Name: イン・シトゥ 透過電子顕微鏡を用いたネズミ巨核生物の探索 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-08T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: 学ぶマウス骨髄内巨核細胞の超微細構造解析と成熟段階の定量化法。透過電子顕微鏡を用いたイン・シトゥ観察により、造血メカニズムと関連疾患の理解に貢献する正確なデータを得ることができます。

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著者らは、ファビエンヌ・プロアマー、ジャン=イヴ・リンケル、デビッド・ホフマン、モニーク・フロイントに技術支援を感謝したいと考えている。この研究は、ARMESA(メデシン・エ・サンテ・パブリケ協会)、欧州地域開発基金(ERDF)を通じた欧州連合(EU)、グラントANR-17-CE14-0001-01からH.d.S.に支援されました。

すべての動物実験は、ヨーロッパの基準2010/63/EUとストラスブール大学動物実験倫理に関するCREMEAS委員会(コンテテ・レジオナル・デティク・アン・マティエール・デ・エクスペリメンテーション・アニマル・ストラスブール)に従って行われました。プロトコルは図 1に概略的に示されています。
1. 骨髄の収集と固定 (図 1A)
注意:この手順は、発がん性、変異原性、および/または毒性物質を含み、化学的抽出フードの下で行われます。手袋や保護メガネなどの適切な保護具を着用してください。
<ol><li>カコジレートバッファー内の 2.5% グルタルアルデヒドからなる固定溶液を準備します ( 補足ファイルを参照してください)。</li>
	<li>骨髄コレクション<ol>
<li>成人C57BL/6マウスのいずれかの性別12-18週齢を使用してください。CO2窒息と子宮頸部脱臼によりマウスを安楽死させる。</li>
		<li>薄いはさみで、太ももの周りの皮膚を切り、ピンセットを使用して皮膚を剥がします。足の四肢を取り除き、股関節と太ももの間を切ります。膝の関節で切断することによって大腿骨から脛骨を取り外し、メスを使用して脛骨および大腿骨の付着組織を除去する。</li>
		<li>鋭いカミソリの刃で骨端を取り除きます。大腿骨をピンセットで保持しながら、21G針のカコジレートバッファーで満たされた5mLシリンジを使用して、骨髄を2mLカコダイレートバッファーで満たされた15 mLチューブに洗い流します。これを行うには、骨髄開口部に針のベベルを挿入し、骨髄が排出されるまでプランジャーをゆっくりと押します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>固定液への急速な浸漬による骨髄固定。<ol>
<li>フラッシュの直後に、プラスチックピペットを使用して、骨髄シリンダーを新鮮なグルタルアルデヒド固定液(以前は1.1で調製)の1 mLに室温で60分間移動します。 注:組織を保存するには、骨解剖から固定ステップまでのプロセス全体が10分以内に完了していることを確認してください。固定のために、固定液が熱ショックを避けるために室温であることを確認してください。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. アガロースに骨髄を埋め込む
注:骨髄組織は、異なる洗浄ステップの間にその完全性を維持するために十分に凝集していないし、材料は容易に失われる可能性があります。この問題を克服するために、骨髄は脱水前に寒天のゲルで覆われています。
<ol><li>補助ファイルに記載されているアガロース溶液を準備します。</li>
	<li>カコジレートバッファーでセクション1.3から固定骨髄を洗浄し、プラスチックピペットを使用してガラススライドに慎重に転送します。暖かいピペットを使用して、すぐに骨髄シリンダーに2%液体寒天の低下を適用します。 注: 寒天は冷却中にすばやく固めます。骨髄の均質な覆いを確実にするために、寒天溶液はスライドに堆積するまで暖かく保たれる必要があります。</li>
	<li>寒天が固まるまで、スライドを素早く氷の上に置きます(1-2分)。</li>
	<li>顕微鏡下では、これらの領域で組織圧縮が可能なため、鋭利なカミソリの刃を使用して骨髄シリンダーの四肢を切断し、廃棄します。カコジレートバッファーの 1 mL を含む 1.5 mL マイクロ遠心分離チューブ内の骨髄ブロックを移動します。</li>
</ol>3. 樹脂に骨髄を埋め込む
注意:樹脂成分は有毒です。いくつかは発がん性があり、化学抽出フードの下で注意して処理する必要があります。手袋や保護眼鏡などの適切な保護具を使用してください。四酸化オスミウムは室温で揮発性が高く、蒸気は目、鼻、喉に非常に有害です。廃棄される前に、2%オスミウム四酸化は、植物油の2倍の量を加えることによって中和されなければならない。
<ol><li>補足ファイルに記載されているエポキシ樹脂を準備します。</li>
	<li>樹脂埋め込み 注:オスミウム、酢酸ウラニル、エタノールの連続した浴中のインキュベーション中に同じマイクロ遠心分離管にサンプルを保管してください。パスツールピペットで上清を吸引します。各浴槽に使用される溶液の容積は、サンプルの少なくとも10倍の体積と等しくなければならない。<ol>
<li>4°Cで1時間カコジレート緩衝液に1%オスミウムを入れたブロックを後固定し、カコジレート緩衝液で1回洗浄し、次に蒸留水で1回洗浄します。</li>
		<li>4%の酢酸ウラニルを蒸留水に1時間染色し、蒸留水で2回洗浄する。</li>
		<li>蒸留水中の一連のエタノールを脱水する:75%エタノール中に5分間4回、95%エタノールで20分間3回、20分間100%エタノールで3回乾燥する。このステップでは、エポキシ樹脂の注射器を冷凍庫から取り出します。 注:プロトコルは100%エタノールで1時間一時停止することができます。</li>
		<li>骨髄内部のエポキシ樹脂の均一な浸潤と重合を得るために、まず15分間のプロピレンオキシドの2つの連続した浴でブロックをインキュベートする。</li>
		<li>100%プロピレンオキシドとエポキシ樹脂の1:1混合物を加え、1時間インキュベートします。サンプルを室温でゆっくりとした回転式シェーカーに置きます。</li>
		<li>100%エポキシ樹脂を加えて、攪拌下で一晩インキュベーションのためにサンプルを残します。</li>
		<li>100%エポキシ樹脂を2時間インキュベーションに加え、撹拌下に置いてください。</li>
		<li>顕微鏡下で、骨髄ブロックを平らなシリコーン型に入れます。骨髄全体のその後の横断的な断面を可能にするサンプルを配向する。金型にエポキシ樹脂を充填し、60°Cで48時間置きます。 注:すべての溶液(エタノールおよびプロピレンオキシドを除く)は、0.22 μmのフィルターを通して濾過され、サンプル汚染を回避します。樹脂の適切な重合を確保するために、金型を充填しながら気泡を避けてください。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 超薄切除 (図1B)
注:トランスミッションEMは、電子が細胞の内部、構造、および内部小器官(顆粒、小胞体、ゴルジ)の配置の投影画像を生成し、細胞内細胞膜の配置を通過することができる薄い組織切片を必要とします。
<ol><li>サンプルブロックを超ミクロトームサポートに取り付ける。サンプルホルダーに置きます。回転ダイヤモンドまたはタングステンフライスカッターで組織の周りの樹脂の過剰を除去するために45°でサンプルをトリミングします。</li>
	<li>水タンクを装備したダイヤモンドナイフブレードでウルトラミクロトームにサンプルを取り付けます。組織学的分析とTEM分析のために、500 nmと100 nmの厚さの横断断面をそれぞれカットします。ループで水面上の浮遊セクションを収集します。</li>
	<li>ガラススライドに厚さ500 nmのセクションを、下に紙フィルターを付けて200メッシュの薄い棒銅グリッドに100 nmの厚いセクションを堆積させます。1 つの条件に対して 5 つのグリッドを準備します: 最初に 2 つのグリッドを染色し、必要に応じて残りの 3 つのグリッドをバックアップとして保持します。</li>
</ol>5. トールイジンブルー染色
注:組織学のためのセクションを染色することは、3つの理由で重要です:1)組織が実際に切断され、樹脂ではないことを確認するために、2)包含の品質を確認し、3)迅速に骨髄サンプルを評価します。これが正しくない場合は、ブロックの深いところで切り取ります。
<ol><li>ヒートプレート(60°C)で半薄切片スライドを乾燥させます。</li>
	<li>濾過1%トルイジンブルー/1%ホウ酸ナトリウムをスライド上の蒸留水に加え、ホットプレート(60°C)で1〜2分間加熱します。蒸留水でスライドを洗い、ヒートプレートで乾かします。</li>
	<li>Poly(ブチルメタクリレート-コメチルメタクリレート)実装媒体を滴下してカバースリップにセクションを取り付け、軽顕微鏡で検査します。</li>
</ol>6. TEM観察用の重金属染色 (図1C)
注:コントラストのために、グリッドの上側はループを持つ各連続したバスの100 μLの滴で反転されます。使用前に、各溶液は0.22 μmのフィルタ処理を行います。濾紙のグリッド側にそっと接触して、各浴槽間の余分な液体を取り除きます。
<ol><li>4%のウラニル酢酸を蒸留水に5分間染色する。</li>
	<li>蒸留水で3回5分間洗います。</li>
	<li>クエン酸鉛で3分間染色します。</li>
	<li>蒸留水で3回5分間洗います。</li>
	<li>下側のグリッドを濾紙に接触させて乾かします。 注:重金属は二酸化炭素の存在下で反応します。沈殿物を最小限に抑えるには、コントラスト中の空気の変位を避け、話さない、環境を穏やかに保ち、エアコンをオフにします。</li>
</ol>7. TEM (図 1E)
注:セクションはTEM顕微鏡で導入され、120 kVで調べらされます。
<ol><li>まず、低倍率(<500x)でセクションを調べて、調製の一般的な側面(樹脂に穴があかないこと、セクション内の折り目/圧縮、染色による沈殿)を理解してください。</li>
	<li>次に、より高い倍率(〜2000x)でセクションを調べ、成熟の段階を区別することができます。全体の横断的なセクションの成熟の各段階から手動で巨核球を数える(各段階を視覚的に識別する方法については、代表的な結果を参照してください)。 注: グリッドの各正方形は、検査用の領域として定義されます(200 メッシュの銅格子では 16000 μm2 に相当します)。</li>
	<li>巨核球の数を評価するには、セクションで覆われた四角形のみを定量化します。そのためには、範囲のスクリーニングに基づくモデルを使用します。断面の四肢から別の範囲に、次に別の範囲の正方形の最初の範囲を観察します。この手順を使用して、全体の骨髄横断の四角形を正方形で完全かつ体系的に画面化します。</li>
	<li>各四角形について、ステージI、IIまたはIII巨核球の数をスコアします。 注:顆粒、DMS組織、細胞質領域の大きさ、ポリロブレン核を分析するには、より高い倍率が必要です。</li>
</ol>

<ol><li>Machlus, K. R., Italiano, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+incredible+journey%3A+From+megakaryocyte+development+to+platelet+formation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The incredible journey: From megakaryocyte development to platelet formation.</a> The Journal of Cell Biology. 201 (6), 785-796 (2013).</li>
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<li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Megakaryocytes+use+in+vivo+podosome-like+structures+working+collectively+to+penetrate+the+endothelial+barrier+of+bone+marrow+sinusoids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Megakaryocytes use in vivo podosome-like structures working collectively to penetrate the endothelial barrier of bone marrow sinusoids.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. , 15024(2020).</li>
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<li>Heijnen, H. F. G., Debili, N., Vainchencker, W., Breton-Gorius, J., Geuze, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multivesicular+Bodies+Are+an+Intermediate+Stage+in+the+Formation+of+Platelet+%CE%B1-Granules%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Multivesicular Bodies Are an Intermediate Stage in the Formation of Platelet α-Granules.</a> Blood. 7 (7), 2313-2325 (1998).</li>
<li>Gupta, N., Jadhav, K., Shah, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emperipolesis%2C+entosis+and+cell+cannibalism%3A+Demystifying+the+cloud%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oral+and+Maxillofacial+Pathology%22%5BJournal%5D)">Emperipolesis, entosis and cell cannibalism: Demystifying the cloud.</a> Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 21 (1), 92(2017).</li>
<li>Centurione, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+and+pathologic+emperipolesis+of+neutrophils+within+megakaryocytes+associated+with+marrow+fibrosis+in+GATA-1low+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Increased and pathologic emperipolesis of neutrophils within megakaryocytes associated with marrow fibrosis in GATA-1low mice.</a> Blood. 104 (12), 3573-3580 (2004).</li>
<li>Ellis, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+bone%2C+hemopoietic+stem+cells%2C+and+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The relationship between bone, hemopoietic stem cells, and vasculature.</a> Blood. 118 (6), 1516-1524 (2011).</li>
<li>Bornert, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal-based+mechanisms+differently+regulate+in+vivo+and+in+vitro+proplatelet+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal-based mechanisms differently regulate in vivo and in vitro proplatelet formation.</a> Haematologica. , (2020).</li>
</ol>

著者は宣言する利益相反はありません。

巨核代の直接検査は、巨核球の形成や血小板形成を理解するために不可欠です。本稿では、骨髄紅潮と浸漬による固定を組み合わせた透過電子顕微鏡法を提供し、骨髄中で起こっている巨核球形態形成の全過程の形態特性を その場で 解剖することを可能にする。
骨髄の洗い流しは、高品質のフラッシングの成功はオペレータの練習とトレーニングに依存するので、この方法の重要なステップです。繊細ではあるが、骨髄を洗い流すは、通常、巨核球形態に重要なアーチファクトに関連する完全な脱灰のための2週間のEDTA治療を必要とする、ミネラル化された骨の除去を避けるための最良の方法である。さらに、脛骨および大腿骨から固定されていない骨髄全体を採取する主な利点は、同じマウスに対していくつかのイメージングアプローチを組み合わせる能力である。実際には、単一の骨髄のみが、超構造研究のために必要とされ、他の3つの標本は相補的な分析のために利用できる。第2骨髄は、次に、新鮮な骨髄の外植物の調製に使用することができ、天然巨核球6のプロ血小板形成のダイナミクスをリアルタイムで...

巨核球は、骨髄に局在する大型多倍数細胞を専門とし、血小板産生を担う1.それらは複雑な成熟プロセスを通して造血幹細胞に由来し、その間に巨核球前駆体は徐々にサイズが増加し、細胞質および核2の広範な付随的形態変化を受ける。成熟の間、巨核球は、多球状核、境界膜系(DMS)を形成する表面膜の内在、アクチン系細胞骨格網に囲まれた小器官の末梢領域、およびα-顆粒、高密度顆粒、リゾソーム、リゾソーム、および多重体を含む多数の顕著な構造要素を開発する。超構造レベルでは、観察される大きな変化は、DMS3で区切られた離散領域への細胞質区画化である。膜のこの広範な供給は、血小板生産の初期段階で長い細胞質プロセスの延長を促進し、その後、循環内の血小板に改造します。巨核球分化および成熟時の欠陥は、血小板数および/または血小板機能の用語で血小板産生に影響を与える可能性があります。 
薄層透過型電子顕微鏡(TEM)は、血栓形成4,5の生理学の理解を形作った巨核球の高品質な超構造を提供する何十年もの間、選択のイメージングアプローチであった。本論文は、骨髄細胞の種類を分析する基礎となる可能性のある、天然骨髄微小環境内で起こる血小板生物新生の過程を捉えることができる標準化されたTEM法に焦点を当てる。我々は、細胞質プロセスをサイヌソード6の微小循環に拡張する未熟から完全に成熟までの巨核球の開発の超構造的な例を提供する。また、骨髄の再生能力と血小板生産能力を説明する、異なる巨核球成熟段階を定量化する簡単な手順についても説明する。

<table><tbody><tr><td>2,4,6-トリ(ジメチルアミノメチル)フェノール (DMP-30)</td><td>Ladd Research Industries, USA</td><td>21310</td><td></td></tr><tr><td>Agarose type LM-3 Low Melting Point Agar</td><td>Electron Microscopy Sciences, USA</td><td>1670-B</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 Calcium chloride hexahydrate</td><td>Merck, Germany</td><td>2083</td><td></td></tr><tr><td>Copper grids 200 mesh thin-bar</td><td>Oxford Instrument, Agar Scientifics, England</td><td>T200-CU</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルアルシン酸ナトリウム塩三水和物</td><td>メルク、ドイツ</td><td>8.20670.0250</td><td></td></tr><tr><td>ドデセニル無水コハク酸 (DDSA)</td><td>Ladd Research Industries, USA</td><td>21340</td><td></td></tr><tr><td>ダブルエッジ ステンレスカミソリ刃</td><td>電子顕微鏡科学-EMS, 米国 EM-72000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>エタノール絶対</td><td>VWR International, France</td><td>20821296</td><td></td></tr><tr><td>フィルター紙、直径90 mm</td><td>Whatman、イングランド</td><td>512-0326</td><td></td></tr><tr><td>フラット埋め込みシリコーン型</td><td>Oxford Instrument, Agar Scientific, England</td><td>G3533</td><td></td></tr><tr><td>グルタルアルデヒド 25%</td><td>電子顕微鏡 Sciences-EMS, USA</td><td>16210</td><td></td></tr><tr><td>ヒートプレート Leica EMMP</td><td>Leica Microsystems GmbH, Austria</td><td>705402</td><td></td></tr><tr><td>Histo Diamond Knife 45&deg;</td><td>珪藻、スイス</td><td>1044797</td><td></td></tr><tr><td>JEOL 2100 Plus TEM 顕微鏡</td> 日本 <td>EM-21001BU</td><td></td><td></td></tr><tr><td>クエン酸鉛 - Ultrostain 2</td><td>Leica Microsystems GmbH, Austria</td><td>70 55 30 22</td><td></td></tr><tr><td>LX-112 樹脂</td><td>Ladd Research Industries, USA</td><td>21310</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 塩化マグネシウム六水和物</td><td>Sigma, France</td><td>M2393-100g</td><td></td></tr><tr><td>封入剤 - ポリ(メタクリレートブチル-コメチルメタクリレート)</td><td>Electron Microscopy Sciences-EMS, USA</td><td>15320</td><td></td></tr><tr><td>Nadic Methyl Anhydride (NMA)</td><td>Ladd Research Industries, USA</td><td>21350</td><td></td></tr><tr><td>四酸化オスミウム 2%</td><td>Merck, ドイツ</td><td>19172</td><td></td></tr><tr><td>プロピレンオキシド (1.2-エポキシプロパン)</td><td>Sigma, France</td><td>82320-250ML</td><td></td></tr><tr><td>生理食塩水注射液0.9% NaCl</td><td>CDM Lavoisier、フランス</td><td>MA 575 420 6</td><td></td></tr><tr><td>メス外科用鋼刃</td><td>スワン・モートン、</td><td>England.0508</td><td></td></tr><tr><td>四ホウ酸ナトリウム - ホウ砂</td><td>シグマ、フランス</td><td>B-9876</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>メルク、ドイツ</td><td>84100-1KG</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ フィルター 0.2&micro;m</td><td>Pall Corporation, USA</td><td>514-4126</td><td></td></tr><tr><td>Toluidine blue</td><td>Ladd Research Industries, USA</td><td>N10-70975</td><td></td></tr><tr><td>Trimmer EM TRIM2</td><td>Leica Microsystems GmbH, Austria</td><td>702801</td><td></td></tr><tr><td>Ultramicrotome Ultracut UCT</td><td>Leica Microsystems GmbH, Austria</td><td>656201</td><td></td></tr><tr><td>Uranyl acetate</td><td>Ladd Research Industries, USA</td><td>23620</td><td></td></tr></tbody></table>

イン・シトゥ 透過電子顕微鏡を用いたネズミ巨核生物の探索

In Situ Exploration of Murine Megakaryopoiesis using Transmission Electron Microscopy

巨核球の分化および成熟は、骨髄の細胞および細胞外成分と密接に関連して起こる。これらのプロセスは、多倍体および多球状核などの巨核球細胞質の必須構造の徐々に出現することを特徴とし、境界膜系(DMS)と呼ばれる内部膜ネットワークおよび循環血小板に見られる緻密およびアルファ顆粒である。本稿では、トランスミッション電子顕微鏡(TEM)を用いたマウス巨核球のin situ 超構造研究における標準化プロトコルについて述べ、骨髄における成熟段階および細胞密度を定義する主要な特性を同定することを可能にする。骨髄は、フラッシュ、固定、エタノール中の脱水、プラスチック樹脂に埋め込まれ、そして、断面を生成するために取り付けられる。半薄いセクションと薄いセクションは、それぞれ組織学的およびTEMの観察のために準備されています。この方法は、任意のEM施設で、任意の骨髄細胞に使用することができ、同じマウス上のいくつかのイメージングアプローチの組み合わせを可能にする小さなサンプルサイズを使用する利点を有する。

骨髄の神学 軽顕微鏡下での骨髄トルイジンブルー組織学の観察は、例えば組織のコンパクトさ、微小血管の連続性、および巨核球の大きさと形状の点で組織体系全体を迅速に分析する鍵である(図1D)。それは、骨髄ブロック内の深い切断の必要性を決定するために、超薄いセクションの前に行われます。巨大な大きさと核の凝縮のために、より成熟した巨核球は40倍の目的で容易に視覚化されるかもしれない。これは、組織中の成熟した巨核球の密度とマイクロ血管への相対的な局在の優れた、迅速な概要を提供します。このような半薄い部分では、巨核球増殖と成熟の異常はすでに検出できた。
骨髄超構造 特徴的な超構造特性に基づいて、マウス巨核球は、熟成における順次段階を表す4段階に分けられる(図2A)。ステージI巨核球は、大きな核が細胞の大部分を占め、豊富なリボソームと...

ここでは、透過型電子顕微鏡(TEM)を用いて、その 場で 巨核球の超構造を解析するプロトコルを紹介する。マウス骨マロウは、収集され、固定され、エポキシ樹脂に埋め込まれ、超薄切片で切断される。コントラスト染色後、骨髄は120kVのTEM顕微鏡下で観察される。

Differentiation and maturation of megakaryocytes occur in close association with the cellular and extracellular components of the bone marrow. These ...

この手順の全体的な目的は、マウス骨髄内に位置する巨核球の超構造を観察し、高解像度の透過電子顕微鏡を用いて異なる成熟段階を定量化することです。主な利点は、我々が知っているように成熟の完全なレベルに達していない体外培養巨核球とは異なるネイティブ環境で巨核球の直接検査です。標準的なプロトコルに従って12〜18週齢のC57BL/6マウスから脛骨および大腿骨を収穫した後、鋭いカミソリの刃を使用して各骨から骨端を除去する。ピンセットで各骨を保持し、カコジレートバッファーで満たされた5ミリリットルの注射器に取り付けられた21ゲージ針を骨の一端に挿入し、骨髄を2ミリリットルの新鮮なカコジレートバッファーを含む15ミリリットルのコレクションチューブに洗い流します。洗い流した直後に、プラスチックピペットを使用して骨髄シリンダーを1ミリリットルの新鮮なグルタルアルデヒド固定液に移し、室温で60分間インキュベーションします。アガロースに骨髄を埋め込む場合は、固定サンプルを新鮮なカコダイレートバッファーで洗浄し、プラスチックピペットを使用して慎重に骨髄をガラススライドに移します。暖かいピペットを使用して、骨髄シリンダーに2%液体寒天の低下を素早く適用し、すぐに1〜2分間氷の上にスライドを置きます。寒天が固まったら、ステレオ顕微鏡と鋭いカミソリの刃を使用して各骨髄シリンダーの四肢を捨て、トリミングされた骨髄ブロックを1ミリリットルのカコジレートバッファーを含む1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管に移します。樹脂埋め込みの場合は、カコジレートバッファーで1%オスミウム四酸化物質を化学フードに1時間、4°Cで1時間固定してから、カコダイレートバッファーで1回、蒸留水で1回洗浄します。水洗い後、4%の酢酸を蒸留水で1時間染色し、続いて蒸留水で2回洗浄します。最後の洗浄後、示されているように、エタノール浸漬と蒸留水の上昇シリーズを通してブロックを脱水します。骨髄の中のエポキシ樹脂の均一な浸潤と重合を得るために、プロピレンオキシドの2つの連続した浴でブロックを15分間インキュベートしてから、室温でゆっくりとした回転式シェーカーで100%プロピレンオキシドとエポキシ樹脂の1対1の混合物でサンプルをインキュベートします。インキュベーションの終わりに、同じ条件下で一晩インキュベーションのために骨髄ブロックに100%エポキシ樹脂を加え、2時間の別のインキュベーションのために100%エポキシ樹脂を加える。インキュベーションの最後に、顕微鏡を使用して平らなシリコーン型の骨髄ブロックを向け、その後の横断断断面を可能にし、金型をエポキシ樹脂で満たし、48時間摂氏60度にします。超薄型断面の場合は、サンプルブロックを超ミクロトームサポートに取り付け、サポートをサンプルホルダーに取り付けます。ダイヤモンドフライス

in-situ-exploration-murine-megakaryopoiesis-using-transmission

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Biology

生物学

この議定書は、赤芽球摘出プロセスの可視化を提供し、フローサイトメトリーマルチスペクトルイメージングフローによりオルソ赤芽球を除核の集団を同定する新規な方法を説明します。...

マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーによる除核イベントにおけるマウス赤芽球亜集団エンリッチの同定

造血幹細胞および前駆細胞のマーキングコンビナトリアル5蛍光タンパク質は、再生中に、骨髄の造血アーキテクチャへの洞察を提供し、共焦点および2光子顕微鏡を経由して、生体内のクローン追跡になります。この方法は、移植後の時間の大規模な期間、無傷の組織におけるスペクトル的にコード化されたHSPCs由来細胞の非侵襲的な運命のマッピングが可能になります。...

共焦点および多光子顕微鏡を用いて5蛍光タンパク質によってマーク造血幹細胞および前駆細胞の生体内でクローン追跡で

単球は自然免疫の主要な調節因子であり、末梢の単核食作用系の更新や炎症の場合に重要な役割を果たします。この原稿では、単球の動員メカニズムを研究するためのマウスのカルバリア骨髄のリアルタイムイメージングの手順について説明します。...

マウス骨髄単球の追跡<em&gt;インビボ</em

私たちは、麻酔をかけたマウスの生体内共焦点顕微鏡を使用して、定常状態および炎症条件下で腸間膜静脈の好中球と単球の挙動を監視するためのプロトコルを詳述しています。...

リアルタイムで麻酔したマウスに生体顕微鏡により腸間膜静脈に好中球および単球のイメージング

ホーミングや骨髄 (BM) のニッチに造血細胞の生着を研究する遺伝的動物モデルとの組み合わせで、calvarium の生体内蛍光顕微鏡 (IVFM)...

骨髄ニッチに造血細胞の生着のダイナミクスを研究する遺伝的モデルと生体内蛍光顕微鏡 (IVFM) を組み合わせること

単球は、末梢動脈疾患のコンテキストでの arteriogenesis...

単球のホーミングと末梢動脈疾患のマウスモデルにおける腫瘍関連血管新生の生体顕微鏡

我々は、アスコルビン酸ペルオキシダーゼ2およびワサビペキシダーゼ染色を含む相関光および体積電子顕微鏡を用いて遺伝子改変後の全細胞におけるミトコンドリアおよび小和性網膜の分布を研究するためのプロトコルを提示し、同じセクション内の標的遺伝子の有無にかかわらず細胞のシリアル断面、および電子顕微鏡によるシリアルイメージング。...

相関光と体積電子顕微鏡によるミトコンドリアと小体網膜イメージング

この方法は、マウス大腿骨、脛骨、および骨盤骨からのMEPおよびMKpのフローサイトメトリーによる精製を記述する。...

マウスメガ核球前駆細胞の分離

ここでは、2光子顕微鏡を用いて生きているマウスの頭蓋骨の骨髄にメガカルヨサイトおよびプロ血小板をイメージングする方法について説明する。...

イン・ヴィヴォ マウスの頭蓋骨骨髄における巨核球とプロ血小板の2光子イメージング

ここでは、巨核球分化の特徴付けに関する免疫型付け戦略を紹介し、その戦略が蛍光活性化細胞選別機を用いて異なる段階で巨核球を選別する方法を示す。この方法論はヒトの一次組織に適用できるが、...

ヒトの一次源または造血前駆体からの分化 インビトロ からのヒトMKの免疫フェノタイピングと細胞選別

止血血栓形成のための穿刺創傷手順がここで紹介されています。形成された血栓は大きく、直径は数百ミクロンです。したがって、ボリュームイメージングアプローチが適切です。私たちは、多くの人が利用できる高解像度のアプローチとして、モンタージュされた広域透過型電子顕微鏡法を提案し、準備プロトコルを詳述します。...

穿刺創の止血とモンタージュ広域電子顕微鏡分析のためのサンプルの準備

学ぶマウス骨髄内巨核細胞の超微細構造解析と成熟段階の定量化法。透過電子顕微鏡を用いたイン・シトゥ観察により、造血メカニズムと関連疾患の理解に貢献する正確なデータを得ることができます。

イン・シトゥ透過電子顕微鏡を用いたネズミ巨核生物の探索

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イン・シトゥ 透過電子顕微鏡を用いたネズミ巨核生物の探索

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