Name: 肺発生生物学と疾患をモデル化するための人工多能性幹細胞からの3D全肺オルガノイドの生成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: 学ぼう、hiPSCから3次元全肺オルガノイドを分化誘導する方法。気道上皮細胞、肺胞上皮細胞、間葉細胞を含む多細胞構造を再現し、肺発生と疾患のin vitroモデルとして活用できます。

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この研究は、カリフォルニア再生医療研究所(CIRM)(DISC2-COVID19-12022)によって支援されました。

この研究議定書は、UCSDの人間研究保護プログラム(181180)の機関審査委員会によって承認されました。
1. 人工多能性幹細胞からの決定的な内胚葉誘導(1日目~3日目)
<ol><li>ゆっくりと解凍成長因子は、使用の30分前に氷上の(GFR)基質膜(BM)マトリックス培地を減少させた。冷たいDMEM/F12において、混合物は、この培地の50%を構成するようなGFRBMマトリックス培地1:1を希釈する。P1000ピペットの先端を冷凍庫に入れ、使用前に冷やします。</li>
	<li>氷冷DMEM/F12で調製した50%GFR基膜マトリックス媒体の500 μLで12ウェルプレートの各ウェルをコーティングします。必要な数のウェルがコーティングされたら、余分な培地混合物および/または気泡を井戸から取り除き、プレートを氷または冷蔵庫の上に4°Cで20分間置きます。その後、プレートを一晩37°Cでインキュベーターに移動させてゲル化し、乾燥させた。</li>
	<li>HiPSCが70-90%の合流度に達したら、解離の1時間前に10μMのRho関連キナーゼ(ROCK)阻害剤Y-27632を加えます。培地を吸引し、リン酸緩衝生理食塩分(PBS)で一度洗います。細胞剥離培地(12ウェルプレートの0.5mL/ウェル)を添加してHIPSCを解離し、5%CO2 インキュベーターで37°Cで20分間インキュベートします。</li>
	<li>インキュベーターからプレートを取り出し、0.5 mL/12ウェルの幹細胞通過媒体(表1)をウェルに加えます。P1000チップを使用して細胞を穏やかに三分し、単細胞懸濁液を得る。解き分けた細胞を15 mL円錐形遠心分離管に移す;遠心分離機は300× gで5分間。</li>
	<li>培地を吸引し、10 μM ROCK阻害剤(Y-27632)を添加したmTeSR Plus培地1 mLで細胞ペレットを再懸濁する。セルカウントを実行します。12ウェルGFR地下膜媒体被覆プレートのウェルあたりROCK阻害剤Y-27632を補ったmTeSRの1 mLに2.0 x 105のhiPSCを加えます。一晩で37°Cでインキュベートする。 注: セルのシード数はセルラインごとに最適化する必要があります。めっき後24時間、ウェルは50%-70%コンフルエントでなければなりません。</li>
	<li>1日目、mTeSR Plusを吸引し、ヒトアクチビンAの100ng/mLとGSK3β阻害剤/WntアクチベーターCHIR99021の5μMを添加した決定的内胚葉(DE)誘導培地(表1)を加える。 注:GSK3β阻害剤/WntアクチベーターCHIR99021を有するDE培地は、分化を成功させるために1日目DE誘導の20-24時間以内に除去されるべきである。</li>
	<li>2日目および3日目に、100 ng/mLのアクチビンAのみを補ったDE誘導培地に変更する。 注: DE 分化は合計 72 時間を超えないようにしてください。4日目に、大きな細胞ダイオフが観察された場合、DE培地の総暴露時間を6〜12時間減少させる。</li>
	<li>DE効率を解析するには、FOXA2および/またはSOX17のフローサイトメトリーまたは免疫蛍光分析を介して、CXCR4および/またはcKit発現を90%以上確認します(図2a)。</li>
</ol>2. 前腸内臓(AFE)誘導(4日目~6日目)
<ol><li>4日目、培地をAFE誘導用に10μM SB431542および2μMドーソモルフィンを添加した無血清基底培地(SFBM)(表1)に変更します。AFE メディアを毎日 3 日間 (4 日目、5 日目、および 6 日目) に変更します。</li>
	<li>AFE効率を解析するために、免疫蛍光染色によるSOX2、TBX1、FOXA2の強い発現を確認します(図2b)。</li>
</ol>3. 肺前駆細胞(LPC)分化(7日目~16日目)
<ol><li>7日目に、氷上のGFR基基膜マトリックス培地を解凍する。AFE培地を吸引し、1x PBSでよく洗います。1 mLの細胞剥離液を加え、37°Cで10分間インキュベートします。</li>
	<li>細胞剥離液を含むウェルに1mLの焼入媒体(DMEM/F12で2%FBS)を加えます。細胞を上下に軽くピペット化して凝集体として保持します。すべての細胞が外れ、15 mL円錐形遠心分離管に移ることを確認してください。遠心分離機は300× gで5分間</li>
	<li>上清を取り除き、ヒト組換え骨形態形成タンパク質-4(BMP4)の10 ng/mL、全トランスレチノイン酸(RA)の0.1 μM、GSK3β阻害剤/Wnt活性化剤CHIR99021の3μM、および10μMのロック阻害剤Y-2766666600を補ったクエンチン化培地中の細胞ペレットを再懸濁させる。</li>
	<li>セルカウントを実行します。2.5 x 105 細胞を100 μLの冷たいGFR基膜マトリックス培地に加え、よく混ぜ合わせ、液滴を12ウェルプレートのウェルに入れる。プレートを37°Cで30〜60分間インキュベートし、培地を重合させます。10 μMのROCK阻害剤Y-27632を添加したLPC培地を1ウェルあたり1mL添加して、培地の低下が完全に水没し、一晩で37°Cでインキュベートされるようにします。</li>
	<li>8日目、LPC誘導後24時間、LPC培地を変更してROCK阻害剤Y-27632を除去した。LPC培地を1日おきに9~11日間変更します。 注:24時間以内にメディアが黄色になった場合は、毎日メディアを変更してください。</li>
	<li>LPC効率を解析するには、細胞内転写因子NKX2-1の強い発現を確認するか、CD47hi/CD26low15またはCPM18の表面マーカーに対してフローサイトメトリーを行う(図2c)。LPCスフェロイドは、丸く透明である必要があります(図2c)。 注:NKX2-1の効率が30%を下回る場合は、肺オルガノイド分化を進めないでください。</li>
</ol>4.3D肺オルガノイド誘導(16日目~22日目)
<ol><li>17日目に、氷上のGFR基基膜マトリックス培地を解凍する。LPC誘導培地を吸引する。その後、2 μg/mL のディスパーゼ (1 mL) をウェルに加え、P1000 ピペットで培地/ディスパーゼ混合物を再中断します。37°Cで15分間インキュベートします。再び混合物をトリチュレートし、さらに15分間37°Cでインキュベートします。</li>
	<li>ディスパーゼと細胞を15 mL円錐形遠心分離チューブに移します。冷やしたPBS(2〜3mL)を使用して井戸を洗浄し、ディスパーゼ/細胞混合物を再中断します。遠心分離機 400 x g で 5 分間上清を手動で除去し、培地/細胞ペレット層を外さないよう注意する。冷やしたPBS洗浄を繰り返し、円錐状遠心管を400xgでさらに5分間遠心分離 します。</li>
	<li>上清を手動で取り出し、2 mLのトリプシンベース解離液を円錐遠心管に加えます。37°Cで12分間インキュベートします。</li>
	<li>インキュベーション後、P1000ピペットチップで細胞を再懸濁する。その後、円錐遠心管に焼入れ培地の等量を追加し、5分間400 x g でスピンダウンします。ROCK阻害剤Y-27632の焼入培地+10μMの上清および再懸濁細胞を吸引する。 注:成功した肺オルガノイド誘導は、細胞が単一細胞ではなく凝集体として埋め込まれるときに発生し、それに応じてピペットを調整します。</li>
	<li>セルカウントを実行します。ウェルあたり 5.0~ 8.0 x 104 セルを得るために必要な体積を計算します。アリコートLPC細胞は、400 x gで5分間、1.5 mLマイクロ遠心分離チューブと遠心分離機に凝集 する。余分な上清を除去し、細胞ペレットを攪拌しないように注意する。残りの媒体は10μLだけ残します。</li>
	<li>細胞ペレットを200μLの冷たいGFR基底膜マトリックス培地に再懸濁し、細胞培養膜挿入物(直径6.5mm、0.4μmの細孔、ポリエステル膜)に添加します。30~60分間37°Cでプレートをインキュベートし、GFR基質膜マトリックス媒体を重合させます。</li>
	<li>線維芽細胞増殖因子-7(FGF7)(10 ng/mL)、FGF10(10 ng/mL)、GSK3β阻害剤/Wnを添加した3Dオルガノイド誘導培地(表1)を1mL追加 チロピターCHIR(3μM)、表皮成長因子(EGF)(10 ng/mL)、および10μMのROCK阻害剤Y-27632を膜インサートのバソラテラチャンバーに挿入した。1 日おきに 6 日間、メディアを変更します。</li>
</ol>5.3D肺オルガノイド分枝(23日目~28日目)
<ol><li>23日目にFGF7(10 ng/mL)、FGF10(10 ng/mL)、GSK3β阻害剤/Wnt活性化剤CHIR9902を添加した3D分岐培地(表1)に変更 1(3 μM)、RA(0.1 μM)、EGF(10 ng/mL)、血管内皮成長因子(VEGF)/胎盤成長因子(PlGF)(10 ng/mL)。1 日おきに 6 日間、メディアを変更します。 注: 3D 分岐分化の 6 日目には、複数の分岐オルガノイドが存在する必要があります(図 2)。</li>
</ol>6.3D肺オルガノイド成熟(29日目~34日目)
<ol><li>29日目には、3D分岐培地と同じであるが、デキサメタゾン(50nM)、cAMP(100μM)、および3-イソブチル-1-メチルキサンチン(IBMX)を添加した3D分岐培地(表1)に変更し、ホスホジエステラーゼ阻害剤(100μM)とも呼ばれる。1 日おきに 6 日間、メディアを変更します。 注:3D成熟後24時間以内に、分枝オルガノイドは拡大し、透明な球に変わるはずです。</li>
</ol>7.3D肺オルガノイド免疫細胞化学
<ol><li>3D全肺オルガノイド分析では、GFR基基膜マトリックス培地を4%パラホルムアルデヒド(PFA)で4%のパラホルムアルデヒド(PFA)で4°Cで1時間固定します。 パラフィンワックスに埋め込み、標準的な公開プロトコルごとにスライドにマウントします。</li>
	<li>染色前に抗原検索を行う。気道マーカーにはKRT5、MUC5AC、およびSCGB3A2が含まれます。歯槽マーカーには、SP-C、SP-B、HTII-280、HTI-56、およびHOPXが含まれる(図3)。</li>
</ol>8. GFR基基膜マトリックス媒体からの全肺オルガノイドの除去、FACS、または凍結保存
<ol><li>GFR基底膜マトリックス媒体からオルガノイドを解離するには、基底チャンバーから培地を取り出し、坐骨室に2μg/mLのディスパーゼ(1mL)を加えます。</li>
	<li>P1000ピペットで培地/ディスパーゼ混合物を穏やかにトリチュレートし、インキュベーターに15分間置きます。混合物をもう一度穏やかにトリチュレートし、さらに15分間インキュベートします。</li>
	<li>1 mLの冷蔵PBS(4°C)を加え、マトリックス培地を用いてオルガノイドを15 mL円錐形遠心管に移します。400 x g で 5 分間スピンします。上清を慎重に除去し、細胞ペレットを乱さない。</li>
	<li>1 mLチルドPBSでもう一度洗い、400 x g で5分間スピンダウンします。上清を慎重に取り除き、培地/細胞混合物を乱さない。</li>
	<li>円錐状遠心分離管に1 mLの細胞剥離液を加え、GFR基膜マトリックス培地/細胞混合物を穏やかにトリチュレート再懸濁させる。インキュベーターに12分間、凝集体または凍結保存用として細胞を通過させるため、または単一細胞懸濁液の場合は20分間置きます。</li>
	<li>同じ量の焼入れメディアを追加し、400 x g で5分間スピンダウンします。ROCK阻害剤Y-27632の焼入培地+ 10 μMで再懸濁します。 注:このステップでは、チューブに残った基質膜媒体は見られるべきではありません。残留媒体が残っている場合は、ステップ8.5と8.6を繰り返します。</li>
	<li>セルカウントを実行します。ダウンストリーム アプリケーションに必要なボリュームを計算します。</li>
</ol>

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<li>Jacquet, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategy+for+the+creation+of+clinical+grade+hESC+line+banks+that+HLA-match+a+target+population%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Strategy for the creation of clinical grade hESC line banks that HLA-match a target population.</a> EMBO Molecular Medicine. 5 (1), 10-17 (2013).</li>
<li>Mattapally, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+leukocyte+antigen+class+I+and+II+knockout+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cells%3A+universal+donor+for+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Heart+Association%22%5BJournal%5D)">Human leukocyte antigen class I and II knockout human induced pluripotent stem cell-derived cells: universal donor for cell therapy.</a> Journal of the American Heart Association. 7 (23), 010239(2018).</li>
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著者らは開示するものは何もない。

3D全肺オルガノイド(WLO)の分化が成功したのは、成長因子や小分子への暴露時間、通過後の細胞密度、HiPSCの品質など、細部に注意を払った6週間のマルチステッププロトコルに依存しています。トラブルシューティングについては、 表 2 を参照してください。hiPSCは、解離前に約70%〜80%のコンフルエントで、5%未満の自発的分化を行う必要があります。このプロトコルは"mTeSR プラス" メディアを必要とします。しかし、プレーンな"mTeSR"培地も同等の結果で使用されており、安価です。細胞外マトリックスについては、GFR基膜マトリックス培地を用います。分化を減らすためにReLesR( 材料表を参照)を使用してHIPSCを通過します。
内胚分化の間、細胞はメディアの変更の前と後に毎日視覚化されるべきである。特定の成長因子/小分子は、早期劣化を防ぐために、毎日新鮮なベース培地に添加する必要があります。決定的な内胚葉(DE)における細胞死は一般的であるが、前腸前腸内胚葉(AFE)および肺前駆細胞(LPC)誘導中に制限...

肺は、胚性、仮頭腺、運河、嚢胞、眼胞、微小血管成熟の6つの異なる段階で発達する複雑で異質な動的器官である1,2。後者の2つの段階は人間の発達において出生前および出生後に起こり、最初の4段階は早産が起こらない限り胎児の発達中に排他的に起こる3。胚期は内胚芽層から始まり、気管と肺の芽の出芽で終わる。肺の発達は、上皮細胞と間葉系細胞4との間のシグナル伝達を介して部分的に起こる。これらの相互作用は、肺の分岐、増殖、細胞の運命決定および発達中の肺の細胞分化をもたらす。肺は伝導域(末端気管支への気管)と呼吸帯(肺胞への呼吸気管支)に分けられる。各ゾーンには、ユニークな上皮細胞タイプが含まれています。導体気道内に基底、分泌、毛様体、ブラシ、神経内分泌、ヨウノサイト細胞を含む5、続いて肺胞型I型およびII細胞を呼吸上皮6に含む。様々な細胞型の損傷に対する発達と反応については、まだ多くのことが不明である。iPSC由来の肺オルガノイドモデルは、ヒト肺の発達を促進するメカニズム、肺機能に対する遺伝子変異の影響、および原発性ヒト肺組織を必要とせずに感染因子に対する上皮および間葉の両方の反応を促進する。
胚分化の様々な段階に対応するマーカーとしては、CXCR4、cKit、FOXA2、およびSOX17が決定的な内胚(DE)7、FOXA2、TBX1、および前前腸内胚葉(AFE)8のSOX2、早期肺前駆細胞用NKX2-1が含まれる。胚性肺の発達では、前腸は食道および腹側気管に分かれる。右と左の肺の芽は気管の芽10のまわりの2つの独立した外挿として現れる。分岐形態形成の間葉形成の間葉は、伸縮性組織、平滑筋、軟骨、脈管構造11を生成する。上皮と間葉系の相互作用は、正常な肺の発達に不可欠である。これには、上皮によって産生される間葉系およびSHH13によるFGF1012の分泌が含まれる。
ここでは、HIPSCを3次元(3D)全肺オルガノイド(WLO)に誘導分化するためのプロトコルについて説明する。LPC段階で並べ替えを行って肺胞状の14,15(遠位)オルガノイドまたは気道16(近位)オルガロイドを作ったり、腹側前腸前腸球体を生成して肺胞細胞とmesenterのマーカーと親子のマーカーと前駆体のマーカーと前足のマーカーを選別することによって肺前駆細胞の単離を組み込む同様のアプローチがある。この方法の強さは、肺分岐形態形成、成熟、およびインビトロでの拡張をパターン化し、調整するための肺上皮および間葉細胞型の両方を含めることである。
このプロトコルは、小分子と成長因子を使用して、決定的な内胚葉、前腸内臓内臓、肺前駆細胞を介して多能性幹細胞の分化を指示する。これらの細胞は、分岐および成熟を含む重要な発達段階を通じて3D全肺オルガノイドに誘導される。分化プロトコルの概要は、図1bに示す内胚葉およびオルガノイド分化の代表的な明視野画像を用いて図1aに示されている。図1c,dは、分化を完了した後の肺上皮細胞の近位および遠位の両方の集団の遺伝子発現と同様に、内皮分化の遺伝子発現の詳細を示す。

<table><tbody><tr><td>Cell Culture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>12ウェルプレート</td><td>Corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>12ウェルインサート、0.4um、半透明</td><td>VWR</td><td>10769-208</td><td></td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Tech</td><td>AT104</td><td></td></tr><tr><td>アスコルビン酸</td><td>Sigma</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>B27 レチノイン酸なし</td><td>ThermoFisher</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA) フラクション V、7.5% 溶液</td><td>Gibco</td><td>15260-037</td><td></td></tr><tr><td>ディスパーゼ</td><td>StemCellTech</td><td>7913</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>10565042</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10082139</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Lifeハム</td><td>35050061</td><td></td>テクノロジー</tr><tr><td>s F12</td><td>Invitrogen</td><td>11765-054</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>イスコーブs 変性ダルベッコ's Medium (IMDM) + Glutamax</td><td>Invitrogen</td><td>31980030</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Serum Replacement (KSR)</td><td>Life Technologies</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Monothioglycerol</td><td>Sigma</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR plus Kit (10/case)</td><td>Stem Cell Tech</td><td>5825</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>ThermoFisher</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Life Technologies</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Pen/strep</td><td>Lonza</td><td>17-602F</td><td></td></tr><tr><td>ReleSR</td><td>Stem Cell Tech</td><td>5872</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640 + Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>12633012</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Gibco</td><td>12605-028</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 (Rock Inhibitor)</td><td>R&Dシステム</td>ズ<td>1254/1</td><td></td></tr><tr><td>成長因子/低分子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>アクチビンA</td><td>R&D Systems</td><td>338-AC</td><td></td></tr><tr><td>オールトランスレチノイン酸 (RA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>BMP4</td><td>R&Dシステム</td><td>ズ314-BP / CF</td><td></td></tr><tr><td>Br-cAMP</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>B5386</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>アブカム</td><td>ab120890</td><td></td></tr>デ<tr><td>キサメタゾン</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>ドルソモルフィン</td><td>R&Dシステム</td><td>ズ3093</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>R&Dシステムズ</td><td>236-EG</td><td></td></tr><tr><td>FGF10</td><td>R&Dシステム</td><td>ズ345-FG / CF</td><td></td></tr><tr><td>FGF7</td><td>R&Dシステム</td>ズ<td>251-KG / CF</td><td></td></tr><tr><td>IBMX(3-イソブチル-1-メチルキサンチン)</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>R&Dシステム</td><td>ズ1614</td><td></td></tr><tr><td>VEGF / PIGF</td><td>R&Dシステム</td>ズ <td>297-VP/CF</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Primary 抗体</td><td></td><td></td><td>希釈速度</strong</td></tr><tr><td>>CXCR4-PE</td><td>R&D Systems</td><td>FAB170P</td><td>1:200 (F)</td></tr><tr><td>HOPX</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>sc-398703</td><td>0.180555556</td></tr><tr><td>HTII-280</td><td>Terrace Biotech</td><td>TB-27AHT2-280</td><td>0.145833333</td></tr><tr><td>KRT5</td><td>Abcam</td><td>ab52635</td><td>0.180555556</td></tr><tr><td>NKX2-1</td><td>Abcam</td><td>ab76013</td><td>0.25</td></tr><tr><td>NKX2-1-APC</td><td>LS-BIO</td><td>LS-C264437</td><td>1:1000 (F)</td></tr><tr><td>proSPC</td><td>Abcam</td><td>ab40871</td><td>0.215277778</td></tr><tr><td>SCGB3A2</td><td>Abcam</td><td>ab181853</td><td>0.25</td></tr><tr><td>SOX2</td><td>Invitrogen</td><td>MA1-014</td><td>0.180555556</td></tr><tr><td>SOX9</td><td>R&D Systems</td><td>AF3075</td><td>0.180555556</td></tr><tr><td>SPB (mature)</td><td>7 Hills</td><td>48604</td><td>1: 1500 (F) 1:500 (W)a</td></tr><tr><td>SPC (mature)</td><td>LS Bio</td><td>LS-B9161</td><td>1:100 (F); 1:500 (W) a</td></tr></tbody></table>

肺発生生物学と疾患をモデル化するための人工多能性幹細胞からの3d全肺オルガノイドの生成

Generation of 3D Whole Lung Organoids from Induced Pluripotent Stem Cells for Modeling Lung Developmental Biology and Disease

ヒトの肺の発達と疾患は、生体関連の インビトロ モデルシステムがないため、研究が困難であった。ヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)は、上皮細胞と間葉系細胞集団の両方からなる3D多細胞性肺オルガノイドに段階的に分化することができる。胚発生の手掛かりを、様々な成長因子と小分子を一時的に導入し、決定的な内胚、前腸内胚の内胚体、そしてその後肺前駆細胞を効率的に生成することによって再現します。これらの細胞は、次に成長因子還元(GFR)基膜マトリックス培地に埋め込まれ、外部の成長因子に応答して3D肺オルガノイドに自発的に発達することを可能にする。これらの全肺オルガノイド(WLO)は、デキサメタゾン、環状AMPおよびイソブチルキサンチンへの暴露後の分岐形態形成および成熟を含む初期の肺発達段階を受ける。Wloは、マーカーKRT5(基底)、SCGB3A2(クラブ)およびMUC5AC(ゴブレット)、およびHOPX(肺胞タイプI)およびSP-C(肺胞タイプII)を発現する肺胞上皮細胞を発現する気道上皮細胞を有する。間葉系細胞は、平滑筋アクチン(SMA)、および血小板由来増殖因子受容体A(PDGFRα)を含む存在も存在する。iPSC由来のWloは、何か月の間、3D培養条件で維持することができ、特定の細胞集団を精製するために表面マーカーのためにソートすることができる。iPSC由来のWlosは、肺上皮と間葉系間のシグナル伝達を含むヒト肺の発達を研究し、ヒト肺細胞の機能および発達に関する遺伝子変異をモデル化し、感染剤の細胞毒性を決定するためにも利用することができる。

めっきの24時間後、1日目、iPSCは50%-90%コンフルエントでなければなりません。2日目には、DEは90%-95%コンフルエントでなければなりません。DE誘導の間、4日目に有意な細胞死を観察することが一般的であるが、結合された細胞はコンパクトな石畳の形態を保持する(図2b)。接着細胞の大部分が剥離する場合は分化を中止し、6-12時間でアクチビンAを有するDE培地への暴露を短縮することを検討する。AFE誘導の間、細胞死は最小限であり、細胞は付着したままであるが、より小さく、より異質に見える。7日目に細胞を通過させるのは、二重陽性のSOX2とFOXA2の収率が&gt;80%である場合にのみ行う必要があります。3D LPC誘導のために基部膜マトリックスに通過した後、小さな回転楕円体が最初に現れ、次に成長し、いくつかは分岐し始める可能性があります。正常な内胚葉分化のための遺伝子発現プロファイルには、DEでのSOX17の増加、SOX17の減少とNKX2-1の初登場に伴うFOXA2およびSOX2の増加、およびSOX2およびFOXA2の存在とともにNKX2-1の増加が含まれる。初期の胚...

本稿では、近位および遠位上皮肺細胞と共に近位および遠位上皮肺細胞の両方を含む3次元全肺オルガノイドに対する誘導多能性幹細胞のステップ指向分化について説明する。

肺発生生物学と疾患をモデル化するための人工多能性幹細胞からの3D全肺オルガノイドの生成

Human lung development and disease has been difficult to study due to the lack of biologically relevant in vitro model systems. Human induced pluripotent ...

このプロトコルは、人工多能性幹細胞を使用して肺細胞に分化し、ヒト肺疾患および皿の発達をモデル化する。このプロトコルは、初発ヒト肺組織を得て培養することが困難であるため、重要である。多能性幹細胞から肺細胞を分化する主な利点は、ヒトの肺の発達と疾患を研究するために特定の肺細胞を一定に供給することです。これらの細胞は、長期間細胞培養中に維持することができ、将来の用途のために凍結保存することができ、遺伝子変異を研究するために遺伝的に操作することができる。この手順のデモンストレーションは、私の研究室の博士候補生であるレイチェル・マクヴィカーです。実験を開始する前に、成長因子をゆっくりと解凍して、氷上の基基膜マトリックス培地であるGFRを、同量の冷たいDMEM F12で希釈する。P1000のチップを冷凍庫に入れ、使用前に冷やします。次に、50%GFR基膜マトリックス培地の500マイクロリットルで12ウェルプレートの各ウェルをコーティングし、ウェルから余分な培地混合物と気泡を除去します。ウェルプレートを湿った氷の上に置くか、冷蔵庫を摂氏4度で20分間セットし、プレートを一晩で37度の摂氏インキュベーターに移動します。高いPSEが70%の合流度に達したら、ヒト人工多能性幹細胞に10マイクロモルROCK阻害剤Y27632を加え、解離する前に1時間待ちます。培地を吸引し、PVSで細胞を一度洗う。1ウェルあたり500マイクロリットルの細胞剥離培地を添加してIPSCを解離し、5%の二酸化炭素インキュベーターで摂氏37度で20分間インキュベートする。インキュベーション後、ウェルあたり500マイクロリットルの幹細胞通過媒体を加える。P1000チップを用いてピペット細胞を穏やかに使用し、単一の細胞懸濁液を得た。次いで、解約した細胞を15ミリリットルチューブと遠心分離機に300回G.後遠心分離で5分間移し、培地を吸引し、1ミリリットルのmTeSR Plus培地で細胞ペレットを10ミクロモルROCK阻害剤を補充して再懸濁する。細胞を数えた後、12ウェルGFR培地コーティングされたプレートの各ウェルに5番目のIPSCに2回10を加え、摂氏37度で一晩インキュベートします。翌日、mTeSR Plusを吸引してから、決定的な内胚葉(DE)誘導媒体を追加します。2 日目と 3 日目に、DE 誘導媒体を変更します。4日目に、DE誘導培地を無血清基底培地に置き換えてAFE誘導を開始します。6 日目の終わりに AFE 効率を分析する前に、AFE 培地を毎日 3 日間変更します。7日目に、後で使用するために氷上のGFR基質膜マトリックス培地を解凍する。同時に、AFE培地を吸引し、PVSでウェルを洗浄することにより、肺前駆細胞分化を進める。ウェルに1ミリリットルの細胞剥離液を加え、摂氏37度で10分間インキュベートします。インキュベーション後、細胞剥離液を含むウェルズに1ミリリットルの焼入れ培地を加えます。上下に軽くピペットを入れ、細胞を凝集体として保持します。すべての細胞が外れているが、5分間Gの300倍で遠心のために15ミリリットルの円錐管に移すため。上清を除去し、LPC誘導培地中の細胞ペレットを再懸濁します。細胞を数え、5番目の細胞に2.5倍の10を冷たいGFR基質膜マトリックス培地の100マイクロリットルに加え、よく混ぜます。12ウェルプレートのウェルに液滴を入れ、30〜60分間摂氏37度でインキュベートします。次に、ウェルあたり1ミリリットルのLPC培地を加え、培地の低下が完全に水没し、摂氏37度で一晩インキュベートされるようにします。8日目に、LPC培地を変更してROCK阻害剤Y27632を除去します。1日おきにメディアを交換し続け、16日目の終わりにLPC効率を分析します。17日目には、井戸を洗い、1ミリリットルのディスパーゼあたり2マイクログラムの500マイクロリットルを加えます。P1000ピペットを用いてディスパーゼ混合物をピペットし、15分間インキュベートし、その混合物をピペット化し、さらに15分間インキュベートする。インキュベーションに続いて、焼入れ培地の1ミリリットルをウェルを含むディスパーゼに加え、細胞を円錐管に移します。遠心分離機を1ミリリットルの冷蔵PVSで再懸濁し、遠心分離を繰り返します。その後、細胞剥離培地の1ミリリットルでペレットを再懸濁する。37°Cで12分間細胞をインキュベートし、同じ量の焼入れ培地と遠心分離機を再び加えます。クエンチ培地の1ミリリットルおよび10マイクロモルロック阻害剤Y27632でペレットを再懸濁する。ウェルあたり8倍の10〜4番目のセルを得るために必要な体積を計算するためにセルカウントを実行します。次に、必要なLPC細胞の体積は1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに、遠心分離機は300倍G.細胞ペレットを攪拌せずに余分な上清を除去し、10マイクロリットルの残留培地を残した。細胞ペレットを200マイクロリットルの冷たいGFR基底膜マトリックス培地に再懸濁し、細胞を細胞培養膜挿入物に移す。摂氏37度で30~60分インキュベートします。インキュベーション後、3Dオルガンイド誘導培地を1ミリリットルをインサートのバソラテラチャンバーに加え、1日おきに新鮮な培地に6日間交換します。23日目に、培地を3D分岐媒体に切り替え、その後、6日間隔日培地を交換します。29日目に、3D成熟培地に変更し、次の6日間、一日おきに培地を交換し続けます。DE誘導の4日目に、結合された細胞はコンパクトな石畳の形態を示す。核で重ね合わされた決定的な内胚葉マーカーCXCR4およびSOX17を発現させ、エンドダーマル分化を確認した。前前腸誘導は7日目に確認され、より緊密に圧縮された細胞を示す形態と、FOXA2およびSOX2のマーカーが核で重ね合わされた。3D肺前駆細胞の生成を3Dスフェロイドで確認し、レポーター細胞株中のNKX2-1 GFPの内因性発現を確認した。肺オルガノイド全体への3週間分化後、肺マーカーを免疫細胞化学によって分析した。器官では、核によって重ねられた形態形成の分岐用マーカーSOX2およびSOX9が観察された。近位肺マーカーP63とKRT5は、両方の基底細胞マーカーであり、クラブ細胞のマーカーであるSCGB3A2と共に正常に検出された。遠位肺マーカーは、肺胞タイプII細胞のプロSPCおよびSPBマーカーを誘導した。そして、肺胞型I細胞のHOPXマーカー。さらに、NKX2-1およびZO1は核で重ね合って発現した。間葉系肺細胞マーカーPGFRアルファは、SOX9と共発現する線維芽細胞のマーカーであり、遠位間葉系を表した。ビメンチンも発現し、肺全体に分散させた。この手順に従って、肺オルガノイドは、内皮および免疫細胞由来の誘導多能性幹細胞に投資することができる。肺の発達と疾患は、上皮細胞と間葉系細胞集団の間のシグナル伝達によって生じるが、内皮細胞およびマクロファージからのシグナル伝達も起こる。3D肺組織モデルシステムは、ヒトの疾患および治療の研究に臨床的に関連する。

generation-3d-whole-lung-organoids-from-induced-pluripotent-stem

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

このプロトコルは、効率的に気道上皮細胞を成熟するために、マウスの胚性幹細胞由来の胚体内胚葉を指示します。この分化技術は、定義された、無血清培養の設定において、肺系統の仕様を指示するために3次元の脱細胞化肺足場を使用します。...

脱細胞肺足場を使用してESC由来のマウス気道上皮細胞の生成

ここでは、生物学的および生物医学研究のモデル人間の肺疾患に 3 D 肺組織文化の生成に適している患者の切除から肺癌 agarose 充填精度カット スライスの準備のためのプロトコルを提案する.

疾患モデル作製のひと 3 D 肺組織培養 (3 D-Ltc) の生成

このプロトコルは腸のオルガノイドに人間の多能性セルの微分を可能にする。プロトコルは決定的な内胚葉、hindgutの内胚葉および次に腸の上皮の人口にセルを分化することによって正常な人間の開発をまねる。これにより、このプロトコルは、腸の発達と疾患モデリングアプリケーションの両方の研究に適しています。...

iPS細胞由来腸オルガノイドの作製による発生・疾患モデリングへの応用

本稿では、ヒト肺の近位領域および遠位領域からの生存上皮細胞の濃縮を可能にする組織解離および細胞分画アプローチの詳細な方法論を提供する。本明細書では、これらのアプローチは、3Dオルガノイド培養モデルの使用を通じて肺上皮前駆細胞の機能解析に適用される。...

オルガノイド培養のためのヒト肺上皮前駆細胞の単離と濃縮

ここでは、自己組織化によってヒト多能性幹細胞を用いて、発達的に関連するヒト心臓オルガノイド(hH)を効率的に作成するためのプロトコルについて述べた。このプロトコルは、発達的手がかりの逐次活性化に依存し、非常に複雑で機能的に関連するヒト心臓組織を生成する。...

多能性幹細胞由来の自己組織化ヒト心臓オルガノイドの生成

このプロトコルは、初代肺組織からヒト肺オルガノイドを誘導し、肺オルガノイドを拡張し、近位分化を誘導して、ヒト気道上皮を忠実に表現鏡検査する3Dおよび2D気道オルガノイドを生成する方法を提示する。...

ヒト肺オルガノイドの確立と近位分化による成熟気道オルガノイドの生成

このプロトコルでは、化学的発がんによって誘発される正常、腫瘍前、および扁平上皮がんの病変を表すマウスの口腔食道3Dオルガノイドを生成および特性評価するための重要なステップについて説明します。...

3Dオルガノイドによる口腔食道扁平上皮癌のモデリング

このプロトコールは、ヒト多能性幹細胞を使用して血管オルガノイドを生成する方法を示します。...

ヒト人工多能性幹細胞からの血管オルガノイド作製

ここでは、フィーダー細胞なしでレンチウイルス系を用いて、患者由来の線維芽細胞様滑膜細胞から誘導された多能性ヒト幹細胞を生成するためのプロトコルを説明します。...

関節リウマチ患者の関節から分離された線維芽細胞様滑膜細胞を用いて誘導多能性幹細胞の生成

このプロトコルの目標は、メラノーマ腫瘍浸潤リンパ球を人工多能性幹細胞に再プログラミングするためのプロトコルを示すことです。...

ヒトメラノーマ腫瘍浸潤リンパ球から誘導多能性幹細胞の生成

学ぼう、hiPSCから3次元全肺オルガノイドを分化誘導する方法。気道上皮細胞、肺胞上皮細胞、間葉細胞を含む多細胞構造を再現し、肺発生と疾患のin vitroモデルとして活用できます。

肺発生生物学と疾患をモデル化するための人工多能性幹細胞からの3D全肺オルガノイドの生成

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