Name: 細胞成熟を改善し、剛性と閉じ込めの影響を研究する3Dメチルセルロース系ヒドロゲルにおける巨核球培養 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: 学ぶ3Dメチルセルロースヒドロゲル培養法で、マウス造血幹細胞からの巨核球分化と前血小板形成を制御する機械的閉じ込めと剛性の影響を評価する手法。この方法は骨髄環境を模倣し、細胞成熟を促進します。

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著者らは、最初に実験室でこの技術を開発したファビアン・ペルトゥイとアリシア・アギラール、ならびにメチルセルロースヒドロゲルの粘弾性特性を特徴づけたドミニク・コリン(チャールズ・サドロン研究所 - ストラスブール)に感謝したいと考えています。この作品は、ARMESA(メデシン・エ・サンテ・パブリケ協会)とARN助成金(ANR-18-CE14-0037 PlatForMechanics)によって支えられました。ジュリー・ボッシャーは、フォンダシオンの受賞者で、レシェルシュ・メディカル(FRM助成金番号FDT202012010422)を注ぎます。

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

過去10年間で、メカノバイオロジーは生物学の多くの分野でますます関心を集めています。細胞を取り巻く機械的環境が行動に役割を果たしていることが一般的に認められ、巨核球が細胞外の機械的手がかりをどのように感知し、反応するかを研究することの重要性を強調しています。特に大型哺乳類の骨骨の中に位置する造血用赤い骨髄を考慮すると、糖尿病からより容易にアクセス可能な骨髄がジポサイト(黄色骨髄)12で構成されているのが特に、その場で骨髄組織の剛性を正確に測定することは困難である。糖尿病が本質的に赤い骨髄を含むマウスから単離された骨髄の場合、もう一つの問題は、骨から抽出されると、組織が凝集したままでなさいということです。しかし、シンと共同研究者は、原子間力顕微鏡を用いてマウスジアフィシス骨髄剛性を測定することができ、最も柔らかい組織の中に骨髄を配置するE骨髄=0.3±0.1kPaの値を発見した。
ここで説明する手順の目...

体内の細胞は複雑な3D微小環境を経験し、隣接する細胞および周囲のマトリックス1、2、3による組織からの剛性および閉じ込めを含む化学的およびメカノ物理的手掛かりとの相互作用を受ける。細胞行動の剛性と閉じ込めの重要性は、過去数十年でしか認識されていません。2006年、Englerら4の精力的な研究は、細胞分化のための機械的環境の重要性を強調した。その結果、細胞基質剛性のばらつきが、幹細胞の様々な分化系統に向かう方向を生じることを実証した。それ以来、機械的手掛かりが細胞の運命や行動に与える影響はますます認識され、研究されるようになった。それは生物の最も柔らかい組織の一つであるにもかかわらず、骨髄は骨の中に閉じ込められている3D構造組織を有する。骨髄の剛性は、技術的には正確に測定することは困難であるが、15と300 Pa5、6の間にあると推定される。間質の中で、細胞は互いにしっかりと閉じ込められている。さらに、それらのほとんどは血液循環に入るために、シヌサイド血管に向かって移動しています。これらの条件は、隣接する細胞に追加の機械的拘束を作成します, これらの力に適応する必要があります.機械的手掛かりは、巨核球分化とプロ血小板形成に対する結果が最近検討された重要なパラメータを表しています。巨核球は従来の液体培養においてインビトロで分化することができるが、それらは3D環境7からの機械的手掛かりがないこともあって、生体内で観察される成熟度に達しない。ヒドロゲルに埋め込まれた前駆物質の成長は液体ミリューに欠けている3Dの機械の手掛かりをもたらす。
ヒドロゲルは、造血前駆物質を定量化するアッセイを形成するコロニーで細胞を成長させるために、特に、血球学的分野で数十年にわたって広く使用されてきました。しかし、このようなヒドロゲルは、造血細胞の成熟および分化に対する3D機械的環境の生物学的影響を探求するためにほとんど使用されていない。ここ数年、私たちの研究室はメチルセルロースベースのヒドロゲル 8を用いた3D培養モデルを開発しました。この非反応性物理ゲルは、天然の巨核球環境の物理的制約を模倣するのに有用なツールです。これは、メトキシド基(-OCH3)によるヒドロキシル残基(-OH)の置換によりセルロースに由来する。メチル置換の程度とメチルセルロース濃度の両方が、一度ジェリ化したヒドロゲル剛性を決定します。この技術の開発段階において、30~60 Paの範囲のヤング率が、巨核球増殖に最適なゲル剛性 である9を実証した。
以下のプロトコルは、3Dメチルセルロースヒドロゲル中でマウス巨核細胞性前駆物質を成長させる方法を説明する。従来、標準的な液体培養物と比較して、このヒドロゲル培養は巨核球の多倍化の程度を増加させ、成熟および細胞内組織を改善し、そして、液体培地 9に再懸濁されたプロ血小板を拡張する巨核球の能力を増加させることが示されている。本稿では、マウス骨髄Lin-細胞の単離プロトコルと3D培養用メチルセルロースヒドロゲルへの埋め込み、プロ血小板を産生する能力の定量化、さらなる分析のための細胞回収について詳細に説明する。

<table><tbody><tr><td>18ゲージ針</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1001735825</td><td></td></tr><tr><td>21ゲージ針</td><td>BD Microlance</td><td>301155</td><td></td></tr><tr><td>23ゲージ針</td><td>テルモ</td><td>AN*2332R1</td><td></td></tr><tr><td>25ゲージニールデス</td><td>BD Microlance</td><td>300400</td><td></td></tr><tr><td>4ウェル培養皿</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>144444</td><td></td></tr><tr><td>5mLシリンジ</td><td>テルモ</td><td>SS+05S1</td><td></td></tr><tr><td>Cytoclips Microm</td><td>Microtech</td><td>F/CLIPSH</td><td></td></tr><tr><td>フィルターカードを装備したサイトファンネル</td><td>Microm Microtech</td><td>F/JC304</td><td></td></tr><tr><td>Cytospin 遠心分離機</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Cytospin 4</td></tr><tr><td>Dakopen</td><td>Dako</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM 1x</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>41 966-029</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ14190-094</td>滅菌<td>ダルベッコ'リン酸緩衝生理食塩水</td></tr><tr><td>EasySep</td>磁石 <td>幹細胞技術</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>EasySepマウス造血前駆細胞単離キット</td><td>幹細胞技術</td><td>19856A</td><td>ビオチン化抗体 (CD5,CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119,7&ndash;4) およびストレプトアビジン被覆磁気ビーズ</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児 血清</td><td>ヘルスケア ライフサイエンス</td><td>SH30071.01</td><td></td></tr><tr><td>ルアーロック 1 mL シリンジ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z551546-100EA</td><td>または BD MEDICAL の 309628 シリンジ</td></tr> ル<tr><td>アーロック シリンジ コネクタ</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>11891120</td><td></td></tr><tr><td>MC 3%</td><td>R&アンプ;D systems</td><td>HSC001</td><td></td></tr><tr><td>ポリリシンコーティングスライド</td><td>Thermo Scientific</td><td>J2800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>PSG 100x</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>1037-016</td><td>10,000 units/mL penicillin, 10,000 &mu;g/mL ストレプトマイシンおよび29.2 mg/mLグルタミン</td></tr><tr><td>ラット血清</td><td>幹細胞技術</td><td>13551</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒルジン</td><td>Transg&egrave;ne</td><td>rHV2-Lys47</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒトトロンボポエチン (rhTPO)</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>2822</td><td>10,000 units/mL</td></tr><tr><td>丸底 10 mL プラスチックチューブ</td><td>Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>丸底 5 mL ポリスチレンチューブ</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

細胞成熟を改善し、剛性と閉じ込めの影響を研究する3dメチルセルロース系ヒドロゲルにおける巨核球培養

Megakaryocyte Culture in 3D Methylcellulose-Based Hydrogel to Improve Cell Maturation and Study the Impact of Stiffness and Confinement

閉じ込めと機械的な制約の両方につながる3D環境は、細胞の挙動の重要な決定要因としてますます認識されています。3D培養は、 インビボ の状況によりよく近づくために開発されました。巨核球は骨髄(BM)における造血幹細胞および前駆細胞(HSPCs)と区別する。BMは、骨の中に閉じ込められた身体の最も柔らかい組織の一つです。骨は細胞スケールで十分に拡張できないが、巨核球は弱い剛性と高い閉じ込めを受ける。このプロトコルは、メチルセルロースからなる3D培地における免疫磁気選別と成熟した巨核球への分化によるマウス系分(Lin-)HSPCsの回復方法を提示する。メチルセルロースは巨核球に対して非反応性であり、その剛性は正常な骨髄のそれに調節されるか、または病理学的線維性骨髄を模倣するように増加することができる。さらなる細胞分析のために巨核球を回収するプロセスもプロトコルで詳述されている。プロ血小板の伸長は3Dミリュー内で防止されるが、メガ核球を液体培地で再懸濁し、プロ血小板を拡張する能力を定量化する方法を以下に説明する。3Dヒドロゲルで成長した巨核球は、液体ミリューで増殖したものに比べてプロ血小板を形成する能力が高い。この3D培養により、i)より高い成熟状態に達する巨核球に対する前駆細胞を区別することができ、ii) 生体内で 観察されるかもしれないが古典的な液体培養では気付かれないフェノタイプを再現し、iii)3D環境によって提供される機械的手がかりによって誘発される伝達経路を研究する。

このプロトコルを使用して取得したデータは、もともと20169でブラッドに公開されました。
プロトコルによれば、細胞を液体またはメチルセルロースヒドロゲル培地に播種した。液体培地中の細胞は、硬いプラスチック表面に接触し、いつか他の細胞と接触して、ウェルの底部に沈積物を持っています。対照的に、メチルセルロースヒドロゲルに埋め込まれた細胞は、ゲル中で均一に分布し、隣接する細胞から単離される(図3A)。メチルセルロースゲルは、2%の最終濃度で、液体培養物(図3B)に比べて平均巨核球径を非常にわずかに増加させ、より高い報告されたプロイド9に従う。対照的に、メチルセルロース濃度を0.5%上昇すると、小さな平均直径で示されるように巨核球分化が損なわれる(図3B)。
液体...

細胞の立体環境は、その行動、成熟および/または分化において重要な役割を果たすことができることが認められています。このプロトコルは、巨大核球に対する物理的な封じ込めおよび機械的制約の影響を研究するために設計された3次元細胞培養モデルを記述する。

細胞成熟を改善し、剛性と閉じ込めの影響を研究する3Dメチルセルロース系ヒドロゲルにおける巨核球培養

The 3D environment leading to both confinement and mechanical constraints is increasingly recognized as an important determinant of cell behavior. 3D ...

このプロトコルは、天然の巨核球が骨髄内でそれらの挙動および成熟に曝される閉じ込めおよび中硬度の影響のインビトロ評価を可能にする。この手法の主な利点は、細胞とセルマトリックスの相互作用を排除し、機械的な側面に焦点を当てた簡略化されたモデルです。良い実験室の練習および無菌の労働条件は厳密に観察されるべきである。実際、ヒドロゲルのわずかな汚染でさえ、巨核球分化に劇的な影響を与える可能性があります。ヒドロゲル細胞培養の単一のウェルを得るためには、室温で3%メチルセルロースの2つの1ミリリットルアリコートを解凍し、最初に1ミリリットルを引き出してすべてを排出することによって、メチルセルロースで1ミリリットルルアーロックシリンジをコーティングします。次に、同じ注射器と針を使用して、新鮮なアリコートから333マイクロリットルのメチルセルロースを引き出す。針を慎重に取り外した後、滅菌鉗子を使用して、ルアーロックコネクタをシリンジの端にねじ込み、2番目の非コーティングされた1ミリリットルのルアーロックシリンジをコネクタに取り付けます。2つの注射器の間にメチルセルロースを均等に分配し、脇に置きます。次に、濃縮培養培地中の以前に単離されたマウス系統陰性造血幹細胞および前駆細胞を、167マイクロリットル当たり6細胞に10倍の密度で再懸濁する。コネクターからスポイトの1つを取り外し、167マイクロリットルの細胞懸濁液をコネクタに直接取り出し、同時にシリンジプランジャーをゆっくりと引き出して細胞懸濁液のスペースを作ります。すべてのセル懸濁液をコネクタに追加した後、プランジャーをさらに引き出してコネクタから懸濁液を引き出し、2番目のシリンジを慎重に再接続し、スクリュースレッドの懸濁液を失わないように注意してください。メチルセルロース培地を細胞懸濁液で均質化するには、2つのシリンジの間を10回ゆっくりとスライプターを前後に動かし、合計体積を1つのシリンジに引き出し、2つの注射器を取り外し、コネクタを空のシリンジに残します。4ウェルプレートの1つのウェルに注射器の内容物を空にし、5%の二酸化炭素の下で37度でプレートをインキュベートします。プロ血小板を分析するには、培養3日目に、1%PSGで10ミリリットルのDMEMを含む15ミリリットルチューブに1つの井戸からすべての細胞を慎重に移す。メチルセルロースを完全に希釈し、室温で300倍Gでチューブを5分間遠心分離して、細胞を穏やかにピペット化して再懸濁します。上清を捨て、細胞ペレットを完全な培養培地の1ミリリットルで再懸濁し、4ウェルプレートのウェル当たり500マイクロリットルで細胞を再播種する。5%の二酸化炭素の下で摂氏37度でプレートをインキュベートします。翌日、20Xの目的を持つブライトフィールド顕微鏡を使用して、井戸あたり10枚の画像をランダムに取得し、視野に細胞が多すぎないようにし、フィールドごとに少なくとも5つの巨核球を捕獲します。ImageJを使用して、各画像の巨核球の総数とプロメトレットを拡張するものを数え、プロ血小板を伸ばす巨核球の割合を計算する。将来の分析のために細胞を固定するには、ゲルを破壊することなくメチルセルロースの上に固定液を追加します。使用する固定剤に応じて適切な時間を待った後、P1000ピペットを使用して、メチルセルロースが均一に希釈されるまで固定液とゲルを穏やかにピペット化します。同じピペットチップを使用して、10ミリリットルのDPBSを含む15ミリリットルのチューブに井戸のすべての内容物を移し、混合して均質化します。混合物を遠心分離します。上清を捨て、目的の分析に適した培地で巨核球ペレットを再懸濁する。培養3日目までに、液体培地中の巨核球は井戸底で沈積し、硬いプラスチック表面と他の細胞と接触している。対照的に、メチルセルロースヒドロゲルに埋め込まれた細胞は、均一に分布し、隣接する細胞から単離される。異なる培養条件下での巨核球の平均直径の分析によると、2%メチルセルロースは液体培養物と比較して平均巨核球径をわずかに増加させる。しかし、メチルセルロース濃度を0.5%上昇すると、小さな平均直径で示されるように巨核球分化が損なわれる。代表的な透過型電子顕微鏡画像では、骨髄内で生体内で分化した巨核球中の細胞内皮質膜は、線引き細胞質領域と密接に対立しているように見える。液体培養では、膜は、細胞質領域を区切ることなく、小さな丸い楕円形の外観または細長い小胞をほとんど有する。対照的に、2%メチルセルロース培養は、in in situ構造に似た細胞質領域を区切る膜に密接に反対している。培養の4日目までに、ヒドロゲルで以前培養した巨核球は、液体培地で培養したものと比較してプロ血小板形成の増加を示す。プロメトレットを拡張する巨核球の平均割合は、メチルセルロースヒドロゲル前培養で35〜40%であったのに対し、液体前培養では通常15~20%程度である。この手順を試みる場合、最終的なメチルセルロース濃度のわずかな変化がメディアの剛性を著しく変化させることができるので、適切な体積を極めて正確にピペットすることが重要である。ヒドロゲルにおける細胞成熟後、巨核球は、フローサイトメトリーによるプロイドおよび細胞マーカー解析のために回収されるか、または対象タンパク質の電子顕微鏡または免疫染色のために固定することができる。

megakaryocyte-culture-3d-methylcellulose-based-hydrogel-to-improve

Research

JoVE Journal

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