Name: マウスメガ核球前駆細胞の分離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: 学ぶマウス骨髄からのメガ核球前駆細胞（MEP・MKp）の効率的な分離法。腸骨稜を含む採取と磁気リネージ除去により、高純度細胞を得て後続の分子解析や機能解析を可能にする倫理的なプロトコルです。

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著者らは、モニーク・フロイント、キャサリン・ジーゼル、ケティの技術支援に感謝したいと考えています。この作品は、ARMESA(メデシン・エ・サンテ・パブリケ協会)とグラントANR-17-CE14-0001-01によって Henri.de ラによって支えられました。サル。

動物に関する議定書は、ストラスブール大学動物実験倫理に関するCREMEAS委員会(コミテ・レジオナル・デ・エティック・アン・マティエール・ド・エクスペリメンテーション・アニマル・ストラスブール)に従って実施された。許可番号:E67-482-10)。
1. マウスの骨の収集
<ol><li>制度的ガイドラインに従って動物を犠牲にする。 注:この原稿に記載されたデータは、8〜12週齢のC57Bl/ 6マウスから得られた。得られた細胞の数、および引用された集団の頻度は、年齢およびマウス株によって異なる場合がある。</li>
	<li>70%エタノールでボディをスプレーします。</li>
	<li>はさみを使用して、脊椎に垂直な皮膚の0.5〜1cmの切開を行い、全身の皮膚を引き裂きます。下半身から皮膚を引き下げ、皮膚を取り除きます。</li>
	<li>動物を解剖パッドの上に置き、下に向けます。露出した背骨に沿って指を上から下にスライドさせて骨盤の骨を見つけます。腸骨の紋章を見つけるには、後肢(骨盤骨の前部の下方領域)の近くの腰部の小さな隆起を特定する。図1A,Bはマウス解剖学の概略表現を示す。</li>
</ol><img alt="骨格研究と分析のためのマウス骨盤骨、大腿骨、脛骨の解剖学的構造のX線と図。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62498/62498fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 図1:マウス解剖学(A)後肢骨を示すマウスX線骨盤の骨と背骨の間のスペース(黄色の矢印)に注意してください。そこではさみがマウスの体から後肢を適切に分離するために挿入されなければなりません(黄色の点線)。(B) 目的の骨髄が豊富な骨の模式図。骨盤の骨は赤、大腿骨は紫、ティビアは緑色で描かれています。(C)マウス骨盤骨の模式的表現。イリウムは骨盤骨の骨髄が豊富な部分に相当し、赤で強調表示されます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62498/62498fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<ol start="5"><li>はさみを脊椎に対して脊椎に対して平行に配置し、腸骨の紋章のバンプに近づけます。椎骨に沿ってはさみを尾まで滑らせて、骨盤骨の上の背骨の側面に沿って筋肉を切ります。 注:筋肉のこの最初のセクションは、メスの刃を使用して行うこともできます。</li>
	<li>はさみを脊椎に平行に置き、 図1Aの黄色い点線で示すように、椎骨と腸骨の紋章の間を切り取る。可能な限り椎骨の近くに残るようにしてください。残りの筋肉を切って、体から手足を切り離します。 注:抵抗がほとんどないはずです。</li>
	<li>反対側で繰り返して、2 番目の四肢を切り離します。</li>
	<li>清潔な表面に手足を移し、制度的ガイドラインに従って体の残りの部分を捨てます。</li>
	<li>鉗子およびメスとできるだけ多くの周囲のティッシュを取り除くことによって骨盤、大腿骨および脛骨の骨を露出させる。</li>
	<li>大腿骨の遠位端を鉗子で保持し、メスで関節の周りの筋肉をそっとスライスして骨盤骨から大腿骨の頭部を慎重に離脱させる。脱臼を容易にするために骨を揺らす。</li>
	<li>骨盤の骨から残りの筋肉を削り取り、大腿骨の頭を保持した空洞の真ん中にメスで切り取ります。 図1Cに示すように、骨の非常に薄い三角形側が廃棄される間、イリウムは造血前駆物質が豊富であるように保たれている。</li>
	<li>メスでイリウムの周りの残留組織を取り除き、2%新生児子牛血清(PBS-2%NBCS)を補充した無菌PBSに洗浄された骨を入れる。</li>
	<li>はさみを使って、足首の脚から足を切り落とします。</li>
	<li>脛部の下部を鉗子で保持し、筋肉を膝に向かってこすり上げます。フィブラエを捨て、メスで脛骨高原を横切ってカットします。滅菌PBS-2%NBCSに脛を置きます。</li>
	<li>メスで大腿骨の周りの残留組織を除去します。</li>
	<li>大腿骨の上側を鉗子で保持します。膝蓋骨の付け根にメスの刃を置きます。膝蓋骨の剥離まで大腿骨に平行に膝蓋骨に向かって力を加える。大腿骨を無菌PBS-2%NBCSに入れる。ニーキャップの除去は骨髄の洗い流しのための針を挿入するためのきれいなアクセスを提供する。</li>
</ol>2. 系統陽性細胞の磁気枯渇
<ol><li>層流キャビネットで、滅菌PBS-2%NBCSで満たされた滅菌ペトリ皿の骨を移す。</li>
	<li>メスで大腿骨の頭を切り落とす。</li>
	<li>1 mL の注射器に無菌 PBS-2%NBCS を充填し、21 G の針をコンセントに取り付けます。</li>
	<li>滅菌PBS-2%NBCSの2 mLで5 mLポリプロピレンチューブを充填します。</li>
	<li>鉗子で大腿骨を保持します。膝蓋骨の取り外し後に、左の溝に針をそっと挿入します。針の差し込みが行われないように、挿入時に針に回転を適用します。針がベベルまで骨に完全に挿入されていることを確認します。</li>
	<li>針で骨を2 mLのPBS-2%NBCSを含むチューブに移します。骨がはっきりするまで、注射器からPBS-2%NBCSを分配し、吸引する。</li>
	<li>大腿骨から針を取り出し、大腿骨の頭部があった反対側の穴に挿入します。再び緩衝液を分配し、吸引し、骨を捨てる。</li>
	<li>腸骨の紋章と脛骨の場合は、鉗子で骨を保持します。開いた側に針をそっと挿入します。針の差し込みが行われないように、挿入時に針に回転を適用します。針がベベルまで骨に完全に挿入されていることを確認します。針で骨を2 mLのPBS-2%NBCSを含むチューブに移します。骨がはっきりするまで、注射器からPBS-2%NBCSを分配し、吸引する。ボーンを破棄します。 注:最大3匹のマウスのボーンを同じチューブにフラッシュできます。セルのサスペンションをプールします。</li>
	<li>プールされたセル懸濁液を、滅菌5 mLポリスチレンチューブに置いた40 μmのセルストレーナーキャップを通して通過させます。</li>
	<li>セルのカウントに進みます。 注:細胞数は、生存率評価のためにトリパンブルーを使用して、または任意の自動化されたセルカウンターで、任意のヘモサイトメーターで実行することができます。1 つのマウスは、通常、7 x 10 6 個のセル± 105 個を生成します 。</li>
	<li>細胞懸濁液を総骨髄として100μL脇に置き、PBS-2%NBCSの500 μLを加え、染色手順のために氷の上に保存します。</li>
	<li>ペレットを4°Cで5分間400xgで遠心分離して懸濁液を濾過し、上清を捨てる。 注:赤血球は、新鮮な溶解溶液(dH2Oで1/10th)でペレットを再懸濁させることによって溶解することができます。懸濁液が明るく真っ赤になるまで5分間インキュベートし、10巻の無菌PBSを加えます。4°Cで5分間400 x gで遠心分離によりPBS-2%NBCSで細胞を洗浄する。 細胞ペレットが非常に緩んでいるため、上清を除去する際には注意が必要です。4°Cで5分間400 x gで遠心分離してPBS-2%NBCSで2回目の洗浄を行い、ステップ2.13に進みます。</li>
	<li>細胞ペレットを、1 x 107 細胞あたり100 μLの比率で調製したばかりの一次抗体カクテルで再懸濁します。氷の上で30〜45分間インキュベートします。</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>抗体</td>
			<td>希釈</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gr-1-ビオチン</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
<tr>
<td>B220-ビオチン</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
<tr>
<td>マック-1ビオチン</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD3ビオチン</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD4ビオチン</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD5ビオチン</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD8ビオチン</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
<tr>
<td>TER119-ビオチン</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD127-ビオチン</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1.
<ol start="14"><li>細胞懸濁液の10 μLを、Lin-Posフラクションとラベル付けされた無菌5 mLポリスチレンチューブに取り込みます。PBS-2%NBCSの90 μLを加え、氷の上に保存して染色手順を行います。</li>
	<li>4°Cで5分間400 x g で遠心分離することにより、滅菌PBS-2%NBCSで細胞を2回洗浄する。 滅菌5 mLポリプロピレンチューブで最後の洗浄を行うことを確認してください。</li>
	<li>洗浄工程中に、ビーズを磁気枯渇に備えます。<ol>
<li>30 sの場合は完全に渦を出して、バイアル内のビーズを再び停止します。</li>
		<li>ターゲットセルあたり2個のビーズに対応するビーズの体積を5 mLのポリプロピレンチューブに移します。</li>
		<li>磁石の上にチューブを置き、滅菌ガラスパスツールピペットを使用して洗浄バッファーを取り除くことによって、PBS-2%NBCSでビーズを2回洗浄します。</li>
		<li>ビーズを500 μLの滅菌PBS-2NBCS%で再懸濁します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>標識された細胞のペレットを250 μLのビーズで再懸濁し、氷の上で5分間穏やかに混ぜます。滅菌PBS-2%NBCSの2 mLを加え、穏やかに混ぜます。チューブを振らないで下さいます。</li>
	<li>チューブをマグネットに2分間置きます。</li>
	<li>無菌ガラスパスツールピペットで非磁性分画を収集し、残りの250 μLの磁気ビーズに追加します。パラフィルムでチューブを密封します。</li>
	<li>チューブローラーにチューブを4°Cで20分間置きます。</li>
	<li>滅菌PBS-2%NBCSの2 mLを加え、穏やかに混ぜます。チューブを振らないで下さいます。</li>
	<li>チューブを磁石に2分間入れ、</li>
	<li>無菌ガラスパスツールピペットとLin-Neg画分とラベル付けされた無菌5 mLポリプロピレンチューブに非磁性分数を収集するに進みます。</li>
	<li>4°Cで5分間400xgで遠心分離して細胞をペレット化し、上清を除去する。</li>
	<li>非磁性細胞を500 μLの無菌PBS-2%NBCSで再懸濁します。</li>
	<li>セルのカウントに進みます。 注: 通常、1 つのマウスは 3.9 ± 1.1 x 106 セル になります。典型的な系統染色前および枯渇後を 図2Bに示す。</li>
</ol>3. フローサイトメトリーによる巨核球前駆細胞の細胞選別
<ol><li>総骨髄、Lin-Pos画分、および Lin-Neg 画分とラベル付けされたチューブを取ります。</li>
	<li>チューブの含有量を全骨髄を6つの無菌5 mLポリスチレンチューブに均等に分割する。チューブに 1 から 6 の番号を付けます。</li>
	<li>チューブ Lin-Pos Fraction に番号 7 のラベルを付けます。</li>
	<li>次のように、チューブLin-Neg画分の内容を分割する。<ol>
<li>滅菌PBS-2%NBCSの250 μLを含む無菌5 mLポリスチレンチューブに50 μLを移します。次に、その含有量を3つの無菌5 mLポリスチレンチューブに均等に分割する。これらのチューブに8-10の番号を付けます。</li>
		<li>Lin-Neg画分セル懸濁液の残りの450 μLは、チューブの番号11に対応します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>表2に記載されているように、チューブに抗体を追加します。</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>管</td>
			<td>ラベル</td>
			<td>抗体カクテル</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">総骨髄</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>未染色制御</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>単一の染色されたコントロール</td>
			<td>CD45-FITC (1/200)</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>単一の染色されたコントロール</td>
			<td>CD45-PE (1/200)</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>単一の染色されたコントロール</td>
			<td>TER119-APC (1/200)</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>単一の染色されたコントロール</td>
			<td>CD45-PECy7 (1/200)</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>単一の染色されたコントロール</td>
			<td>CD45-APC-Cy7 ビオチン (1/200)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">リンポス画分</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>単一の染色されたコントロール</td>
			<td>単一の染色されたコントロール。ストレプトアビジン-APC-Cy7 (1/500)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">リンネグ分数</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>FMOフィットコントロール</td>
			<td>cキットAPC (1/200) + スカ-1-PE (1/200) + CD16/32-PE (1/200) + CD150-PECy7 (1/200) + ストレプトアビジン-APC-Cy7 (1/500)</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>FMO PE 制御</td>
			<td>CD9-FITC (1/200) + c-kit-APC (1/200) + CD150-PECy7 (1/200) + ストレプトアビジン-APC-Cy7 (1/500)</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>FMO PECy7 コントロール</td>
			<td>CD9-FITC (1/200) + c-kit-APC (1/200) + スカ-1-PE (1/200) + CD16/32-PE (1/200) + ストレプトアビジン-APC-Cy7 (1/500)</td>
		</tr>
<tr>
<td>11</td>
			<td>選別のための正の管</td>
			<td>CD9-FITC (1/200) + c-kit-APC (1/200) + スカ-1-PE (1/200) + CD16/32-PE (1/200) + CD150-PECy7 (1/200) + ストレプトアビジン-APC-Cy7 (1/500)</td>
		</tr>
</tbody></table>表 2.
<ol start="6"><li>暗闇の中で30〜45分間氷の上でインキュベートします。</li>
	<li>4°Cで5分間400 x g で遠心分離して、滅菌PBS-2%NBCSで細胞を洗浄します。</li>
	<li>細胞ペレットを次のように再懸濁する。<ol>
<li>チューブ1〜10の場合、7AAD(2.5 μg/mL末日)を補充した無菌PBS-2%NBCSの300 μL(PBS-7AAD)でペレットを再懸濁します。 注意:7AADはDNAインターカラントであるため、適切なPPE(手袋)で取り扱う必要があります。</li>
		<li>チューブ11の場合、無菌PBS-7AAD中のペレットを、mL当たり5 x106 細胞の最大濃度および1mLの最小体積で再懸濁する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>PBS-2%NBCSの2 mLを含むMEPとMKpとラベル付けされた2つのポリプロピレンコレクションチューブを準備します。 注:または、細胞は、ソートされた細胞の後続のアプリケーションに応じて、培養培地または細胞のリシスバッファーに収集することができます。ポリスチレンチューブの使用は、関心のある細胞を含む帯電液滴との干渉の可能性があるため、推奨されません。</li>
	<li>暗闇の中で氷の上にすべてのチューブを保ちます。</li>
	<li>セルソーターのセットアップに進みます。<ol>
<li>チューブ1〜7を使用して電圧と補償を設定し、チューブ7〜10を使用して、対象の細胞集団の選別ゲートと細胞選別用のチューブ11を決定します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>格紙戦略の最初のステップは、 図 3に示すように、分析からダブレットとデッド セルを除外することを目的としています。単一の生存細胞を識別し、系統枯渇の効率を確認するためにSSC-対Lin-APC-Cy7ドットプロットを表示します。Lin- セルからゲートは、C-kitに正のセルを選択し、Sca-1およびCD16/32に対して陰性または薄暗い細胞を選択するように設定されます。選択したセルの CD9 と CD150 の式ドット プロットでは、4 つの母集団を識別できます。 メモ: MEP セルと MKp セルは、CD150 の場合も正の値です。CD9 の 3 つのレベルの式を定義できます (ネグ、ディム、高)。MKpは、中間蛍光強度レベルでCD9およびMEP発現CD9の高レベルを発現する。MEPの人口は、リン- c-Kit+ Sca-1-CD16 /32-/薄暗い CD150+ CD9薄暗い およびMKpの人口は、リン- c-キット+ Sca-1-CD16/32-/薄暗い CD150+ CD9明るい.CD150陽性細胞のCD9高位とCD9薄暗い集団の間の差別は、CD150陰性集団におけるCD9発現の最大レベルに基づいて設定される。1 つのマウスは、通常、0.6 x 10 3 MKp ± 5.3、2.4 x 103 MEP ± 27.2を 生成します。</li>
</ol>

<ol><li>Kaushansky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Historical+review%3A+megakaryopoiesis+and+thrombopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Historical review: megakaryopoiesis and thrombopoiesis.</a> Blood. 111 (3), 981-986 (2008).</li>
<li>Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clonogenic+common+myeloid+progenitor+that+gives+rise+to+all+myeloid+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages.</a> Nature. 404 (6774), 193-197 (2000).</li>
<li>Debili, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+bipotent+erythro-megakaryocytic+progenitor+in+human+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Characterization of a bipotent erythro-megakaryocytic progenitor in human bone marrow.</a> Blood. 88 (4), 1284-1296 (1996).</li>
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<li>Strassel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hirudin+and+heparin+enable+efficient+megakaryocyte+differentiation+of+mouse+bone+marrow+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Hirudin and heparin enable efficient megakaryocyte differentiation of mouse bone marrow progenitors.</a> Experimental Cell Research. 318 (1), 25-32 (2012).</li>
<li>Brouard, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+microenvironment+in+the+developing+liver+supports+the+expansion+of+megakaryocyte+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Advances%22%5BJournal%5D)">A unique microenvironment in the developing liver supports the expansion of megakaryocyte progenitors.</a> Blood Advances. 1 (21), 1854-1866 (2017).</li>
<li>Boscher, J., Gachet, C., Lanza, F., Léon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Megakaryocyte+culture+in+3D+methylcellulose-based+hydrogel+to+improve+cell+maturation+and+study+the+impact+of+stiffness+and+confinement%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3AJOVE%22%5BJournal%5D)">Megakaryocyte culture in 3D methylcellulose-based hydrogel to improve cell maturation and study the impact of stiffness and confinement.</a> Journal of Visualized Experiments:JOVE. , (2021).</li>
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<li>Shin, J. Y., Hu, W., Naramura, M., Park, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+c-Kit+expression+identifies+hematopoietic+stem+cells+with+impaired+self-renewal+and+megakaryocytic+bias%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">High c-Kit expression identifies hematopoietic stem cells with impaired self-renewal and megakaryocytic bias.</a> The Journal of Experimental Medicine. 211 (2), 217-231 (2014).</li>
</ol>

著者らは、競合する財政的利益を宣言しない。

本論文では、マウスMEPやMKpの抽出と精製が可能です。プロトコルの最適化における重要なパラメータは、ほとんどの分子および細胞ベースのアッセイと互換性のある十分な数の細胞を得ることだった。造血細胞抽出のためのマウス骨採取の一般的な実践は、通常、各マウスの大腿骨および脛骨の両方を収穫することにある。造血材料のもう一つの供給源である骨盤骨は、見落とされがちである。腸骨の紋章を収集しない理由は、マウス骨格の内部解剖学の知識が乏しく、ユーザーが大腿骨頭を横切ったり、または大腿骨の頭のすぐ上に切断して後肢を古典的に収集しているという事実です。また、脛骨や大腿骨の中央部に存在しないトラベキュラの存在により、骨髄細胞が腸骨骨から効率的に洗い流されないと考えられる場合が多い。このプロトコルでは、これら2つの懸念に対処し、骨盤骨を含む各後肢骨の適切な洗い流しを可能にする標準化された、信頼性の高い、時間効果の高い方法が提示される。特に、腸骨を使用するとマウスあたり105±7 x106 細胞が得られ、古典的な方法では通常42±5 x 106細胞が得られる 。この方法の大きな利点は、特定の数の標的細胞を得るために必要...

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Figure 2 was updated from:
<img alt="Hematopoietic cell separation diagram with flow cytometry result, showing Lin+ and Lin- fractions." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62498/62498fig02.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 2"> 
Figure 2: Magnetic depletion of lineage committed (Lin) cells. (A) Schematic representation of the magnetic depletion protocol. First, unsorted bone marrow cells are labeled with the biotin-conjugated rat anti-mouse antibody cocktail. Cells are then incubated with anti-rat Ig coated magnetic beads and subsequently subjected to the magnetic depletion using a strong magnet. The magnet will retain the labeled magnetic Lin+ fraction against the tube walls, while the unlabeled non-magnetic Lin- negative fraction will be collected in a new tube. (B) Lineage committed cells can be identified using fluorescent conjugated streptavidin. Typical analysis of the lineage expression in cells prior to magnetic depletion (total bone marrow) and after magnetic depletion (Lin- Fraction) N = 21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62498/62498fig02large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
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<img alt="Hematopoietic cell separation process diagram with antibody labeling and magnet use, flow cytometry results." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62498/62498fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 2"> 
Figure 2: Magnetic depletion of lineage committed (Lin) cells. (A) Schematic representation of the magnetic depletion protocol. First, unsorted bone marrow cells are labeled with the biotin-conjugated rat anti-mouse antibody cocktail. Cells are then incubated with anti-rat Ig coated magnetic beads and subsequently subjected to the magnetic depletion using a strong magnet. The magnet will retain the labeled magnetic Lin+ fraction against the tube walls, while the unlabeled non-magnetic Lin- negative fraction will be collected in a new tube. (B) Lineage committed cells can be identified using fluorescent conjugated streptavidin. Typical analysis of the lineage expression in cells prior to magnetic depletion (total bone marrow) and after magnetic depletion (Lin- Fraction) N = 21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62498/62498fig2v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62498">Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors</a>. A figure was updated.

Erratum: Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors

血小板は巨核球によって産生される。これらの大きな多倍細胞は骨髄に位置し、すべての血液細胞については造血幹細胞(HSC)1に由来する。骨髄における巨核球の産生の古典的な経路はHSCに由来し、それらの分化電位を徐々に制限する異なる前駆物質の生成を伴う2。巨核細胞性系統へのコミットメントに署名する最初の前駆子は、巨核球赤血球前駆細胞(MEP)であり、赤血球細胞と巨核球3、4、5の両方を産生することができる二能性前駆細胞である。その後、MEPは血小板を産生できる成熟した巨核球に分化する一能性前駆細胞/前駆体(MKp)を産生する。これらの前駆体の生成に関与するメカニズムは、巨大核球への分化および成熟と同様に複雑であり、部分的にしか理解されていない。また、分化ポテンシャルとこれらの細胞の本質的なコミットメントレベルの観点からMEP集団の不均一性は依然として不明である。これらのプロセスを解読するには、微細な分子および単一細胞解析のために、MEPおよびMKpの精製された集団を得る(またはアクセス権を持つ)必要があります。
いくつかの研究は、マウス6、7、8の巨核球系にコミットされた前駆体の同定のための細胞表面マーカーの特定の組み合わせを実証している。これらの方法からマウスからのMEPおよびMKpの精製を可能にする方法が考案された。この方法は、多数のアッセイに対して十分な数および品質の細胞を得るために最適化された。倫理的な配慮を念頭に置き、実験に関与する動物の数を最小限に抑えるために、大腿骨や脛骨から骨髄を収穫し、また腸骨の紋章から骨髄を収穫することを引き出しました。この骨は高周波と造血前駆物質の数を含み、長い骨採取中に損傷を受けるほとんどの時間です。ここで提示すると、この骨の信頼性の高いコレクションのための詳細な方法です。
最適化の第2の基準は、高度に精製された細胞集団を生成することです。蛍光活性化細胞選別(FACS)は、目的の細胞の精製集団を得るために選択する方法である。しかし、関心のある細胞集団が非常にまれである場合、低収量に達する。したがって、エンリッチメント手順が必要です。このプロトコルでは、磁気ビーズを使用して負の選択手順を選択しました。

<table><tbody><tr><td>21ゲージ針</td><td>BD Microlance</td><td>301155</td><td></td></tr><tr><td>7AAD</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9400</td><td></td></tr><tr><td>抗体 Gr-1-biotin</td><td>eBioscience</td><td>13-5931-85</td><td>磁気破壊</td></tr><tr><td>抗体 B220-biotin</td><td>eBioscience</td><td>13-0452-85</td><td>磁気破壊</td></tr><tr><td>抗体 Mac-1-biotin</td><td>eBioscience</td><td>13-0112-85</td><td>磁気Magnetic depletion</td></tr><tr><td>Antibody CD3e-biotin</td><td>eBioscience</td><td>13-0031-85</td><td>Magnetic depletion</td></tr><tr><td>Antibody CD4-biotin</td><td>eBioscience</td><td>13-9766-82</td><td>Magnetic depletion</td></tr><tr><td>Antibody CD5-biotin</td><td>eBioscience</td><td>13-0051-85</td><td>Magnetic depletion</td></tr><tr><td>Antibody CD8a-biotin</td><td>eBioscience</td><td>13-0081-85</td><td>Magnetic depletion</td></tr><tr><td>AntibodyTER119-biotin</td><td>eBioscience</td><td>13-5921-85</td><td>磁性破壊</td></tr><tr><td>抗体 CD127-biotin</td><td>eBioscience</td><td>13-1271-85</td><td>磁性破壊</td></tr><tr><td>抗体 CD45-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0451-85</td><td>セルソーティング</td></tr><tr><td>抗体 CD45-PE</td><td>eBioscience</td><td>12-0451-83</td><td>セルソーティング</td></tr><tr><td>抗体 TER119-APC</td><td>eBioscience</td><td>17-5921-83</td><td>セルソーティング</td></tr><tr><td>抗体 CD45-PECy7</td><td>eBioscience</td><td>25-0451-82</td><td>セルソーティング</td></tr><tr><td>抗体 CD45-biotin</td><td>eBioscience</td><td>13-0451-85</td><td>セルソーティング</td></tr><tr><td>抗体 CD9-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0091-82</td><td>セルソーティング</td></tr><tr><td>抗体&nbsp; c-kit-APC</td><td>eBioscience</td><td>17-1171-83</td><td>セルソーティング</td></tr><tr><td>抗体 Sca-1-PE</td><td>eBioscience</td><td>12-5981-83</td><td>Cell</td></tr><tr><td>sorting 抗体 CD16/32-PE</td><td>eBioscience</td><td>12-0161-83</td><td>Cell sorting</td></tr><tr><td>Antibody CD150-PECy7</td><td>eBioscience</td><td>25-1502-82</td><td>Cell sorting</td></tr><tr><td>Culture medium StemSpan-SFEM</td><td>Stemcell technologies</td><td>#09650</td><td></td></tr><tr><td>解剖パッド</td><td>Fisher Scientific</td><td>10452395</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>vWR化学薬品</td><td>83813.360</td><td></td></tr><tr><td>鉗子</td><td>ユーロネクシア</td><td>P-120-AS</td><td></td></tr><tr><td>ガラスパスツールピペット</td><td>ダッ</td><td>チャー42011</td><td></td></tr><tr><td>磁石:&nbsp;DynaMag-5</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12303D</td><td></td></tr><tr><td>磁気ビーズ: Dynabeads Sheep Anti-Rat IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11035</td><td></td></tr><tr><td>Megacult</td><td>Stemcell technologies</td><td>#04970</td><td></td></tr><tr><td>MethoCult SF M3436</td><td>Stemcell technologies</td><td>#03436</td><td></td></tr><tr><td>Newborn Calf Serum</td><td>Dutscher</td><td>50750-500</td><td></td></tr><tr><td>Red Cell Lysisソリューション</td><td>BD Bioscience</td><td>555899</td><td></td></tr><tr><td>メス</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12308009</td><td></td></tr><tr><td>ハサミ</td><td>Euronexia</td><td>C-165-ASB</td><td></td></tr><tr><td>滅菌済み 1 mL シリンジ</td><td>BD Bioscience</td><td>303172</td><td></td></tr><tr><td>滅菌済み 15mL チューブ</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>滅菌済み 5mL ポリプロピレンチューブ</td><td>ファルコン</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>滅菌5mLポリスチレンチューブ</td><td>ファルコン</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>70&microの滅菌チューブ;m細胞ストレーナーキャップ</td><td>ファルコン</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>滅菌ペトリ皿</td><td>ファルコン</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>ストレプトアビジン-APC-Cy7</td><td>BD バイオサイエンス</td><td>554063</td><td>細胞選別</td></tr><tr><td>チューブローラー</td><td>ベンチマークサイエンティフィック</td><td>R3005</td><td></td></tr></tbody></table>

マウスメガ核球前駆細胞の分離

Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors

骨髄巨核球は血小板の産生を保障する大きい多倍化細胞である。彼らは、造血幹細胞から巨核代を介して生じる。このプロセスの最終段階は複雑で古典的に二能性の巨核球-赤血球前駆細胞(MEP)と単一の巨大核球前駆細胞(MKp)を含む。これらの集団は、ボナフィデス巨核球の形成に先行し、そのように、その分離と特徴付けは、巨核球形成の堅牢で公平な分析を可能にする可能性がある。このプロトコルは、マウス骨髄から造血細胞を収集する手順、磁気枯渇を介した造血前駆物質の濃縮、そして最後に高度に精製されたMEPおよびMKp集団をもたらす細胞選別戦略を提示する。まず、骨髄細胞は大腿骨、脛骨、および腸骨紋から採取され、また、造血前駆腫の数が多い骨である。腸骨の骨の使用は、マウスごとに得られる総細胞数を大幅に増加させ、したがって、動物のより倫理的な使用に貢献する。450 nmの磁気ビーズを使用して磁気系統の枯渇を最適化し、フローサイトメトリーによる非常に効率的な細胞選別を可能にしました。最後に、このプロトコルは、MEP(Lin - Sca-1-c-Kit + CD16/32-CD150+CD9薄暗い)とMKp(Lin - Sca-1-c-kit + CD16/32 - CD150 + CD99)の選別のためのラベリングと格子戦略を提示します。).この技術は実装が容易で、i)分子特性評価を行うのに十分な細胞材料を提供し、そのアイデンティティと生物学のより深い知識、ii)インビトロ分化アッセイは、巨大核球の成熟のメカニズムのより良い理解を提供する、またはiii)彼らの微小環境との相互作用のインビトロモデルをより良く理解する。

MEPおよびMKpとして同定された細胞の表現型分析は、フローサイトメトリーによって行った。細胞は、CD41aおよびCD42c、巨核球および血小板系統の古典的マーカーに対する蛍光共役抗体で標識した。両方のマーカーは、これらのマーカーがMEP集団の細胞の表面でまだ検出されていない間にMKp集団の細胞によって発現した(図4Ai,4Aii)。多倍数は巨核球の特徴です。分類された集団のDNA含有量も分析され、細胞がMEP集団に対して主に2Nであり、MKp細胞のごく一部が4Nであることを実証したが、これらの集団では高いプロイドが有意に検出されない(図4Aiii)。
分類された細胞集団の同一性を確認するために、巨核球系およびエリスロイド系統に対するそれらの分化能力を評価するために、いくつかの分化アッセイが行われた。まず、半固体クロノゲンアッセイを行い、巨核細胞性前駆体(CFU-MK)およびエリスロイド前駆体(BFU-E)を定量化した。CFU-M...

この方法は、マウス大腿骨、脛骨、および骨盤骨からのMEPおよびMKpのフローサイトメトリーによる精製を記述する。

Bone marrow megakaryocytes are large polyploid cells that ensure the production of blood platelets. They arise from hematopoietic stem cells through ...

主要なメガ核球前駆細胞集団の単離は、単一細胞レベルまで、分子アッセイ上の細胞培養における系統階層の微細な分析を可能にする。このプロトコルは、MEPおよびMKP集団の細胞分類のための効率的なプロセスにおいて、必要な動物の数を最小限に抑えることによって、より倫理的な実践を組み合わせた。骨の場合、コレクションは70%エタノールで8〜12週齢のC57ブラックシックスマウスの体をスプレーします。はさみを使用して、脊椎に垂直な皮膚の切開部を5〜1センチメートルにする。そして、それを引っ張ることによって、全身の周りの皮膚を引き裂きます。解剖パッドの上にマウスの顔を下に置き、露出した背骨に沿って上から下に指やはさみをスライドさせて骨盤の骨を見つけます。腸骨の紋章を見つけるには、後肢近くの腰部の小さな隆起を特定します。はさみを脊椎に平行に置き、椎骨に対して、腸骨の凸部に近い、骨盤骨の上の背骨の側に沿って筋肉を切断し、椎骨に沿ってはさみを尾まで滑らせて進む。その後、椎骨と腸骨の頂上の間を切断し、可能な限り椎骨の近くに滞在します。そして、体から手足を切り離すために残りの筋肉をカットします。取り外した手足をきれいな表面に移します。制度的なガイドラインに従って体の残りの部分を廃棄した後、周囲の組織を除去することによって、骨盤、大腿骨、脛骨の骨を露出させるために鉗子とメスを使用する。鉗子を使用して大腿骨の遠位端を保持し、骨盤骨から大腿骨の頭部を慎重に切断し、精神病の周りの筋肉をメスで優しくスライスします。骨盤骨から残りの筋肉を削り取り、大腿骨頭を保持していた空洞の真ん中で切断する。イリウムを保持し、骨の三角形の薄い側を捨てます.メスを使用して、イリウムの周りの残留組織を除去し、2%新生児子牛血清を補充滅菌PBSに洗浄した骨を置く。その後、はさみを使用して足首の脚から足を切り落とします。脛部の下部を鉗子で保持し、筋肉を膝に向かってこすり上げます。フィブラを捨てる。その後、メスで脛目の高原を横切ってカットを行い、滅菌PBS 2%NBCSに脛を置きます。大腿骨の周りの残留組織を取り除いた後、鉗子で大腿骨の上側を保持し、膝蓋骨の基部にメスの刃を置きます。膝蓋骨に向かって力を加える,大腿骨に平行に膝蓋骨を外す。次に、大腿骨を滅菌PBS2%NBCSに入れる。層流キャビネットで、滅菌PBS 2%NBCSで満たされた滅菌ペトリ皿に骨を移します。メスを使って大腿骨の頭を切り落とします。1ミリリットルのシリンジに滅菌PBS 2%NBCSを充填し、21ゲージ針をコンセントに取り付けます。その後、滅菌PBS 2%NBCSの2ミリリットルで5ミリリットルのポリプロピレンチューブを充填します。大腿骨を鉗子で保持し、左の溝に針を挿入し、回転を適用してニーキャップ除去した後、針が骨に完全に挿入されることを確認し、ベベルまで。針を挿入した後、2ミリリットルのPBS 2%NBCSを含むチューブに針を入れた骨を移す。その後、PBS 2%NBCSを分配し、吸引し、注射器から骨がはっきりするまで引き出す。大腿骨から針を取り出し、大腿骨の頭部があった反対側の穴に挿入します。緩衝液を分配し、吸引した後、骨を捨てる。腸骨の紋章と脛骨の場合は、鉗子を使用して骨を保持し、回転を適用して開いた側に針をそっと挿入します。針が完全に骨に挿入されていることを確認します, ベベルまで.次に、針で骨を2ミリリットルのPBS 2%NBCSを含むチューブに移します。骨がはっきりするまで、注射器からPBS2%NBCSを分配し、吸引する。すべての細胞懸濁液を40ミクロンの細胞ストレーナーキャップを通し、無菌5ミリリットルポリスチレンチューブに入れ、PBS 2%NBCSの500マイクロリットルを加えます。総骨髄として細胞懸濁液の100マイクロリットルを脇に置きます。その後、染色手順のために氷の上に保管してください。ペレットは遠心分離により濾過懸濁液を用いた。上清を捨て、作りたての一次抗体カクテルでペレットを氷の上のインキュベーションで30〜45分間再懸濁します。細胞懸濁液の10マイクロリットルを無菌5ミリリットルポリスチレンチューブに取り付け、リン・ポール・フラクションとラベル付けし、PBS 2%NBCSの90マイクロリットルを追加します。一方、30秒間完全に渦を出して、バイアルで再懸濁して、磁気枯渇のためのビーズを準備します。ターゲットセルあたり2つのビーズに対応するビーズの体積を5ミリリットルのポリプロピレンチューブに移し、PBS 2%NBCSで2回ビーズを洗浄し、マグネットにチューブを置きます。滅菌ガラス低温殺菌ピペットで洗浄バッファーを除去した後、無菌PBS2%NBCSの500マイクロリットルでビーズを再懸濁する。磁気枯渇の最初のステップでは、洗浄された細胞のペレットに250マイクロリットルのビーズを加え、氷の上で5分間穏やかな混合でインキュベートします。その後、2ミリリットルの滅菌PBS 2%NBCSを加え、穏やかな混合で、チューブを磁石に2分間入れます。無菌ガラスパスツールピペットで非磁性分画を収集する。そして、磁気枯渇の第二のステップのために、磁気ビーズの残りの250マイクロリットルにそれを追加します。パラフィンで密封したチューブをチューブローラーに20分間、摂氏4度で置きます。次に、穏やかな混合で滅菌PBS 2%NBCSの2ミリリットルを追加します。そして、磁石でチューブを2分間置きます。非磁性分画を無菌5ミリリットルポリプロピレンチューブに集め、無菌ガラスパストルールピペットを用いて非磁性リンネ画分を、テキスト原稿に記載されているように、巨核球前駆体の細胞選別を進める。細胞選別のための格言戦略では、Lin Neg集団において、C-kitを発現する細胞、およびSca-1またはCD16/32抗原の発現が低いから低い細胞が選択される。この集団では、MEPはCD150陽性およびCD9薄暗細胞として同定される。CD150陽性、およびCD9明るい細胞としてのMKP。代表的なフローサイトメトリー分析では、MEPおよびMkpとして同定された細胞は、巨核球および血小板系統のCD41aおよびCD42c古典マーカーに対する蛍光共役抗体で標識した。両方のマーカーをMKp集団の細胞によって発現させ、MEP集団の細胞の表面で検出されなかった。並べ替えられた巨核球のDNA含有量は、細胞が主にMEP集団にとって2nであることを実証した。そして、MKp細胞のごく一部は異物である。より高いプロイド細胞は、これらの集団において有意に検出されなかった。半固体クロノゲンアッセイでは、CFU-MKはMEPおよびMKp集団の両方で検出された。BFU-EはMKp集団では検出されなかったが、MEPおよび、CD150陰性CD9薄暗い前駆細胞集団で検出された。分化3日目の顕微鏡観察は、MEPおよびMKpが主に巨核球を産生し、大細胞として同定したことを示す。3日間培養した後に得られた巨核球は、CD41およびCD42c発現を用いて同定し、MEPおよびMKp細胞集団から産生された細胞の54、および82%をそれぞれ表す。生成された巨核球のプロイドは、MKp集団に由来する巨核球からより大きかったが、MEP集団と比較した。MKp集団に由来する細胞のみ、プロ血小板放出が可能であったため、MKp集団に対するより高度な成熟段階を示唆した。骨盤骨の使用は、細胞数に大幅に増加し、一方、2段階の磁気枯渇は系統枯渇の有効性を改善する。このプロトコルは、単一細胞のMEPおよびMKp集団のその後の培養を可能にし、トランスクリプトミックおよびプロテオミクス分析と共に、関与するメカニズムを確かに解読し、実施された生物新生を有する。

isolation-of-mouse-megakaryocyte-progenitors

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

酵素的解離、線維/脂肪細胞とマウス骨格筋からの筋原性前駆細胞のフローサイトメトリーによる表面標識および精製方法。...

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フローサイトメトリーにおける骨髄造血前駆細胞の分布と同様に効率的に分離するために高度に精製された造血幹細胞（HSC）を分析する方法が記載されている。アイソレーション·プロシージャは、本質的には、c-Kit...

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マウス胚性造血内皮細胞の単離

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ヒト骨髄から単離することMesangiogenic前駆細胞（MPCは）

体外培養の細胞の迅速かつ特定の分離を可能にするプライマリ マウス オリゴデンドロ...

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寡能性と系列拘束されたマウスの骨髄から骨髄前駆細胞の分離と同定

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マウスの新鮮な骨髄のプロ血小板形成ダイナミクス

細胞の立体環境は、その行動、成熟および/または分化において重要な役割を果たすことができることが認められています。このプロトコルは、巨大核球に対する物理的な封じ込めおよび機械的制約の影響を研究するために設計された3次元細胞培養モデルを記述する。...

細胞成熟を改善し、剛性と閉じ込めの影響を研究する3Dメチルセルロース系ヒドロゲルにおける巨核球培養

ここでは、柱状磁気活性化細胞選別を利用して、脱髄疾患の動物モデルにおける原発性ミクログリアを単離および精製するためのプロトコルを提示する。...

脱髄の動物モデルにおける磁気活性化細胞選別によるマウス原発性ミクログリアの単離

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マウスからの血管壁常在型CD34+ 幹細胞の免疫磁気的単離

学ぶマウス骨髄からのメガ核球前駆細胞（MEP・MKp）の効率的な分離法。腸骨稜を含む採取と磁気リネージ除去により、高純度細胞を得て後続の分子解析や機能解析を可能にする倫理的なプロトコルです。

マウスメガ核球前駆細胞の分離

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