrast variation, which is commonly used to highlight specific membrane features or conceal others — the latter scenario is referred to as contrast matching. A frequent application of contrast variation/matching is the substitution of water (NSLD = -0.56 × 10-6 Å-2) by heavy water or D2O (NSLD = 6.4 × 10-6 Å-2) to amplify the neutron signal from protiated lipid membranes (NSLD ~ 2 × 10-6 Å-2). This approach is highly effective in studies of membrane structure because the penetration of D2O into the headgroup region of the membrane allows accurate determination of the membrane thicknesses (see Figure 2A, left panel) and of the location of different lipid subgroups when more sophisticated models are applied53,54. This paper highlights some examples on the use of contrast variation for studies of collective dynamics in biomimetic membranes and select membrane features.
to:
Besides direct access to the length and time scale of membrane dynamics, NSE has the inherent capabilities of neutron isotope sensitivity52. Specifically, the ability of neutrons to interact differently with the isotopes of hydrogen, the most abundant element in biological systems, results in a different neutron scattering length density,34 or NSLD (the equivalent of the optical index of refraction50), when protium is substituted by deuterium. This enables an approach known as contrast variation, which is commonly used to highlight specific membrane features or conceal others — the latter scenario is referred to as contrast matching. A frequent application of contrast variation/matching is the substitution of water (NSLD = -0.56 × 10-6 Å-2) by heavy water or D2O (NSLD = 6.4 × 10-6 Å-2) to amplify the neutron signal from protiated lipid membranes (NSLD ~ 0 × 10-6 Å-2). This approach is highly effective in studies of membrane structure because the penetration of D2O into the headgroup region of the membrane allows accurate determination of the membrane thicknesses (see Figure 2A, left panel) and of the location of different lipid subgroups when more sophisticated models are applied53,54. This paper highlights some examples on the use of contrast variation for studies of collective dynamics in biomimetic membranes and select membrane features.
In the Protocol, step 1.1 was updated from:
For bending fluctuation measurements, make fully protiated liposomes in D2O (D 99.9%) or D2O-buffer (e.g., phosphate buffer prepared with D2O instead of H2O). Use fully protiated DMPC (C36H72NO8P) and DSPC (C44H88NO8P) with <img alt="Static equilibrium equation, formula involving mass calculation, relevant to educational research." src="/files/ftp_upload/62396/62396eq01v2.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Equation 1"> 133.4 mg, where XDMPC and XDSPC are the mole fractions of DMPC and DSPC, here set to 0.7 and 0.3, respectively, and MwDMPC and MwDSPC are the molar weights given by 677.9 g/mol and 790.1 g/mol, respectively. Similarly, mDSPC = 66.6 mg. This deuteration scheme increases the scattering contrast between the membrane (NSLD ~ 2 × 10-6 Å-2) and the deuterated buffer (NSLD ~ 6.4 × 10-6 Å-2) and amplifies the signal from membrane undulations (see Figure 2A left panel).
to:
For bending fluctuation measurements, make fully protiated liposomes in D2O (D 99.9%) or D2O-buffer (e.g., phosphate buffer prepared with D2O instead of H2O). Use fully protiated DMPC (C36H72NO8P) and DSPC (C44H88NO8P) with <img alt="Static equilibrium equation, formula involving mass calculation, relevant to educational research." src="/files/ftp_upload/62396/62396eq01v2.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Equation 1"> 133.4 mg, where XDMPC and XDSPC are the mole fractions of DMPC and DSPC, here set to 0.7 and 0.3, respectively, and MwDMPC and MwDSPC are the molar weights given by 677.9 g/mol and 790.1 g/mol, respectively. Similarly, mDSPC = 66.6 mg. This deuteration scheme increases the scattering contrast between the membrane (NSLD ~ 0 × 10-6 Å-2) and the deuterated buffer (NSLD ~ 6.4 × 10-6 Å-2) and amplifies the signal from membrane undulations (see Figure 2A left panel).
In the Representative Results, the fist pagargaph was updted from:
NSE studies accessing bending fluctuations are typically performed over a Q-range of ~ (0.04 - 0.2) Å-1. This Q-range corresponds to intermediate length scales between the membrane thickness and the liposomal radius, where bending dynamics dominate. Measurement over an extended Q-range can give access to additional dynamic modes, including liposomal diffusion and intramembrane dynamics. For more details on the cross-over in membrane dynamics accessed by NSE, check these relevant publications25,71. It is important to emphasize that NSE signals are proportional to: <img alt="Coherent scattering equation I_coh(Q,t) - 1/3 I_inc(Q,t) for neutron scattering analysis." src="/files/ftp_upload/62396/62396eq05v2.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Equation 5">, where Icoh and Iinc are, respectively, the coherent and incoherent scattering intensity from the sample. Therefore, it is advisable to prepare NSE liposomal samples in deuterated buffers (i.e., buffers prepared with D2O instead of H2O) to minimize the incoherent scattering signal, mainly contributed by the hydrogen content of the sample. However, in some cases intermediate deuteration schemes (i.e., using mixtures of D2O and H2O) might be necessary to obtain optimal contrast conditions. Typically, NSE measurements of membrane bending fluctuations are performed on fully protiated liposomes in deuterated buffer, referred to as fully contrasted liposomes in Figure 5. This deuteration scheme results in a large NSLD difference between the membrane core (~2 × 10-6 Å-2) and its deuterated fluid environment (~6.4 × 10-6 Å-2), which significantly enhances the scattering signal from the liposomal membranes and improves the measurement statistics of bending dynamics. This contrast scheme (Figure 2A left panel) is frequently utilized in studies of bending rigidity of lipid membranes with single38,72 and multiple39,66 lipid components and in studies of membrane softening/stiffening by biological inclusions (e.g., cholesterol, drug molecules, peptides/proteins)36,37,73,74,75, and synthetic additives (e.g., nanoparticles)76,77.
to:
NSE studies accessing bending fluctuations are typically performed over a Q-range of ~ (0.04 - 0.2) Å-1. This Q-range corresponds to intermediate length scales between the membrane thickness and the liposomal radius, where bending dynamics dominate. Measurement over an extended Q-range can give access to additional dynamic modes, including liposomal diffusion and intramembrane dynamics. For more details on the cross-over in membrane dynamics accessed by NSE, check these relevant publications25,71. It is important to emphasize that NSE signals are proportional to: <img alt="Coherent scattering equation I_coh(Q,t) - 1/3 I_inc(Q,t) for neutron scattering analysis." src="/files/ftp_upload/62396/62396eq05v2.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Equation 5">, where Icoh and Iinc are, respectively, the coherent and incoherent scattering intensity from the sample. Therefore, it is advisable to prepare NSE liposomal samples in deuterated buffers (i.e., buffers prepared with D2O instead of H2O) to minimize the incoherent scattering signal, mainly contributed by the hydrogen content of the sample. However, in some cases intermediate deuteration schemes (i.e., using mixtures of D2O and H2O) might be necessary to obtain optimal contrast conditions. Typically, NSE measurements of membrane bending fluctuations are performed on fully protiated liposomes in deuterated buffer, referred to as fully contrasted liposomes in Figure 5. This deuteration scheme results in a large NSLD difference between the membrane core (~0 × 10-6 Å-2) and its deuterated fluid environment (~6.4 × 10-6 Å-2), which significantly enhances the scattering signal from the liposomal membranes and improves the measurement statistics of bending dynamics. This contrast scheme (Figure 2A left panel) is frequently utilized in studies of bending rigidity of lipid membranes with single38,72 and multiple39,66 lipid components and in studies of membrane softening/stiffening by biological inclusions (e.g., cholesterol, drug molecules, peptides/proteins)36,37,73,74,75, and synthetic additives (e.g., nanoparticles)76,77.
In the Representative Reults, Figure 2 was updated from:
<img alt="Lipid bilayer structures; neutron scattering analysis; molecular arrangement diagram; lipid vesicles." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62396/62396fig2v4.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 2"> 
Figure 2: Examples of possible deuteration schemes in NSE experiments on lipid membranes. (A) Left: Fully contrasted membranes, e.g., protiated membranes in deuterated buffer, showing the NSLD profile along the normal to the membrane surface. The difference in the NSLD between the headgroup (~2 × 10-2 Å-2) and tail region (~4.5 × 10-6 Å-2) of the membrane is due to the headgroup hydration with deuterated buffer. Right: Tail-contrast matched membranes such that the hydrocarbon tail region of the membrane has the same NSLD as the buffer, as shown in the corresponding NSLD profile along the membrane normal. (B) Domain-forming membranes with two neutron contrast schemes where the domains (center) or the matrix (left) are contrast-matched to the buffer, enabling selective studies of matrix or domain dynamics, respectively. This figure has been modified from Nickels et al., JACS 201541. (C) Asymmetric membranes prepared by cyclodextrin exchange between protiated and deuterated lipid vesicles, resulting in the deuteration of one membrane leaflet while keeping the other leaflet protiated. This allows studies of the bending dynamics of the protiated leaflet and provides insights into the mechanical coupling between opposing leaflets in asymmetric membranes. This figure has been modified from Rickeard et al., Nanoscale 202040. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62396/62396fig2v4large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Lipid bilayer diagrams with charts, nanostructure spheres, and membrane model in research context." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62396/62396fig2v5.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 2"> 
Figure 2: Examples of possible deuteration schemes in NSE experiments on lipid membranes. (A) Left: Fully contrasted membranes, e.g., protiated membranes in deuterated buffer, showing the NSLD profile along the normal to the membrane surface. The difference in the NSLD between the tail region (~0 × 10-2 Å-2) and headgroup region (~4.5 × 10-6 Å-2) of the membrane is due to the headgroup hydration with deuterated buffer. Right: Tail-contrast matched membranes such that the hydrocarbon tail region of the membrane has the same NSLD as the buffer, as shown in the corresponding NSLD profile along the membrane normal. (B) Domain-forming membranes with two neutron contrast schemes where the domains (center) or the matrix (left) are contrast-matched to the buffer, enabling selective studies of matrix or domain dynamics, respectively. This figure has been modified from Nickels et al., JACS 201541. (C) Asymmetric membranes prepared by cyclodextrin exchange between protiated and deuterated lipid vesicles, resulting in the deuteration of one membrane leaflet while keeping the other leaflet protiated. This allows studies of the bending dynamics of the protiated leaflet and provides insights into the mechanical coupling between opposing leaflets in asymmetric membranes. This figure has been modified from Rickeard et al., Nanoscale 202040. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62396/62396fig2v5large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62396">Neutron Spin Echo Spectroscopy as a Unique Probe for Lipid Membrane Dynamics and Membrane-Protein Interactions</a>. The Introduction, Protocol, and Representative Results sections have been updated.

Erratum: Neutron Spin Echo Spectroscopy as a Unique Probe for Lipid Membrane Dynamics and Membrane-Protein Interactions

細胞膜とその機能の理解は、ここ数十年で著しく進化してきました。細胞境界とハウス膜タンパク質1を定義する受動脂質二重層としての細胞膜の以前の見解は、細胞シグナル伝達、分子交換、およびタンパク質機能を含む重要な生物学的プロセスを調節する上で脂質二重層が重要な役割を果たす動的モデルへと変貌し、2、3、4、5、6と称する。細胞膜は非常に動的であり、常に再形成と分子再分配を受けているという認識は、膜7、8、9の平衡構造を超えた科学的探求を促している。したがって、生物学的およびバイオアインスパイアされた脂質膜の様々な動的モードを研究するために、複数のアプローチが開発されてきました。現在までに、これらの研究の大半は、主に拡散性分子運動10、11、12、13および巨視的形状変動14、15、16に焦点を当て、中間膜ダイナミクス、すなわち脂質分子の数10〜100sからなる脂質集合体の集合的変動を理解する上で大きなギャップを残している。これらのダイナミクスは、数十から数100Åの長さのスケールと数百nsに対する時間スケール(図1を参照)で発生します。これらのスケールでは、主要な生物学的活性が膜レベル17で行われます。これには、ウイルスの出芽18、チャネル・ギャティング19、および膜タンパク質相互作用20が含まれる。また、膜タンパク質21,22のエネルギーランドスケープは、タンパク質の立体構造変化(その調節的役割に必要)が集団膜変動のns時間スケール23で起こることを示し、細胞膜の生物学的機能におけるメソスコピックダイナミクスの重要性をさらに強調することを指摘する。本論文では、脂質膜における2つの主要なメソスコピック動的モード、すなわち曲げ変動と厚さ変動に焦点を当てています。
これらの変動モードを直接探査する際の主な課題は、標準分光法を用いて空間的スケールと時間スケールに同時にアクセスすることの難しさです。もう一つの課題は、直接接触技術が16を測定するために意図されているのと同じ変動に影響を与える可能性があるということです。これは、生物学的膜24,25の組成および構造の複雑さによってさらに悪化し、脂質ドメイン形成26、27、28、29、30および膜非対称性31、32、33を含む非均質な膜特徴を生じ、異なる膜特徴のダイナミクスを理解するための選択的プローブを要求する。幸いなことに、これらの課題は、本質的に必要な長さと時間スケールにアクセスする中性子スピンエコー(NSE)のような非侵襲的な中性子分光法法で克服することができ、さらにそれらの物理化学的環境34を変更することなく、選択的膜特徴の研究を可能にする。実際、ここ数年NSE分光法は、集団膜動態35のユニークで強力なプローブに進化しました。脂質膜に関するNSE研究の結果は、機械的36、37、粘弾性38、脂質膜の39の特性に新たな洞察を生み出し、生物学的機能40,41におけるその潜在的役割に新たな光を当てた。
NSE分光法は、メゼイ42が最初に提案した干渉計器の設計に基づいており、一連のスピンフリッパーと磁気コイルを使用して中性子が機器を横断する中性子スピンの歳差を制御します。この設計は、サンプル位置に対する磁界要素の磁気ミラーリングにかかっています(図1A)。これは、中性子と試料の間のエネルギー交換がない場合、中性子は、装置の最初と後半に反対方向に同じ数のスピン歳差を実行することを意味します(2つの歳差コイル間のπフリッパーに注意してください)。その結果、中性子の最終的なスピン状態は、初期状態に対して変化しないままである-スピンエコーと呼ばれる現象(図1Aの透明中性子を参照)。しかし、中性子がサンプルとエネルギー相互作用すると、エネルギー交換によって装置の後半のスピンの間圧数が変わり、最終的なスピン状態が異なる(図1Aを参照)。これは、この論文の後半で示されるように、偏光の損失として実験的に検出される。NSEテクニックの詳細については、専用の技術論文42、43、44、45を参照してください。
ここでは、NSEでアクセス可能な長さと時間スケールの概算を提供する簡単な説明を提示します。長さスケールは、達成可能な波ベクトル伝達の範囲によって決定され、Q = 4π sinθ/λ、2θは散乱角、λは中性子波長である。Qが分光計の第2アームの波長範囲と回転の程度によって設定されていることがわかります(図1Aを参照)。NSE分光計の典型的なQ-範囲は、〜0.02-2 Å-146、47、および最近のアップグレード48、49で0.01-4 Å-1まで、〜1-600 Åの空間スケールに対応しています。一方、アクセス可能な時間スケールは、磁気陽イオンコイル内で中性子が獲得した総歳差角(または位相)から計算され、50: と見なされます <img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/62396/62396eq12v5.jpg"> 。この式では、tは、 <img alt="Equation 13" src="/files/ftp_upload/62396/62396eq13v2.jpg"> <img alt="Equation 50" src="/files/ftp_upload/62396/62396eq50v2.jpg"> 中性子ジャイロ磁性比、 <img alt="Equation 51" src="/files/ftp_upload/62396/62396eq51v6.jpg"> コイル長、および <img alt="Equation 52" src="/files/ftp_upload/62396/62396eq52v6.jpg"> コイルの磁場の強さとして定義されるフーリエ時間です。フーリエ時間は、計測器の形状、磁場強度、中性子波長に厳密に依存する量であることを指摘する価値があります。例えば、波長=8Åの中性子 <img alt="Equation 70" src="/files/ftp_upload/62396/62396eq70v6.jpg"> と <img alt="Equation 51" src="/files/ftp_upload/62396/62396eq51v6.jpg">   =1.2mと <img alt="Equation 52" src="/files/ftp_upload/62396/62396eq52v6.jpg"> =0.4Tの計器設定を使用して、フーリエ時間はt~50nsと計算されます。 実験的には、フーリエ時間は、p景気後退コイルの電流(すなわち、磁場強度)を変化させることによって調整されるか、異なる中性子波長を使用して、〜1 ps〜100nsの典型的なNSE時間スケールをもたらす。しかし、NSE分光計の最近のアップグレードにより、より長いフーリエ時間へのアクセスが可能になりました。 オークリッジ国立研究所48のハインツ・マイヤー・ライプニッツ・ツェントルム51とSNS-NSE分光計のJ-NSE-フェニックス分光計では約~400ns、インスティトゥート・ラウ・ランゲビン(ILL)のIN15 NSE分光計では最大1,000nsまで。 
膜動態の長さと時間スケールへの直接アクセスに加えて、NSEは中性子体同位体感度52の固有の能力を有する。具体的には、生物系において最も豊富な元素である水素同位体と異なった相互作用をする中性子の能力は、プロトニウムが重水素によって置換される場合に、異なる中性子散乱長さ密度、34またはNSLD(屈折の光学インデックスに相当する)をもたらす。これにより、特定の膜の特徴を強調したり、他の特徴を隠すために一般的に使用されるコントラストバリエーションと呼ばれるアプローチが可能になります。コントラスト変動/一致の頻繁な適用は、水の置換です (NSLD = -0.56 × -0.56 × 10-6 Å-2)重水またはD2O (NSLD = 6.4 × 10-6 Å-2)を使用して、プロチアード脂質膜からの中性子信号を増幅します (NSLD ~ 0 × 10-6 Å-2)。このアプローチは、膜のヘッドグループ領域へのD2Oの浸透が膜の厚さ(図2A、左パネルを参照)および異なる脂質サブグループの位置をより高度なモデルが適用される53,54の正確な決定を可能にするので、膜構造の研究において非常に効果的である。本論文では、バイオミメティック膜の集合的ダイナミクスの研究におけるコントラスト変動の使用と、膜の特徴の選択に関する例をいくつか強調する。
ここでは、動的および機能的膜特性に関する独自の洞察を提供するNSEの有効性を、リポソーム懸濁液の形態で自立膜中質動態に重点を置いたモデルおよび生物学的に関連する脂質膜系に関するNSE研究の具体的な例を通して示されている。面内膜ダイナミクスのNSE測定では、読者は放牧発生率中性子スピンエコー分光法(GINSES)55、56および整列した多層膜スタック57、58、59、60の他の研究に関する専用の出版物と呼ばれる。
簡潔にするために、この論文は、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DMPC)および1,2-distearoyl-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DSPC)混合物の十分に研究されたドメイン形成、または相分離の脂質二重層系に示された3つの異なる膜重膜スキームを強調する。2つの脂質は、炭化水素鎖長(DSPCの18炭素/テールの14炭素/テール)とゲル流体転移温度(Tm、DMPC = 23°C対Tm、DSPC=55°C)の不一致が特徴です。この結果、DMPC:DSPC膜における、混合物63の上下遷移温度間の温度における横相分離が生じる。ここで考慮される重曲スキームは、リポソーム膜のNSE測定でアクセス可能なさまざまな動的モード、すなわち、曲げ変動、厚さ変動、および側面ドメインの選択的曲げ/厚さ変動を実証するために選択されます。DMPC:DSPCバイレイヤーは、DMPCとDSPCの商業的に入手可能なプロティエートおよび透過型の変異体を使用して、70:30のモル画分で調製されたDMPC:DSPC二重層について報告されます。すべてのサンプル調製ステップは、4 mLのリポソーム懸濁液に基づいており、D2Oでは、50mg/mLの脂質濃度を有し、全脂質質量のMtot= 200mgの試料に基づいている。

<table><tbody><tr><td>クロロホルム(バイオテクノロジーグレード)</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>496189</td><td>バイオテクノロジーグレード、&ge;99.8%、安定剤として0.5-1.0%のエタノールが含まれています</td></tr><tr><td>循環水浴</td><td>Julabo</td><td>SE-12</td><td>スマートポンプ付き加熱サーキュレーター、プログラム可能な温度設定、および測定と制御のための外部センサー接続</td></tr><tr><td>酸化重水素</td><td>ケンブリッジ同位体研究所</td><td>DLM-4</td><td>重水素化水;重水 (D2O) (D, 99.9%)</td></tr><tr><td>デジタルセミミクロ天びん</td><td>メトラー・トレド</td><td>MS105</td><td>セミミクロ天びん、ひょう量120g、最小表示0.01mg、高分解能計量セル、人間工学に基づいたドア、ピペットチェックアプリケーション</td></tr><tr><td>エタノール(分子生物学グレード)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023</td><td>分子生物学アプリケーション用200プルーフエタノール</td></tr><tr><td>ガラスピペットVWR</td><td></td><td>36360-536</td><td>使い捨てソーダライムガラス パスツールピペット</td></tr><tr><td>ガラスバイアル</td><td>Thermo Scientific</td><td>B7990-1</td><td>PTFE/シリオンセプタムキャップ付きホウケイ酸ガラスバイアル</td></tr><tr><td>ラボグレードの冷凍庫</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>IU2886D</td><td>脂質およびタンパク質の長期保存用超低温冷凍庫(-86〜-50°C)</td></tr><tr><td>脂質(プロテイテッドまたは過重化)</td><td>Avanti Polar 脂質</td><td>は脂質</td><td>によって異なります脂質は、Avantiから粉末状または必要な量と重水素化スキームのクロロホルム溶液で購入できます。</td></tr><tr><td>ミリポア浄水器</td><td>ミリポアシグマ</td><td>ZRQSVP3US</td><td>Direct-Q&reg;&nbsp;3 UVランプを内蔵した純水と超純水の両方を供給するUV浄水システムにより、生物学的な有機物のレベルを低減します&nbsp;アプリケーション</td></tr><tr><td>ミニ押出機セット</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610020</td><td>ミニ押出機セットには、ミニ押出機、加熱ブロック、ガスタイトシリンジ2個、Oリング2個、ポリカーボネートメンブレン、フィルターサポート</td></tr><tr><td>が含まれています クイックコネクト継手</td><td>グレイン</td><td>ジャー2YDA1および2YDA7</td><td>クイックコネクト水循環アプリケーション用チューブ継手(例:高温小胞押出シ</td></tr><tr><td>リンジポンプ</td><td>)SyringePump.com</td><td>New Era-1000</td><td>注入および回収用の完全にプログラム可能なシリンジポンプ、最大41のポンプフェーズをプログラムし、ポンプ速度、分注量、および押出サイクルを調整可能</td></tr><tr><td>超音波浴</td> フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>CPX2800</td><td>脱気および超音波アプリケーション用のプログラム可能な機能を備えた温度制御超音波浴</td></tr><tr><td>真空オーブン</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>3608</td><td>0.7 cu ft 真空オーブン、高限界サーモスタット内蔵、過熱防止</td></tr><tr><td>ボルテックスミキサー</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>02-215-414</td><td>可変速度、アナログ制御により、穏やかな振とうのための低回転始動や、サンプルの激しい渦巻きのための高速混合が可能</td></tr></tbody></table>

脂質膜動態と膜タンパク質相互作用に対するユニークなプローブとしての中性子スピンエコー分光法

Neutron Spin Echo Spectroscopy as a Unique Probe for Lipid Membrane Dynamics and Membrane-Protein Interactions

脂質二重層は細胞膜の主なマトリックスを形成し、栄養素交換、タンパク質膜相互作用、およびウイルスの芽出しのための主要なプラットフォームであり、他の重要な細胞プロセスの中で。効率的な生物学的活性のために、細胞膜は細胞とそのコンパートメントの完全性を維持するのに十分な剛性でありながら、タンパク質および機能ドメインなどの膜成分が拡散し相互作用するのに十分な流体であるべきである。弾性と流体膜の特性の微妙なバランス、および生物学的機能への影響は、膜の変形やタンパク結合イベントなどの主要な生物学的プロセスのメソスコピック長さと時間スケールに対する集合的な膜ダイナミクスのより良い理解を必要とします。このダイナミックレンジを効果的に探査できる技術の中には、中性子スピンエコー(NSE)分光法があります。重水素ラベリングと組み合わせることで、NSEは、曲げや厚さの変動だけでなく、選択された膜の特徴のメソスコピックダイナミクスに直接アクセスするために使用することができます。本論文では、NSE技術の簡単な説明を提供し、サンプル調製および重水素化スキームの詳細を含むリポソーム膜に関するNSE実験を行う手順と、データ収集と削減の手順を概説する。また、曲げ剛性率、面積圧縮率、面内粘度などの主要な膜パラメータを抽出するためのデータ解析方法も紹介しています。NSE研究の生物学的重要性を説明するために、NSEによってプローブされた膜現象の選択例、すなわち、膜曲げ剛性に対する添加剤の影響、膜の変動に及ぼすドメイン形成の影響、および膜-タンパク質相互作用の動的シグネチャについて考察する。

ベンド変動にアクセスするNSE研究は、通常、~(0.04 - 0.2)Å-1のQ範囲で行われます。このQ範囲は、膜の厚さとリポソーム半径の中間長さスケールに対応し、曲げダイナミクスが支配的です。拡張されたQ-範囲を超える測定は、リポソーム拡散および膜内動態を含む追加の動的モードへのアクセスを提供することができる。NSEがアクセスする膜動態のクロスオーバーの詳細については、これらの関連資料25,71を参照してください。NSE信号は、 <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/62396/62396eq05v2.jpg"> 私と私のincがそれぞれ、サンプルからの一貫性と支離滅裂な散乱強度であるに比例していることを強調することが重要です。したがって、NSEリポソームサンプルを重水素化緩衝液(すなわち、H2Oの代わりにD2Oで調製した緩...

本論文では、脂質膜の中性子スピンエコー(NSE)研究におけるサンプル調製、データ削減、データ解析のプロトコルについて述べる。脂質の重水素標識は、重要な生物学的プロセスが起こるメソスコピック長および時間スケール上の異なる膜動力学へのアクセスを可能にする。

Lipid bilayers form the main matrix of cell membranes and are the primary platform for nutrient exchange, protein-membrane&#160;interactions, and viral ...

このプロトコルは、生物学的機能との関連性の集合的な膜変動と脂質膜の実用化に関する中性子スピンエコー研究の成功に必要なサンプル調製とデータ削減について説明する。NSEは、他の技術ではアクセスできない選択的膜特徴を探査するための同位体感度のユニークな利点を持つ主要な膜機能のナノ秒のタイムスケール上の膜ダイナミクスに直接アクセスします。ナノスケールにおける膜動態の研究は、様々な細胞病理に関係する分子機構の基礎となる膜特性および膜-タンパク質相互作用を理解するために不可欠である。この方法は、NSEに新しい研究者に、実験の成功とその後のデータ削減分析と解釈のための脂質小胞の設計、準備、特徴付けに関する詳細なガイドラインを提供します。この手順のデモンストレーションは、テシャニ・クマージュとジュリー・グエン、大学院生と研究室の学部生になります。フードの内部で作業し、正確に秤量した脂質を1ミリリットルの溶媒に手動混合で溶解して脂質懸濁液を調製します。不活性ガスをバイアル内でゆっくり流しながら、脂質溶液をゆっくり回転させて乾燥させます。残留溶媒を完全に除去するには、バイアルを摂氏35度の真空オーブンに一晩置きます。翌日、重水2ミリリットルで脂質膜を水和し、1ミリリットル当たり50ミリグラムの脂質濃度を得、水和脂質懸濁液をボルテックスして、脂質膜が完全に溶解するまで水和した脂質懸濁液を得る。次に、水分補給脂質懸濁液のバイアルをマイナス80°Cで凍結するまで保存して、5回凍結融解サイクルを行う。そして、脂質懸濁液を解凍するために摂氏35度の水浴にそれを移す。次のサイクルに進む前に均質になるまで解凍懸濁液を渦液。実験を開始する前に、2つの膜支持体の間にポリ炭酸塩膜を使用して押出機のセットアップを組み立て、各側に2つのペーパーフィルターを追加してサポートを追加します。気密性ガラス注射器を使用して、膜アセンブリを通して0.3ミリリットルの重水を数回通過させることで、ポリカーボネート膜を水和します。膜を水和した後、調製した乳白色の脂質溶液を備えた1ミリリットルの気密注射器を一端に挿入し、空のシリンジを押出機装置の反対側端に挿入します。シリンジが接続されたら、アセンブリを押出機ブロックに配置します。[Rate]ボタンを押したまま押し出し速度を入力し、[直径]ボタンを押してシリンジ径を入力してポンプをプログラムします。次に、ライトが点灯するまで[取り消す]を押します。start を押して、サンプルが空のシリンジに分配し始めるのを待ちます。サンプルの注射器が完全に空になる直前に、停止ボタンを押します。分配されたボリュームを記録し、フェーズ1が画面に表示されるまでRateボタンを押したままにします。取り出しのライトをオフにしたまま、ボリュームボタンを押して、先ほど録音した分配ボリュームを入力します。もう一度 Rate ボタンを押し、フェーズ 2 にアクセスするには、最も上矢印を使用します。ボリュームを押して、先ほど記録した分配ボリュームの同じ値を入力します。このフェーズでは、取り消しライトが点灯するまで[取り消し]ボタンを押します。LP:SE が画面に表示されるまで音量ボタンを押してフェーズ3のサイクルを繰り返し、20 に設定します。最後に、Rateボタンを押してフェーズ4にアクセスし、音量ボタンを押して停止機能に到達し、ポンプのセットアップを完了します。ポンプがプログラムされたら、押し出しサイクルを開始するために開始を押します。15~20回押し出しサイクルを行ってから、透明なオパールブルーの押出脂質懸濁液をクリーンバイアルで回収して測定を行います。DAVEソフトウェアを開き、データ削減メニューからNSEデータを減らすを選択します。ファイルメニューからエコーファイルを開くを使用して、異なるQ値でデータファイルをアップロードします。アップロードされたファイルは、使用可能なデータセットの下に表示されます。選択したファイルを右クリックし、それに対応する測定に従ってラベルを付けます( [サンプル]、[セル]、または [解像度])。[データセット]タブを使用して、検出器のピクセルを2 X 2でグループ化して、信号対雑音比を改善します。解像度、セル、およびサンプルのすべてのファイルに同じビンを適用します。すべてのピクセルグループのデータを検査し、キーボードのEndキーを押して、信号が悪いデータをマスクします。Enter キーを押してポップアップ ウィンドウにアクセスし、4 つの時間すべてに同じマスクを適用します。マスクされたピクセルは緑色に変わります。収集されたデータがエコー信号の形式であることを確認します。アップロードしたファイルリストから解像度ファイルのフィッティングを開始するには、目的のファイルを右クリックし、ポップアップメニューから「フィット操作」「エコーの解像度にフィット」を選択します。エコー信号の適合が適切なパラメータを得ることを確認します。検出器全体で各継ぎ手パラメータに関連付けられたエラーを検査するには、[イメージ オプション]を選択し、目的の継ぎ手パラメータを選択します。次に、検出画像を右クリックして、エラーバーマップを示すポップアップウィンドウにアクセスします。特定のピクセルに対するフィット感が不十分な場合は、そのピクセルを選択し、[フィッティング]タブを押して[フィット ピクセル]を押して、そのピクセルの上に信号を再フィットします。[継ぎ手]タブで、フェーズと期間の新しい開始パラメータを入力します。アップロードされたファイルリストとラベル付きファイルリストから対応するファイルを選択して、サンプルファイルを削減します。すべてのピクセルを検査し、上記のように貧弱なものをマスクします。次に、ファイルを右クリックし、フィット操作、フェーズのインポートを選択します。解像度ファイルの場合は、前に説明したとおりに、周期の値を変更せずにエコー信号にフィットし、解像度から読み込んだエコーフェーズポイントをフィットさせます。[一般]タブにアクセスし、実験から記録された X および Y のビーム中心値を入力して、すべてのデータ ファイルのビーム中心を入力します。適合が完了したら、適合ファイルのリストから目的のサンプルファイルを右クリックし、ポップアップメニューから「Q のIを計算」を選択して、正規化された中間スキャッタリング関数を計算します。解像度ファイルとセルファイルに必要な情報と、ポップアップウィンドウにQ-arcsの数を入力し、[OK]を押して結果を表示します。シアンのデータは、検出部のエッジ効果による信号が悪く、異なるQデータセットをコンパイルする際に除去する必要があることに注意してください。最後に、削減されたデータ・セットを ASCII ファイルとして保存し、セッション全体を DAVE プロジェクトとして目的のフォルダーに保存します。本研究では、異なる重水素化スキームで調製したリポソームサンプルのNSE測定を行った。膜屈曲の変動のNSE測定は、完全に対照的なリポソームに対して行われる。この重水素化スキームは、膜コアと重水素化流体環境との間に大きな散乱長差をもたらし、リポソーム膜からの散乱信号を有意に増強し、曲げダイナミクスの測定統計を改善する。一方、リポソームの膜厚変動のNSE測定では、曲げ変動の第3依存性に対するQに対する偏差が示される。厚さゆら信号を分離するために、得られた信号をQで3番目に分割し、過剰なダイナミクスがQ.のローレンツィアン関数に適合します。NSEが調査するダイナミクスは、重水素NMRリラクソーム法と分子動的シミュレーションによって相乗的に探求され、分子脂質構造とパッキングモチーフが膜機能にどのような影響を与えるかを示すことができます。NSEの脂質膜に関する研究は、膜生物物理学、膜構造とダイナミクスの複雑な関係、およびそれらが膜機能および膜タンパク質相互作用にどのように影響するかを新たな光を当てた。

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JoVE Journal

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生物学

この記事では、電子常磁性共鳴研究のためのサイト指向スピンラベリングと五量体配位子依存性チャネルの再構成の方法について説明します。このプロトコールは、あらゆる膜タンパク質に適合させることができます。ここで説明する再構成法は、定義された脂質システムにおける巨視的電流および単一チャネル電流のパッチクランプ測定にも使用できます。...

サイト監督スピン標識および五量体リガンド依存性イオンチャネルのEPR分光研究

多くのタンパク質は、膜表面に付着するとその機能を果たします。ナノディスク膜上の外因性タンパク質の結合は、透過型電子顕微鏡によって間接的に画像化することができます。我々は、ネガティブ染色のリンスホタングステン酸ナトリウムによって誘発されるナノディスクの特徴的なスタッキング(rouleau)が、外部タンパク質の結合によって防止されることを示す。...

透過型電子顕微鏡により膜相互作用タンパク質を視覚化し、分析するための方法

このプロトコルは、低解像度第一原理計算モデルと洗剤のコントラストが一致する中性子小角散乱法を用いたソリューションの洗剤可溶化膜蛋白質の構造の詳細を取得する方法を示します。...

膜蛋白質の構造解析および経験的モデリング中性子小角散乱実験でコントラストに一致する洗剤

ここでは、プロトコルを提案単一リポソームの脂質膜を渡るプロトン透過の分子機構の研究例としてシトクロムbo3を使用します。電気化学、蛍光顕微鏡、単一小胞、含む単一または複数の酵素のルーメン内の pH...

電気化学と蛍光顕微鏡を用いたプロトン ポンプ膜酵素の研究のための単一リポソーム測定

本プロトコルは、ヒトの健康に重要な役割を果たす2つのモデルタンパク質の構造および動態を調査するための方法を記載する。この技術は、ベンチトップの生物物理学的特性評価と中性子スピンエコー分光法を組み合わせて、タンパク質のドメイン間運動に関連する時間と長さのスケールでのダイナミクスにアクセスします。...

中性子スピンエコー分光法 による タンパク質ダイナミクスの研究

このプロトコルは、小角中性子散乱測定中に複数の液体溶液を その場 で迅速に混合し、ナノメートルの長さスケールと秒の時間スケールで運動過程を研究するために、ストップフローサンプル環境の使用を提示します。...

ストップフローと小角中性子散乱によるナノスケール材料の時間発展の測定

このプロトコルは、iSCATベースの画像処理と単粒子追跡アプローチを記述し、脂質膜と相互作用する高分子の分子量と拡散挙動の同時調査を可能にします。サンプル調製、質量コントラスト変換、ムービー取得、および後処理に関するステップバイステップの手順が、潜在的な落とし穴を防ぐための指示とともに提供されます。...

膜関連高分子ダイナミクスを特徴付けるための質量感受性粒子追跡

中性子後方散乱分光法は、タンパク質とその水和水のps-nsダイナミクスへの非破壊でラベルフリーのアクセスを提供します。このワークフローには、アミロイドタンパク質に関する2つの研究、すなわち凝集中のリゾチームの時間分解ダイナミクスと、繊維形成時のタウの水和水ダイナミクスに関する研究が提示されています。...

タンパク質と水和水のピコ秒ナノ秒ダイナミクスを研究するための高分解能中性子分光法

本記事では、固体支持脂質二重層における単一タンパク質追跡用のサンプル作成方法を詳しく説明します。また、単一分子感度と高速フレームレートを持つシンプルな蛍光顕微鏡の説明もします。最後に、単一タンパク質の軌跡抽出手順を概説します。...

蛍光顕微鏡を用いた脂質二重層中の単一タンパク質の追跡

グラミキシジンAドープされた液滴界面二重層を組み立て、電気刺激し、解析する実験プロトコルを提示します。脂質-タンパク質の構造-機能関係は、膜面積、イオンフラックス、単一チャネル伝導の変化を測定し、これらの応答を電気シナプスに着想を得た膜モデルにおける可塑性様のイオン伝導変化と関連付けることで定量化されます。...

液滴界面二重層を用いた脂質-タンパク質膜構造-機能の特徴解析

学ぶ中性子スピンエコー分光法を用いた脂質膜動態の解析手法。ナノ秒スケールの膜変動と膜タンパク質相互作用を測定し、膜バイオ物理学の理解を深めるためのデータ収集・解析プロトコルを解説します。

脂質膜動態と膜タンパク質相互作用に対するユニークなプローブとしての中性子スピンエコー分光法

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