Name: グルノーブルのEMBL HTX施設における自動結晶学パイプライン (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-05T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 50 s
Description: 学ぶEMBLグルノーブルのHTXラボによる自動結晶学パイプライン。CrystalDirectとCRIMSを用いて、リモートでタンパク質構造解析とフラグメントスクリーニングを効率的に実施する方法です。

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ESRF高分子ビームラインの使用と動作をサポートしてくれたEMBL-ESRF構造生物学グループ(JSBG)に感謝したいと思います。私たちは、ESRFとトーマス・シュナイダーのMASSIF-1ビームラインとEMBLハンブルクチームのデータ収集をサポートしてくれたマシュー・ボウラーに感謝しています。CrystalDirectの収穫機はEMBLグルノーブルのインストルメンテーションチームと共同で開発される。このプロジェクトは、ブースタープログラムを通じて、プロジェクトiNEXT(グラント・ノー・653706)とiNEXTディスカバリー(グラント・ノー・871037)とレジオン・オーヴェルニュ=ローヌ=アルプのプロジェクトの下で、欧州共同体H2020プログラムからの資金提供によって支えられました。

注:世界中の科学者のためのこれらのパイプラインへの資金提供アクセスは、一連の資金調達プログラムを通じてサポートされています。この原稿申請書を書いている時点で、iNEXT Discoveryプログラム(https://inext-discovery.eu)、欧州委員会のHorizon 2020プログラムまたは米国のゼクリュエリック(https://instruct-eric.eu/)が資金を提供する翻訳構造生物学20を刺激するヨーロッパの施設ネットワークのいずれかを通じて受け入れられています。特定の時点での資金によるアクセスのための現在のモダリティとルートについては、対応する著者に連絡してください。このプロトコルは、タンパク質から構造へのパイプラインの動作を記述し、他の 2 つのパイプラインの特異性については、次のセクションで説明しながら、すべてのパイプラインに共通の手順が含まれています。ここでの手順は、CRIMS V4.0 を参照してください。
1. 高スループット結晶化研究室
<ol><li>開始する前に、CRIMS システム https://htxlab.embl.fr/#/ を通じて HTX ラボで登録を依頼してください。ユーザー資格情報は、すべての実験用設計および評価インタフェースへのリモートアクセスを提供します。<ol>
<li>ウェブナビゲーターを介してCRIMSにログインします(Firefox、Chrome、サファリがサポートされています)。CRIMs Web サーバーは暗号化され、Web を経由する間、サード パーティがデータにアクセスするのを防ぎます。CRIMSに入ると、スクリーニングの左側にある一連のメニューがサンプルの管理と作成、結晶化実験の依頼、プレートの管理と視覚化などを行います。ビデオチュートリアルのシリーズは、https://medias01-web.embl.de/Mediasite/Showcase/embl/Channel/a2168bcaa36b4564851663e5b69594014d で利用可能です。 注:宅配便でサンプルを送信するユーザーは、到着時に遅滞なく処理できることを確認するために、サンプルを送信する前にCRIMSを介してサンプルと要求された結晶化実験を登録する必要があります。出荷詳細を htx@embl.fr に送信してください。</li>
	</ol></li>
	<li>Web ブラウザで CRIMS (https://htxlab.embl.fr) にログインし、サンプル メニューをクリックします。これにより、プロジェクトおよびサンプル管理ツールを使用したインターフェイスが開きます。</li>
	<li>[ 新しいサンプル ] ボタンをクリックし、要求された情報を入力します。CRIMSは、異なるプロジェクト、ターゲット、および構成体の下でサンプルを整理することができます。サンプルを既存のものに割り当てるか、この時点で新しいサンプルを作成します。</li>
	<li>要求された情報が入力されたら、[ 保存して要求を作成] をクリックします。結晶化プロトコル、使用する結晶化スクリーン、インキュベーション温度、および実験の希望日を選択します。<ol>
<li>コメント フィールドを使用して、HTX ラボオペレータが知るうえで重要なサンプルについて説明します。カスタム画面も選択できます(下記参照)。結晶化要求を送信した後、HTXラボチームによって検証され、実験のスケジューリングに関する確認が電子メールで送信されます。必ず、サンプル出荷に必要な時間と互換性のある実験日を選択してください。</li>
	</ol></li>
	<li>サンプルがHTXラボの施設運営者に到着すると、要求に応じて実験を行います。結晶化実験が設定されると、確認は電子メールで送信され、結晶化トレイは自動化されたイメージャーに転送されます。CRIMS は、すべての実験パラメータへのアクセスを提供し、新しいイメージングセッションを自動的に追跡します。新しい画像が利用可能になると、電子メール通知が自動的に送信されます。施設25、26で開発されたプロトコルに基づくサーモフルーアベースの30サンプル品質評価実験は、この時点ですべてのサンプルで行われ、CRIMSを介して利用可能になります。</li>
	<li>結晶化の実験の画像とサンプルの品質評価の結果は、結晶化トレイが設定された直後にCRIMSで利用可能になります。 サーモフルーター メニューをクリックし、サンプルに移動して、サンプル品質評価実験の結果を確認します。<ol>
<li>「プレート」メニューをクリックして、結晶化プレートの画像を表示します。サンプルに移動し、[View]をクリックして最後のイメージング セッションを表示するか、+(展開)記号をクリックして別のイメージング セッションを選択します。一連のツールは、サンプルを簡単に見つけてナビゲートするのに役立ちます。たとえば、画面の上部にあるプロジェクト ボックスをクリックすると、そのプロジェクトのサンプルがフィルター処理され、ほとんどのテーブル列で検索機能が使用できます。</li>
	</ol></li>
	<li>プレート ビュー インタフェースを使用して、結晶化実験の結果を評価し、スコア付けします。これは、結晶板の異なる井戸を通してナビゲーションを可能にし、画像の種類(すなわち、Vis、UV)を選択し、画像解像度またはレコードスコアを選択します。この界面はまた、結晶化溶液の組成を含む結晶化実験に使用されるすべての実験パラメータを提供する。</li>
	<li>「絞り込み」メニューをクリックして、初期スクリーニングで特定された一次ヒット条件に基づいて、結晶最適化画面を設計します。化学品とストックソリューションのサブメニューを使用すると、結晶化ストックソリューションを登録および管理できます。スクリーンサブメニューは、独自の最適化またはカスタム画面を設計するためのインターフェイスへのアクセスを提供します。<ol>
<li>実験計画に最適なプレートタイプ、ストックソリューション、または勾配構成を選択します。CRIMSに対し、数式ロボット(Formulatrix)と直接互換性のあるファイルを出力し、画面を自動的にプレートにピペット化するか、手動操作のためにボリュームを含む印刷可能な文書を出力することができます。</li>
	</ol></li>
	<li>ステップ1.2~1.8を繰り返し、結晶最適化実験を行います。</li>
	<li>X線回折実験に適した結晶が特定されたら、プレート ビュー インタフェースに移動し、右の結晶化ドロップに対応する画像を選択します。事前に保存されたスコアは、これを簡単に行うことができます。<ol>
<li>CrystalDirectを装備していない施設でCRIMSを使用している場合は、Crystal Harvesting をクリックして、CrystalDirectハーベスタロボットの自動結晶収穫計画を記録するか、従来の手動結晶取り付け用の 手動収穫 をクリックしてください。両方のインターフェースは、結晶収穫プロセスを通してユーザーを導く。CRIMS は自動的に収集された結晶の位置を記録し、SPINE または Unipucks21に保存します。</li>
	</ol></li>
	<li>CRIMS の クリスタルマネージャー メニューを選択します。 [収穫された結晶] サブメニューをクリックして、凍結したサンプルを検査します。CrystalDirectハーベスタを使用する場合、収穫された結晶を含むピンの画像を含む収穫プロセスの画像が提示されます。</li>
	<li>[出荷]メニューを選択してESRFまたはペトラIIIシンクロトロンに接続し、X線回折解析用のサンプル貨物を作成します。[出荷の作成]ボタンをクリックし、使用するシンクロトロンとバッグ番号を選択します(シンクロトロンのバッグパスワードが必要です)。次の一連のインターフェイスは、出荷に含める pukcs を選択するために使用されます。システムは、データ収集をサポートするコメントを提供し、MASSIF-1のような自動ビームラインのデータ収集パラメータを決定することを可能にします。</li>
	<li>ESRFまたはペトラIII HTXラボでデータ収集が行われている場合、オペレータはサンプルをビームラインに移し、他のシンクロトロンでのデータ収集はユーザー自身の費用で行われます。同期光に移動して、リモートビームライン操作またはMASSIF-1でデータを収集することが可能です。後者の場合、データ収集プロセスは完全に自動化されます。シンクロトロンでは、ISPyB29の特定のインターフェイスを使用して、CRIMSから送信された情報を回復し、サンプルパックを関連付けて、データ収集の結果を自動的に追跡することができます。ここで説明する実験では、シンクロトロンでのデータ収集は、典型的にはMXcube31ソフトウェアで行われ、一方でデータ処理と構造の改良はatuoPROC32、スタラニンソ33、BUSTER 33、パイプドリーム32、33およびクート35で行った。</li>
	<li>データ収集実験が行われたら、CRIMSはISPyB29システムからシンクロトロンでの初期データ処理の結果とともに概要情報を取得する。CRIMS クリスタルマネージャ メニューに移動し、 結晶回折データ サブメニューをクリックします。回折データ収集に関するすべての情報とメタデータが利用可能です。また、同期光光から処理されたデータだけでなく、生の回折画像からダウンロードすることも可能です。複数のデータ コレクションを表示したり、特定のデータセットを選択したりします。サンプル管理ツールを使用すると、特定のプロジェクト構成のサンプルをナビゲートして選択できます。 注:このパイプラインは、純粋なタンパク質からX線回折結果までインターネット上で完全に自動化された操作を提供し、同時に1つまたは複数のサンプルで操作することができます。構造生物学の異なるコンテキストやプロジェクトタイプに適用できます。</li>
</ol>

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<li>Münzker, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fragment%E2%80%90Based+Discovery+of+Non%E2%80%90bisphosphonate+Binders+of+Trypanosoma+brucei+Farnesyl+Pyrophosphate+Synthase%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Fragment‐Based Discovery of Non‐bisphosphonate Binders of Trypanosoma brucei Farnesyl Pyrophosphate Synthase.</a> ChemBioChem. 21 (21), 3096-3111 (2020).</li>
</ol>

JAMは、クリスタルダイレクトシステム上の特許の共同執筆者です

ここで説明する自動結晶学パイプラインは、さまざまな資金調達プログラムを通じて世界中の研究者が利用できます。現在、iNEXTディスカバリープログラムと「指示エリック」に適用することで、結晶化実験とCrystalDirect技術のための資金によるアクセスが可能であり、ESRFでの高分子結晶化ビームラインへのアクセスはESRFユーザーアクセスプログラムを通じてサポートされています。このアプローチは、結晶成長と測定の間の遅延を最小限に抑え、タンパク質産生と結晶化条件の回折ベースの最適化を必要とする非常に困難なプロジェクトの進行を加速し、結晶化、結晶処理およびビームライン操作に関連する複雑な操作から科学者を解放し、非専門家グループにとってよりアクセスしやすい結晶学をレンダリングします。また、結晶化添加剤、フェス化剤の迅速な探索、または共結晶化実験による化合物スクリーニングにも使用できます。ほとんどの結晶学プロジェクトはこのアプローチの恩恵を受ける可能性がありますが、一部のサンプルでは、マイクロ流体システムや高度に特殊化された結晶化装置、または非常に不安定で出荷を許容しないサンプルなど、ここで提示される自動化やパイプラインに適さない特別なプロトコルが必要な場合があります。
CrystalDirect技術は、小分子標的複合体の特性評価のために、自動結晶浸漬17も可能にします。このために、収穫プロセスの前にレーザーで小さな開口が作成され、所望の化学物質(すなわち、フェス化剤または潜在的なリガンド)を含む溶液の滴が上に加えられるので、それが接触して入り、最終的に結晶に到達する結晶化溶液に拡散する。化学溶液は、水、DMSOまたは他の有機溶媒で処方することができます。あるインキュベーション時間の後、結晶は、上記のように回折によって収穫され、分析することができる。このアプローチは、構造ベースの薬物設計の文脈におけるリガンド-タンパク質複合体の迅速な特性評価、ならびに大規模化合物およびフラグメントスクリーニングに適用されてきた。後者の場合、数百から1000以上のフラグメントを持つフラグメントライブラリを迅速に分析することができます。ここで紹介されていない特定のCRIMSインターフェイスは、クリスタルソーキング実験の設計と自動追跡を容易にし、グローバル・フェージング・リミテッド(英国)が開発したCRIMSソフトウェアとPipedreamソフトウェアスイートとの統合により、数百のデータセットにわたってデータ処理、フェージング、リガンドの同定、構造の細分化を並行して自動化し、データ分析と解釈を合理化する32,33.例えば、このパイプラインは最近、ヒトアフリカのトリパノソミア症を引き起こす寄生虫の重要な酵素である トリパノソーマ・ブルセイ ・ピロリン酸シンターゼの活性部位およびいくつかのアロステリック部位の両方に結合する断片の同定に適用された。
ここに示すパイプラインは、構造生物学における発見のペースを加速させ、より多くの研究グループが高分子結晶学をより利用しやすくするために貢献することができます。さらに、大規模な化合物やフラグメントスクリーニングを容易にすることで、翻訳研究の促進と創薬のプロセスのスピードアップに貢献し、より多くの標的に対するより良い、より安全な薬剤の開発を促進することに貢献します。

結晶化から回折データ収集、処理1、2、3、4、5、6、7、8、9、サンプル取り付け10、11、12のための多くの技術を含む、高分子結晶学実験プロセスのすべてのステップで自動化が導入されています。 、13,14,15,16,17.これは、結晶構造が得られるペースを加速させただけでなく、構造ガイド付き薬物設計18、19、20、21、23、24のようなアプリケーションを合理化するのに貢献しています。本稿では、グルノーブルのHTXラボで利用可能な自動結晶学パイプラインの側面と基礎技術について説明します。
EMBLグルノーブルのHTXラボは、ヨーロッパで結晶化スクリーニングのための最大の学術施設の一つです。欧州フォトンと中性子(EPN)キャンパスに、世界で最も華麗なX線ビームの一部を生産する欧州放射光施設(ESRF)と高流束中性子ビームを提供するラウ・ランゲヴィン研究所(ILL)と共同で配置されています。2003年に操業開始以来、HTXラボは800人以上の科学者にサービスを提供し、年間1000以上のサンプルを処理しています。HTXラボは、サンプル評価と品質管理25、26およびCrystalDirect技術を含む高分子結晶学の新しい方法の開発に重点を置いており、完全に自動化された結晶取り付けおよび処理15、16、17を可能にする。また、HTXラボでは、結晶化とシンクロトロンデータ収集施設の間の自動通信を提供するウェブベースのラボ情報システムである結晶学情報管理システム(CRIMS)を開発し、純粋なタンパク質から回折データまでのサンプルサイクル全体で途切れない情報フローを可能にしました。HTX施設、CrystalDirect技術、CRIMSソフトウェアの能力を組み合わせて、結晶化スクリーニング、結晶最適化、自動結晶収穫処理、凍結冷却およびX線データ収集を統合した完全自動化されたタンパク質間パイプラインを開発し、複数のシンクロトロンでのデータ収集を、ウェブブラウザを介してリモート操作できる単一かつ連続的なワークフローに移行しました。これらのパイプラインは、新しい構造の迅速な決定、タンパクリガンド複合体の特徴付け、X線結晶学による大規模化合物およびフラグメントスクリーニングをサポートするために適用することができます。
HTXラボには、非体積結晶化ロボット(可溶性タンパク質と膜タンパク質の両方の結晶化を可能にするLCPモジュールを含む)、結晶農場(5°Cと20°C)、結晶化スクリーンを準備する2つのロボット液体処理ステーション、および操作サイクルごとに最大400個の凍結サンプルピンを製造および保存する能力を持つ2つの自動CrystalDirectクリスタルハーベスタが装備されています。科学者は、エクスプレス宅配便で施設にサンプルを送り、HTXラボの専任技術者によって処理されます。科学者はCRIMSシステムによって提供されるWebインターフェイスを通して、結晶化スクリーニングおよび最適化実験を遠隔設計することができる。このインターフェースを通じて、彼らは、特定のサンプル要件に合わせて施設で利用可能な幅広いパラメータと実験プロトコルから選択することができます。結果とすべての実験パラメータは、CRIMSを通じてリアルタイムでユーザーに提供されます。受け取ったすべてのサンプルは、サンプル25、26、27の結晶化可能性を推定することを可能にする具体的に開発された方法を通じてアッセイされる。このアッセイの結果に基づいて、最適なインキュベーション温度および可能なサンプル最適化実験に関するユーザーに対して特定の推奨事項がなされる。結晶化実験を設定すると、科学者はウェブを通して異なる時点で収集された結晶化画像を見て結果を評価することができます。X線回折実験に適した結晶が特定されると、科学者は専用のインターフェースを使用してクリスタルマウント計画を立て、CrystalDirectロボットによって実行されます。
CrystalDirect技術は、改変蒸気拡散結晶化マイクロプレートとレーザー光を使用して、結晶化とデータ収集15、16、17の間に存在するオートメーションギャップを埋める回折対応のサポートに、凍結冷却結晶サンプルを取り付ける技術に基づいている。簡単に言えば、結晶は、変更された蒸気拡散プレート、CrystalDirectマイクロプレートで成長します。結晶が現れたら、CrystalDirect収穫ロボットは自動的にレーザービームを適用して結晶を含むフィルム片を切除し、標準回折データ収集ピンに取り付け、窒素ガス流でクライオクールします(Zander et al. 2016および https://www.youtube.com/watch?v=Nk2jQ5s7Xx8 参照)。この技術は手動または半自動の水晶取り付けプロトコルより多くの付加的な利点を有する。例えば、結晶の大きさや形状は問題ではなく、大きな結晶や微結晶を収穫しやすく、技術が動作する特別な方法(参照17、Zanderらら)のために、しばしば凍結保護剤の使用を避けることが可能であり、X線回折分析をより簡単にする。レーザービームは、例えば、結晶がクラスター上で成長したり、エピタキシャル成長を示すときにサンプルの最良の部分を選択するための外科用ツールとしても使用できます。CrystalDirect 技術は、自動浸漬実験17にも使用できます。小分子や他の化学物質を含む溶液を結晶に送り出す。これにより、完全に自動化された大規模な化合物およびフラグメントスクリーニングをサポートすることができます。クリスタルが結晶を収穫し、CrystalDirectロボットによって凍結冷却されると、それらは世界中で最も同期的な高分子結晶性ビームラインと互換性のあるSPINEまたはユニパックパックのいずれかに移されます。システムは完全に自律的な方法で400ピン(極低温貯蔵デュワーの容量)まで収穫できる。CRIMSはプロセスの間に収穫機ロボットと通信し、結晶サンプル(パックおよびピン)の自動追跡を提供する。パックは、サンプル管理21、28を容易にするために、バーコードとRFIDタグの両方でマークされています。
CRIMSは、ヨーロッパと世界の多くのシンクロトロンでX線データ収集管理と処理をサポートするISPyBシステムとの自動通信をサポートするアプリケーションプログラムインタフェース(API)を提供します。自動結晶収穫が完了した後、科学者は、結晶サンプル(パック)を選択し、ESRF(グルノーブル、フランス)7、8、9またはペトラIIIシンクロトロン(ハンブルク、ドイツ)18、19のいずれかで高分子結晶学ビームラインのサンプル出荷を作成することができます。CRIMSは、選択されたビームラインサンプルに対応するデータを、事前に選択されたデータ収集パラメータとともにシンクロトロン情報システムに転送します。サンプルが選択したシンクロトロンビームラインに到着すると、X線データ収集は、リモートビームライン操作または完全に自動化された方法(すなわち、関節EMBL ESRF ESRFジョイント構造生物学グループ(JSBG)が操作するESRF8のMASSIF-1ビームラインで手動で行われます。データ収集後CRIMSは、シンクロトロンデータ処理システムによって行われた初期データ処理結果とともにデータ収集の結果に関する情報を自動的に取得し、便利なユーザーインターフェースを通じて科学者に提示する。
HTXラボは、これらの自動化されたパイプラインを適用して、3つの異なるアプリケーション、新しい構造の迅速な決定、タンパクリガンド複合体の迅速な特徴付け、大規模な化合物およびフラグメントスクリーニングをサポートします。以下では、それらを使用して操作する方法を説明します。

<table><tbody><tr><td>CrystalDirectハーベスター</td><td>アリナックス</td><td></td><td>自動結晶実装および凍結冷却</td></tr><tr><td>CrystalDirect結晶化プレート</td><td>Mitegen</td><td>SKU: M-XDIR-96-2</td><td>96ウェル結晶化マイクロプレート</td></tr><tr><td>Formulator 16</td><td>Formulatrix</td><td></td><td>結晶化スクリーンの自動準備用</td></tr><tr><td>モスキート結晶化ロボット</td><td>SPT Labtech</td><td></td><td>結晶化実験の準備のために</td></tr><tr><td>Tecan Evo 液体ハンドリングステーション</td><td>Tecan</td><td></td><td>結晶化溶液の調製のために</td></tr><tr><td>スパインパック</td><td>Mitegen</td><td>SKU: M-SP-SC3-1</td><td>自動シンクロトロンサンプル交換器用スパイン互換極低温パック</td></tr><tr><td>UniPucks</td><td>Mitegen</td><td>SKU: M-CP-111-021</td><td>自動シンクロトロンサンプル交換器用ユニバーサル極低温パック</td></tr></tbody></table>

グルノーブルのembl htx施設における自動結晶学パイプライン

The Automated Crystallography Pipelines at the EMBL HTX Facility in Grenoble

EMBLグルノーブルは、世界中のユーザーに高スループットの結晶学サービスを提供する大規模なユーザー施設であるハイスループット結晶化研究所(HTX Lab)を運営しています。HTXラボは、高分子結晶学の新しい方法の開発に重点を置いています。高スループットの結晶化プラットフォーム、完全に自動化された結晶実装と凍結冷却のためのCrystalDirect技術、およびCRIMSソフトウェアを組み合わせて、インターネット上でリモート操作できる高分子結晶学用の完全自動化パイプラインを開発しました。これには、新しい構造の決定のためのタンパク質から構造へのパイプライン、薬用化学をサポートするタンパクリガンド複合体の迅速な特徴付けのためのパイプライン、1000以上の断片のライブラリの評価を可能にする大規模で自動化された断片スクリーニングパイプラインが含まれます。ここでは、これらのリソースにアクセスして使用する方法について説明します。

上述の自動結晶学パイプラインは、非常に成功した多数の内部および外部プロジェクトをサポートするために適用されています。いくつかのハイライトは、ジノヴィッチ・カルゴと最大ペルーツ研究所(ウィーン)の同僚からのプロジェクトが含まれ、細菌病原体の成長に不可欠なジペプチジルペプチダーゼの構造および機能解析に焦点を当てています。結晶化スクリーニング、回折評価、結晶最適化、X線データ収集サイクル(このプロジェクトでは最大8回の反復)の急速な連続により、わずか数週間でタンパク質の3つの異なる立体構造状態の構造モデルを得ることができ、このクラスのタンパク質36の機能に関する重要な機械構造的理解を提供した( 図1参照)。
もう一つの例は、バイオインフォマティクスツールと構造アプローチを組み合わせて、細胞運命調節に関与するSMAD3およびSMAD4転写因子の新しいDNA結合モチーフを同定した生物医学研究所(IRB、バルセロナ)のマシアスと同僚によるものである。この研究は、異なるDNA結合モチーフ37、38の複合体中でSMAD3&amp;4の6つの高解像度構造を作り出し、これらの転写因子の疑いのない能力を認識し、多様な配列のDNA配列に結合することを明らかにした。これらの技術は、製薬企業やバイオテクノロジー企業の研究グループによる医薬品設計プロジェクトの文脈で独自の研究を支援するためにも適用されています。例えば、これらのパイプラインによって寄与される急速さのおかげで、複数のリガンド標的複合体の構造解析は数日以内に達成することができ、これは薬剤開発の文脈における連続した丸み薬用化学最適化をサポートする大きな価値がある。最後に、大規模なX線ベースのフラグメントスクリーニング39にもこのインフラストラクチャを適用しました。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62491/62491fig01.jpg"> 図1: 自動結晶学パイプライン CRYSTALDIRECT技術と、ESRFのMASSIF-1ビームラインを備えたCRIMSソフトウェアを含むEMBL HTXラボの統合操作と、CRIMSとISPyBソフトウェア間の自動通信により、完全に自動化されたリモート制御型タンパク質間パイプライン統合の結晶化スクリーニングと最適化、自動結晶収穫と凍結冷却および自動データ収集および自動データ収集および処理をサポートできます。構造モデルは、これらのパイプライン36を適用して記録的な時間で同定された病原性細菌からのプロテアーゼの3つの異なる立体構造状態に対応する。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62491/62491fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

ここでは、EMBLグルノーブルのHTX研究所でCrystalDirect技術に基づくタンパク質から構造への自動高分子結晶学パイプラインの使用方法、迅速なリガンド-タンパク質複合体分析、大規模なフラグメントスクリーニングの方法について説明します。

グルノーブルのEMBL HTX施設における自動結晶学パイプライン

EMBL Grenoble operates the High Throughput Crystallization Laboratory (HTX Lab), a large-scale user facility offering high throughput crystallography ...

HTXラボは、完全に自動化されたタンパク質に対して、新しい構造を解決するために適用できる構造化されたパイプラインへのオンラインアクセスを提供し、より大きなスケールの断片およびレガンスクリーニングを行います。科学者がインターネット上で結晶学プロセス全体を制御できるCRIMソフトウェア上の自動結晶収穫とCRI冷却のためのCrystalDirect技術の組み合わせを通じて。まず、Web ブラウザで Crystal Graphic 情報管理システムを開いてログインし、[サンプル] メニューをクリックしてサンプル管理ツールのプロジェクトとのインターフェイスを開きます。新しいサンプルをクリックし、サンプルウィンドウで、要求された情報を入力し、[保存して要求を行う] をクリックします。リクエストパネルで、結晶化プロトコル、インキュベーション温度、使用する結晶化スクリーン、およびサンプル出荷に必要な時間と互換性のある実験の希望日を選択します。コメント フィールドを使用して、HDX ラボオペレーターが知るうえで重要なサンプルに関する指示を提供します。提出後、結晶化要求はハイスループット結晶化ラボチームによって検証されます。実験のスケジュールに関する確認は電子メールで送信されます。サンプルが施設に到着すると。実験担当者は実験をセットアップし、セットアップの確認を電子メールで送信し、自動イメージャーに結晶化トレイを転送します。CRIMSは、すべての実験パラメータへのアクセスを提供し、リアルタイムで新しいイメージングセッションを追跡します。新しい画像が利用可能になると、電子メール通知が自動的に送信されます。結晶化プレートの画像を表示するには、プレートメニューを開き、サンプルに移動します。ビューをクリックして最後のイメージング セッションを表示するか、拡張シンボルをクリックして別のイメージング セッションを選択し、ドロップ履歴を確認します。選択したプロジェクトのサンプルをフィルター処理します。特定のプロジェクト ボックスをクリックします。ほとんどのテーブル列で検索機能を使用することもできます。結晶化実験の結果を評価してスコアを付けるには、プレートビューインタフェースを選択し、結晶板の異なる壁をナビゲートします。画像の種類を選択し、画質を選択するか、スコアを記録します。ビューインターフェースは、結晶化溶液の組成を含む結晶化実験に使用される実験パラメータの全ても提供する。初期スクリーニングで特定された主ヒット条件に基づいて結晶最適化画面を設計するには、「絞り込みメニュー」を開き、「画面」サブメニューを選択します。実験計画に最適なプレートタイプ、ストックソリューション、または勾配構成を選択します。CRIMSに、数式ロボットの公式に直接互換性のあるファイルを出力して、スクリーンをプレートに自動的にピペットするか、印刷可能なドキュメントを出力し、手動操作用のボリュームを出力するように依頼することができます。結晶がX線回折実験に適した場合は、プレートビューインタフェースに移動し、事前に保存されたスコアを使用して、正しい結晶化ドロップに対応する画像を選択します。結晶直接収穫ロボットから自動結晶収穫計画を記録するために、結晶収穫をクリックします。CRIMSは自動的に収穫された結晶の位置を脊椎かユニットパックに記録し、保存します。次に、当社の施設がイメージャーから収穫計画を持つプレートを取り除き、CrystalDirectロボットに転送するオペレーター。結晶収穫が完了した後、サンプルを含むパックはCX 100デュワーに配置されるか、お好みのシンクロトロンに転送されます。クライオ冷却サンプルを検査するには、クリスタルマネージャーメニューを開き、収穫結晶を選択します。収穫された結晶を持つピンの画像を含む収穫プロセスの画像がそこで利用可能になります。X線回折解析用のサンプル出荷を作成するには、出荷メニューを開き、[出荷の作成]をクリックして目的のシンクロトロンとバッグ番号を選択します。完全自動ビームラインでのデータ収集に関する定義済みのパラメータと同様に、データ収集をサポートするコメントも入力できます。HDXラボは、完全に自動化された大規模なフラグメントスクリーニングへのアクセスも提供します。グローバルなフェスリングソフトウェア「Pipeline Pipe Dream」に基づく自動データ処理とヒット識別のためのCRIMSリソースにより、1つのプロジェクトで数百から数千のデータセットに対する結果を迅速に評価し、優先順位を付けることができます。CRIMSはシンクロトロン情報管理システムと通信し、実際の回折実験に関する情報を取得します。結晶マネージャメニューを開き、結晶回折データを選択して、シンクロトロンでの概要情報と初期データ処理の結果を表示します。この代表的な分析では、異なるタンパク質の構造同定のために、実証されたように自動結晶化パイプラインを使用しました。観察されたように、結晶スクリーニングの最適化と回折測定の急速な連続のおかげで、病原性細菌からのプロテアーゼの3つの異なる確認状態が非常に短い時間で同定された。このパイプラインは最近、フラグメントの同定にも適用され、トリパノソーマブルージーのいくつかのアラストリックサイトで両方の活性に結合した。ファルネシルピロリン酸シンターゼは、ヒトアフリカのトリパノソミア症を引き起こす寄生虫の重要な酵素である。このプロセスは、結晶成長と測定の間の遅延を最小限に抑え、進行を加速します。また、結晶処理やビームライン操作レンダリング結晶学などの複雑な操作から科学者を解放し、非専門家にとってよりアクセスしやすくします。このアプローチは、翻訳研究を促進し、創薬のプロセスをスピードアップするために貢献することができます。より多くの標的に対するより良く、より安全な薬物の開発に貢献する。

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Research

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グルノーブルのEMBL HTX施設における自動結晶学パイプライン

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