Name: 細胞外小胞の定量とサイズ決定のためのナノ粒子追跡解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: 学ぶ ナノ粒子追跡解析による細胞外小胞の定量とサイズ決定の標準化手法。マウス脂肪組織とヒト血漿を用いた検証により、再現性のある測定とオペレーターバイアスの低減を実現します。

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この研究は、国立衛生研究所(ES030973-01A1、R01ES025225、R01DK066525、P30DK026687、P30DK063608)によってサポートされました。私たちは、HORIBAインスツルメンツ株式会社のジェフリー・ボディコム博士が楽器の校正を支援した場合に認めます。

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<li>Bachurski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicle+measurements+with+nanoparticle+tracking+analysis+-+An+accuracy+and+repeatability+comparison+between+NanoSight+NS300+and+ZetaView%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicle measurements with nanoparticle tracking analysis - An accuracy and repeatability comparison between NanoSight NS300 and ZetaView.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1596016(2019).</li>
<li>Varga, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hollow+organosilica+beads+as+reference+particles+for+optical+detection+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Hollow organosilica beads as reference particles for optical detection of extracellular vesicles.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16, 1646-1655 (2018).</li>
<li>Serrano-Pertierra, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles%3A+Current+analytical+techniques+for+detection+and+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles: Current analytical techniques for detection and quantification.</a> Biomolecules. 10, (2020).</li>
<li>Maguire, C. M., Rösslein, M., Wick, P., Prina-Mello, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+particles+in+solution+-+a+perspective+on+light+scattering+and+comparative+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Science+and+Technology+of+Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Characterisation of particles in solution - a perspective on light scattering and comparative technologies.</a> Science and Technology of Advanced Materials. 19, 732-745 (2018).</li>
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すべての著者は、利益相反はないと宣言しました。

ここでは、幅広い粒子サイズのサイズ分布を同時に測定し、多分散サンプル中の全EV濃度を測定するためのプロトコルを示す。本研究では、マウスのペリゴナリ脂肪組織およびヒト血漿をEVの供給源として使用した。しかし、血清、尿、唾液、母乳、羊水、細胞培養上清などの他の組織または生物学的液体から隔離されたEVもNTAに使用され得る。ポリスチレンビーズ規格の測定により、装置が適切に校正され、このNTA機器がナノ粒子≤400 nmのサイズを正しく測定できることを実証しました。次いで、マウス組織EV試料の各種希釈を試験した。 図9に示すように、報告された粒子濃度は、希釈因子に応じて、予想通りにスケールし、器具が技術的複製間の変動性をほとんどなく様々な希釈で粒子濃度を正確に検出できることを実証する。しかし、これは、機器の働く範囲内の粒子濃度(5 x 106〜2 x 108 mL)で作業する場合でした。適切に希釈するサンプルは、プロトコルの重要なステップです。希釈係数の調整は、サンプルの総粒子濃度に対してほぼ同じ推定値を生み出し、4つの希釈液全体で15.1の...

細胞外小胞(EV)は、ほぼ全ての細胞タイプ1によって分泌される小さな(0.03〜2 μm)膜結合小胞である。放出のメカニズムとサイズ2に応じて、「エキソソーム」、「微小胞」、「アポトーシス体」と呼ばれることがよくあります。当初は、EVは単に細胞から廃棄物を除去して恒常性3を維持する手段であると考えられていたが、DNA、RNA(mRNA、マイクロRNA)、脂質、タンパク質4、5を含む分子物質の伝達を介した細胞間コミュニケーションにも参加することができ、正常な生理学の重要な調節因子であり、病理学的プロセス1である。 5、6、7、8.
EV を分離および定量化する方法は多数ありますが、これは他の場所で説明されている 9 、 10、11、12です。EVの供給源と同様に使用される絶縁プロトコルは、EVの歩留まりと純度に大きな影響を与える可能性があります。微分遠心分離でさえ、長い間エキソソーム単離のための「ゴールドスタンダード」アプローチと考えられ、その後得られたEV集団および下流分析13に影響を与える大きな変動を受けうる。したがって、EVの分離および定量化のための様々な異なる方法論は、文献14で報告された実験の結果を比較、再現、および解釈することを困難にする。さらに、EV放出は、細胞状態または種々の外的要因によって調節することができる。細胞内ストレス15から細胞を保護することによって細胞恒常性を維持する役割を果たすEVが示唆されている。例えば、低酸素、小胞体ストレス、酸化ストレス、機械的ストレス、タバコの煙抽出物、および粒子状物質の大気汚染16、17、18、19、20、21、22への細胞暴露後にEV放出の増加が報告されている。EV放出はまた、生体内で変更することが示されている;高脂肪食や断食を16時間受けたマウスは、より多くの脂肪細胞EV23を放出した。特定の治療や状態がEV放出を変えるかどうかを調べるには、EVの数を正確に特定する必要があります。EVサイズ分布の評価はまた、EVの主要な細胞内起源(例えば、後期子宮体/多面体と原形質膜の芽出との融合)24を示す。したがって、研究されているEV準備の総濃度とサイズ分布を正確に測定するための堅牢な方法が必要です。
ソリューションにおけるEVの可視化と特性評価のための迅速かつ高感度な方法は、ナノ粒子追跡解析(NTA)です。この方法の原理の詳細な説明とEVサイズと濃度の評価のための代替方法との比較は、前に説明された25、26、27、28。簡単に言えば、NTA測定中に、EVはレーザー光を照射したときに散乱する光によって視覚化されます。散乱光は、粒子の動きを記録するカメラに顕微鏡で焦点を当てます。NTA ソフトウェアは、各パーティクルのランダムな熱運動を追跡し、ストークス-アインシュタイン方程式を使用して各粒子のサイズを計算するために使用される拡散係数を決定します。NTAは201125年に初めて生体試料中のEV測定に適用された。最近まで、商用NTA機器29を提供する主流企業は、他のNTA技術の大幅な制限を克服するために新しいハードウェアとソフトウェアソリューションの組み合わせを使用するViewSizer 3000(以下、粒子追跡機器と呼ばれる)の導入までしかありませんでした。
粒子追跡装置はブラウン運動を分析することによって液体サンプル中のナノ粒子を特徴付け、重力沈降を分析することによってより大きいミクロンサイズの粒子を特徴付ける。この装置独自の光学系は、3つのレーザー光源(450 nm、520 nm、635 nm)を備えたマルチスペクトル照明を含み、研究者は幅広い粒子サイズ(例えば、エキソソーム、マイクロベシクル)を同時に分析することを可能にします。機器のセットアップの概略を図 1に示します。
ここでは、新しいNTA機器を用いて、単離したマウスやヒトEVの粒子径分布と濃度測定を行う方法を示す。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62447/62447fig01.jpg"> 図1:粒子追跡計光学系 NTAの器械は次の波長の3つのレーザーを使用して粒子を照らす:450 nm、520 nm、635 nm。個々の粒子からの散乱光のビデオ録画は、キュベットから90°指向のデジタルビデオカメラによって検出され、追跡されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62447/62447fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

<table><tbody><tr><td>1X dPBS</td><td>VWR</td><td>02-0119-1000</td><td>サンプルを希釈するには</td></tr><tr><td>100 nm ビーズ標準</td><td>Thermo Scientific</td><td>3100A</td><td>ViewSizer 3000 キャリブレーションをテストするには</td></tr><tr><td>400 nm ビーズ標準</td><td>Thermo Scientific</td><td>3400A</td><td>テストするには ViewSizer 3000 キャリブレーション</td></tr><tr><td>遠心フィルターユニット</td><td>Amicon</td><td>UFC901024</td><td>PBS 希釈液をろ過</td></tr><tr><td>するには 収集チューブ、2 mL</td><td>Qiagen</td><td>19201</td><td>ヒト血漿細胞外小胞の分離用</td></tr><tr><td>圧縮空気ダスター</td><td>ダストオフ</td><td>DPSJB-12</td><td>キュベットを洗浄するには</td></tr><tr><td>キュベットインサート</td><td>HORIBA</td><td></td> <td>Scientific-ViewSizer 3000</td></tr><tr><td>Cuvette jig</td><td>HORIBA Scientific</td><td>-</td><td>キュベット内にインサートを配置しながら磁気攪拌バーを整列させるため;ViewSizer 3000</td></tr><tr><td>脱イオン水</td>の購入時に提供 <td>VWR</td><td>02-0201-1000</td><td>キュベットをクリーニングするには</td></tr><tr><td>モニター、キーボード、マウス、および必要なすべてのケーブルを備えたデスクトップコンピュータ</td> <td>Dell-ViewSizer</td> <td>3000</td><td></td></tr> <tr><td>エタノール (70-100%)</td> <td>ミリポアシグマ</td>の購入時に提供 <td>-</td> <td>キュベットをクリーニングするには</td></tr><tr><td>ExoQuick ULTRA</td><td>System Biosciences</td><td>EQULTRA-20A-1</td><td>ヒト血漿細胞外小胞の分離用</td></tr><tr><td>蓋付きガラスシンチレーションバイアル</td><td>Thermo Scientific</td><td>B780020</td><td>キュベットの洗浄には</td></tr><tr><td>「フック」ツール</td><td>Excelta-ViewSizer</td><td></td> <td>3000の購入により提供</td></tr><tr><td>糸くずの出ないマイクロファイバークロス</td><td>Texwipe</td><td>TX629</td><td>キュベットの清掃と作業面の被覆</td></tr><tr><td>微量遠心チューブ、2mL</td><td>エッペンドルフ</td><td>22363344</td><td>ヒト血漿細胞外小胞の単離用</td></tr><tr><td>攪拌子</td><td>Sp Scienceware</td><td>F37119-0005</td><td></td></tr><tr><td>キャップ付き超石英キュベット</td><td>Agilent Technologies</td><td>AG1000-0544</td><td>当初はViewSizer 3000の購入で提供</td></tr>されました <tr><td>ViewSizer 3000</td><td>HORIBA</td><td></td> <td>Scientific-Nanoparticle Tracking Instrument</td></tr></tbody></table>

細胞外小胞の定量とサイズ決定のためのナノ粒子追跡解析

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

細胞外小胞(EV)の生理学的および病的な役割はますます認識され、EV分野は急速に進化する研究分野となっています。EVの分離には多くの異なる方法があり、それぞれ、EVの下流の収率と純度に影響を与える明確な長所と短所があります。したがって、選択した方法によって所定のソースから分離されたEV準備を特徴付けることは、下流の結果の解釈および実験室間での結果の比較にとって重要である。病気の状態や外部の状態に応じて変化させることができるEVのサイズと量を決定するための様々な方法が存在します。ナノ粒子追跡解析(NTA)は、個々のEVのハイスループット分析に使用される顕著な技術の1つです。ここでは、この分野における大きな進歩を代表するNTAの画期的な技術を用いて、マウスの脂肪組織およびヒト血漿から分離されたEVの定量とサイズ決定のための詳細なプロトコルを提示する。この方法は、透過電子顕微鏡で確認された異なる方法で異なるソースから分離されたEVに対して、再現可能で有効な総粒子濃度およびサイズ分布データを提供できることを実証した。このNTA機器の適応は、EV研究における厳格化と再現性を高めるためのNTA手法における標準化の必要性に対応する。

このデモンストレーションの前に、器具の較正は、ポリスチレンビーズ規格のサイズ分布を測定することによって取得したデータの妥当性を確認するために最初にテストされました。デフォルトの記録パラメータと、このプロトコルで推奨される処理設定を使用して、100 nm および 400 nm のビーズのサイズ分布をテストしました (図 8)。
100 nmポリスチレンビーズ規格では、4.205 x 107粒子 /mLの濃度を測定した。平均(標準偏差、SD)サイズは、変動係数(CV)0.16の102(±17)nmであった。D10/D50/D90の値は76/104/126 nmであった。これは、粒子追跡機器が100nm単分散ビーズのサイズを正確に報告したことを示している。400 nmポリスチレンビーズ規格では、濃度は4.365 x 107粒子 /mLであった。平均(SD)サイズは391(±47)nmで、CVは0.12でした。D10/D50/D90値は150/358/456 nm(表3)...

我々は、新しいナノ粒子追跡解析装置を用いて、マウスの骨膜脂肪組織およびヒト血漿から分離された細胞外小胞のサイズ分布および総粒子濃度を推定する方法を示す。

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...

NTA の結果は、オペレータバイアスが非常に発生しやすいものです。このプロトコルは、NTA パラメータの変更が得られた結果に及ぼす影響を示しています。標準化された方法は、NTA解析における厳格さと再現性を高めるのに役立ちます。キュベットでサンプルを分析すると、各ビデオで統計的にランダムなサンプルをキャプチャできます。これにより、より再現性の高いデータと、さまざまなサイズにわたるパーティクルの視覚化が可能になります。推奨される粒子濃度範囲でサンプルを得ることは困難な場合がありますので、理想的な希釈因子を特定するためにシリアル希釈を実行してください。この手順のデモンストレーションは、アンソニー・フェランテの研究室の博士課程の学生、クンゲンカイです。ナノ粒子追跡解析用のキュベットを準備するには、繊維がキュベットに入るのを防ぐために、糸くずのない材料でワークスペースを覆います。手袋を着用し、磁気キュベットジグに攪拌棒を含むキュベットを置きます。フックツールを使用して、挿入物をキュベットの前部に表示されるインサートのノッチでキュベットに配置します。ピペットを使用して、インサートの穴を通してキュベットに400〜500マイクロリットルの精製細胞外小胞をゆっくりと加え、気泡を入れずに穏やかにピペットしてサンプルを混ぜ、キュベットをキャップし、必要に応じて泡をタップし、糸くずのない布を使用してキュベットの外面を拭きます。希釈剤またはサンプルの粒子濃度を解析するには、コンピュータのワークステーションと計器をオンにして、粒子追跡解析プログラムを開始します。メッセージが表示されたら、[NTA] をクリックして[録音]タブを開きます。画面の指示に従って、必要なサンプル情報をすべて入力します。EV 追跡分析の場合は、希釈剤を PBS に設定します。このサリニティは、希釈剤またはサンプル粒子濃度を得るために9%に自動投入し、器具の蓋を開け、キュベットが配置される保護キャップカバーを取り外します。カメラに面したインサートのノッチで、正しい方向でキュベットをインストルメントにロードし、キャップとインストルメントの蓋を交換します。ストリーミング矢印をクリックしてカメラの電源をオンにし、シェブロンの矢印をクリックしてレコード設定を展開します。比較的小さな粒子がはっきりと見えるまで焦点を合わせます。小さなEV定量の分析を設定するには、フレームレートを毎秒30フレーム、露出を15ミリ秒、3秒に、待ち時間を3秒、青、緑、赤のレーザーパワーをそれぞれ210、12、および8ミリワットに、ゲインを30デシベルに設定します。比較的小さな粒子がはっきりと見えるまで焦点を合わせます。ズームやゲインを増やすと、パーティクルのフォーカスを得ることができます。しかし、ゲインを増やす場合は、録音前に30デシベルに設定してください。パーティクルがフォーカスされたら、ズーム設定を 0.5X に設定して帯域幅を節約し、フレームの損失を防ぎ、[記録] をクリックしてビデオの録画を開始します。ビデオが録画されたことを示すプロンプトが表示されたら、[OK] をクリックして記録を完了し、プロセスタブを選択します。録画中に非常に大きなパーティクルがビデオに表示されていた場合は、録画したビデオのディレクトリに移動し、処理前に問題のあるビデオを削除します。[オーディオ検出の無効]の[優先]ボックスをオンにして、機能の直径を 30 に設定します。[プロセス] をクリックしてビデオ処理を開始し、ライブ配信グラフを表示します。処理が完了したら、[OK]をクリックして[印刷]タブを選択します。EV の場合は、メイン チャートをログビンシリカとして表示します。グラフの他の特徴は、x軸を変更して、生成された図形の統合領域を設定するなど、カスタマイズすることができます。結果の PDF レポートを作成するには、レポートボタンをクリックします。希釈係数と分布幅に合わせて調整された平均、中央値、モードサイズ、および濃度が表示されます。希釈剤のNTAは、このブランクの濃度がEVサンプル粒子濃度から差し引くことができるように、任意のサンプルの前に行われるべきである。分析後にキュベットを洗浄するには、キュベットを空にし、キュヴェットを脱イオン水で10〜15回、70〜100%エタノールで3回完全に充填し、残留試料を除去します。キュベットの外側を糸くずのないマイクロファイバー布で乾燥させ、圧縮空気ダスターで内側を乾燥させます。インサートを洗浄し、バーをかき混ぜるために、70〜100%エタノールを含むガラスシンチレーションバイアルに材料を入れ、バイアルを激しく振ります。その後、インサートをすすいで、デモンストレーションのように振盪して脱イオン水でバーをかき混ぜ、糸くずのない布を使用して乾燥させます。乾燥後、次の分析まで、すべてのクリーン成分をすぐに保管します。分析を行う前に、器具校正をポリスチレンビーズを用いて試験し、取得したデータの妥当性を確認した。観察されたように、粒子追跡装置は100ナノメートルのマノ分散ビーズのサイズを正確に報告したが、400ナノメートルビーズのサイズを正確に報告しただけだった。したがって、このプロトコルの機器設定は、サイズが100ナノメートルに近い、より小さな粒子に対してより正確でした。これらの設定を用いて、報告された粒子濃度は、装置が技術的な複製物間の変動性をほとんどなく様々な希釈で粒子濃度を正確に検出できることを示す希釈因子を伴ってそれに応じてスケールする。ミリリットルマウス組織由来EVサンプル当たり10番目の粒子に対して4.41倍の10倍の希釈液を、1,000と3,000の間であると判断した。この分析では、ゲインを増加させることで、カメラの感度が高くなり、より多くの小さな粒子の視覚化が増加しました。青いレーザーパワーを70から210ミリワットに増やしながら、緑色と赤のレーザーパワーを一定に保ちながら、報告された平均粒子径を122ナノメートルから105ナノメートルにシフトし、報告された総粒子濃度を1.1倍から8番目の10倍に1.7倍に増加させました。赤色レーザーのパワーを上げると、報告された平均粒子サイズが175ナノメートルから246ナノメートルに増加し、報告された総粒子濃度が低下した。緑色のレーザーパワーを増加させると、報告された平均粒子サイズの減少と報告された総粒子濃度の増加が生じた。最適な検出範囲内にサンプルを配置する適切な希釈を見つけると、サンプルごとに数回の試みが必要になります。キュベットのクリーニングはまた余分な注意深い処理を要求する。EV粒子径や濃度測定には、複数の直交法を適用することをおすすめします。動的光散乱、抵抗パルスセンシング、透過電子顕微鏡、および単粒子干渉反射率イメージング検出も、EVの特徴付けに行うことができます。

nanoparticle-tracking-analysis-for-quantification-size-determination

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Biology

生物学

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低分子細胞外小胞のハイスループット単離および精製のためのフローサイトメトリーソーティングパラメータの最適化(英語)

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心血管バイオマーカー探索のための血漿由来細胞外小胞の単離、特性評価、およびプロテオミクス解析

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学ぶ ナノ粒子追跡解析による細胞外小胞の定量とサイズ決定の標準化手法。マウス脂肪組織とヒト血漿を用いた検証により、再現性のある測定とオペレーターバイアスの低減を実現します。

細胞外小胞の定量とサイズ決定のためのナノ粒子追跡解析

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