Name: イン・ヴィヴォ マウスの頭蓋骨骨髄における巨核球とプロ血小板の2光子イメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: 学ぶマウス頭蓋骨骨髄における巨核球とプロ血小板の2光子イメージング法。蛍光標識とマイナー外科手術を用いて、血小板産生の動態をリアルタイムで可視化・定量化する技術です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

著者らは、フロリアン・ガートナー(オーストリアのクロスターノイブルク科学技術研究所)に、私たちが実験室で技術を確立した当時の2光子顕微鏡実験に関する専門家のアドバイスと、イメージングセンターIGBMC /CBI(フランスのイキルヒ)のイヴ・ルッツの専門知識と2光子顕微鏡の助けに感謝したいと考えています。また、ジャン=イヴ・リンケルの技術的な助けと、イネス・ギナードのスキーマの描画に対して、図1に感謝します。ARMESA(2光子顕微鏡の獲得に向けた支援を受けたARMESA(メデシン・エ・サンテ・プブリケ協会)に感謝します。ABは、エタブリセ・フランセ・デュ・サン(APR2016)とアジェンス・ナショナル・デ・ラ・レシェルシュ(ANR-18-CE14-0037-01)の博士研究員によって支えられました。

<ol><li>Junt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+visualization+of+thrombopoiesis+within+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow.</a> Science. 317 (5845), 1767-1770 (2007).</li>
<li>Mazo, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+progenitor+cell+rolling+in+bone+marrow+microvessels%3A+parallel+contributions+by+endothelial+selectins+and+vascular+cell+adhesion+molecule+1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimenal+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic progenitor cell rolling in bone marrow microvessels: parallel contributions by endothelial selectins and vascular cell adhesion molecule 1.</a> Journal of Experimenal Medicine. 188 (3), 465-474 (1998).</li>
<li>Bornert, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal-based+mechanisms+differently+regulate+in+vivo+and+in+vitro+proplatelet+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal-based mechanisms differently regulate in vivo and in vitro proplatelet formation.</a> Haematologica. , (2020).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingosine+kinase+2+%28Sphk2%29+regulates+platelet+biogenesis+by+providing+intracellular+sphingosine+1-phosphate+%28S1P%29%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Sphingosine kinase 2 (Sphk2) regulates platelet biogenesis by providing intracellular sphingosine 1-phosphate (S1P).</a> Blood. 122 (5), 791-802 (2013).</li>
<li>Kowata, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+demand+modulates+the+type+of+intravascular+protrusion+of+megakaryocytes+in+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Platelet demand modulates the type of intravascular protrusion of megakaryocytes in bone marrow.</a> Thrombosis and Haemostasis. 112 (4), 743-756 (2014).</li>
<li>Nishimura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-1alpha+induces+thrombopoiesis+through+megakaryocyte+rupture+in+response+to+acute+platelet+needs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">IL-1alpha induces thrombopoiesis through megakaryocyte rupture in response to acute platelet needs.</a> Journal of Cell Biology. 209 (3), 453-466 (2015).</li>
<li>Lefrancais, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lung+is+a+site+of+platelet+biogenesis+and+a+reservoir+for+haematopoietic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The lung is a site of platelet biogenesis and a reservoir for haematopoietic progenitors.</a> Nature. 544 (7648), 105-109 (2017).</li>
<li>Potts, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+budding+is+a+major+mechanism+of+in+vivo+platelet+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Membrane budding is a major mechanism of in vivo platelet biogenesis.</a> Journal of Experimental Medicine. 217 (9), 20191206(2020).</li>
<li>Scott, M. K., Akinduro, O., Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+4-dimensional+tracking+of+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+in+adult+mouse+calvarial+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">In vivo 4-dimensional tracking of hematopoietic stem and progenitor cells in adult mouse calvarial bone marrow.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51683(2014).</li>
<li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).</li>
<li>Tiedt, R., Schomber, T., Hao-Shen, H., Skoda, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pf4-Cre+transgenic+mice+allow+the+generation+of+lineage-restricted+gene+knockouts+for+studying+megakaryocyte+and+platelet+function+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Pf4-Cre transgenic mice allow the generation of lineage-restricted gene knockouts for studying megakaryocyte and platelet function in vivo.</a> Blood. 109 (4), 1503-1506 (2007).</li>
<li>Pertuy, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broader+expression+of+the+mouse+platelet+factor+4-cre+transgene+beyond+the+megakaryocyte+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Broader expression of the mouse platelet factor 4-cre transgene beyond the megakaryocyte lineage.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 13 (1), 115-125 (2015).</li>
<li>Calaminus, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+tracing+of+Pf4-Cre+marks+hematopoietic+stem+cells+and+their+progeny%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Lineage tracing of Pf4-Cre marks hematopoietic stem cells and their progeny.</a> PLoS One. 7 (12), 51361(2012).</li>
<li>Stegner, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombopoiesis+is+spatially+regulated+by+the+bone+marrow+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Thrombopoiesis is spatially regulated by the bone marrow vasculature.</a> Nature Communications. 8 (1), 127(2017).</li>
<li>Drew, P. J., Blinder, P., Cauwenberghs, G., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+determination+of+particle+velocity+from+space-time+images+using+the+Radon+transform%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computational+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Rapid determination of particle velocity from space-time images using the Radon transform.</a> Journal of Computational Neuroscience. 29 (1-2), 5-11 (2010).</li>
<li>Nakagawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ketamine+suppresses+platelet+aggregation+possibly+by+suppressed+inositol+triphosphate+formation+and+subsequent+suppression+of+cytosolic+calcium+increase%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Ketamine suppresses platelet aggregation possibly by suppressed inositol triphosphate formation and subsequent suppression of cytosolic calcium increase.</a> Anesthesiology. 96 (5), 1147-1152 (2002).</li>
<li>Kim, S., Lin, L., Brown, G. A. J., Hosaka, K., Scott, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extended+time-lapse+in+vivo+imaging+of+tibia+bone+marrow+to+visualize+dynamic+hematopoietic+stem+cell+engraftment%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Extended time-lapse in vivo imaging of tibia bone marrow to visualize dynamic hematopoietic stem cell engraftment.</a> Leukemia. 31 (7), 1582-1592 (2017).</li>
<li>Kohler, A., Geiger, H., Gunzer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+hematopoietic+stem+cells+in+the+marrow+of+long+bones+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Imaging hematopoietic stem cells in the marrow of long bones in vivo.</a> Methods in Molecular Biology. 750, 215-224 (2011).</li>
<li>Lewandowski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cellular+imaging+pinpoints+the+role+of+reactive+oxygen+species+in+the+early+steps+of+adult+hematopoietic+reconstitution%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">In vivo cellular imaging pinpoints the role of reactive oxygen species in the early steps of adult hematopoietic reconstitution.</a> Blood. 115 (3), 443-452 (2010).</li>
<li>Reismann, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+intravital+imaging+of+the+femoral+bone+marrow+reveals+plasticity+within+marrow+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Longitudinal intravital imaging of the femoral bone marrow reveals plasticity within marrow vasculature.</a> Nature Communications. 8 (1), 2153(2017).</li>
<li>Chen, Y., Maeda, A., Bu, J., DaCosta, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femur+window+chamber+model+for+in+vivo+cell+tracking+in+the+murine+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Femur window chamber model for in vivo cell tracking in the murine bone marrow.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (113), e542205(2016).</li>
<li>Guesmi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-color+deep-tissue+three-photon+microscopy+with+a+multiband+infrared+laser%5BTitle%5D)+AND+%22Light+Science+%26+Applications%22%5BJournal%5D)">Dual-color deep-tissue three-photon microscopy with a multiband infrared laser.</a> Light Science & Applications. 7, 12(2018).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-photon+imaging+of+mouse+brain+structure+and+function+through+the+intact+skull%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Three-photon imaging of mouse brain structure and function through the intact skull.</a> Nature Methods. 15 (10), 789-792 (2018).</li>
<li>Kim, J., Bixel, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+multiphoton+imaging+of+the+bone+and+bone+marrow+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Intravital multiphoton imaging of the bone and bone marrow environment.</a> Cytometry A. 97 (5), 496-503 (2020).</li>
</ol>

著者は宣言する利害の対立を持っていません。

血小板形成のメカニズムは、骨髄環境に大きく依存しています。そのため、生体内顕微鏡は、リアルタイムでプロセスを可視化する分野で重要なツールとなっています。蛍光巨核球を有するマウスは、条件付き蛍光遺伝子発現カセットを含む任意のfloxedレポーターマウスと巨核球中のCreリコンビナーゼを発現するマウスを交流することによって得ることができる。ここで、mTmGレポーターマウス(B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo10)はPf4-creマウス11と交配し、巨核球および血小板11に強烈な緑色蛍光標識を可能にした。白血球のPf4-creマウスでは、単球/マクロファージおよび線維芽細胞12,13を含むいくつかの漏れが報告されている点に注意することが重要である。
しかし、巨核球は大きな...

血小板は、骨髄に位置する巨核球専門細胞によって産生される。巨核球が循環中の血小板を放出する正確な方法は、骨を通してリアルタイムの出来事を観察する際の技術的な課題のために長い間不明瞭なままであった。2光子顕微鏡はこの課題を克服し、血小板形成プロセスの理解において大きな進歩を遂げてきた。初の インビボ 巨核球観測は、2007年にフォン・アンドリアンらの研究グループによって行われ、頭蓋骨1を通して蛍光巨核球が可視化された。これは、若年成マウスの前頭蓋頭の骨層が数十ミクロンの厚さを有し、基礎となる骨髄2における蛍光細胞の可視化を可能にするのに十分に透明であるために可能であった。
続く研究では、様々な条件下でプロ血小板形成を評価し、基礎となるメカニズム3、4、5、6を解読するために、この手順を適用しました。これらの研究は、巨核球が、原形の血管の内皮的障壁を通って、プロ血小板と呼ばれる突起を動的に拡張するという決定的な証拠を提供した(図1)。これらのプロ血小板は、体積の数百の血小板を表す長い断片として放出される。血小板は、下流器官の微小循環におけるプロ血小板のリモデリング後、特に肺7に形成される。しかし、現在までに、正確なプロセスと分子メカニズムは議論の対象となっています。例えば、プロ血小板の伸びにおける細胞骨格タンパク質の提案された役割は、インビトロ条件とインビボ条件3の間で異なり、そして炎症条件下でプロ血小板形成の違いが実証されている6。さらに複雑なことに、最近の研究では、プロ血小板駆動の概念に異議を唱え、生体内では、巨核球レベル8の膜芽出機構を通して血小板が本質的に形成されることを提案した。
本論文は、生きているマウスの頭蓋骨から骨髄の巨核球およびプロ血小板を観察するためのプロトコルを、低侵襲的な手順を用いて提示する。同様のアプローチは、他の骨髄細胞、特に造血幹細胞および前駆細胞9を可視化するために先に説明されている。ここでの焦点は、測定できるいくつかのパラメータ、特にプロ血小板形態と血小板速度を詳述するために、巨核球および血小板の観察である。このプロトコルは、蛍光トレーサーと薬物を注入し、頭蓋骨を通して観察するために頸静脈にカテーテルを挿入する方法を提示します。小骨骨は、リングが骨に接着されるように、軽度の手術を使用して露出されます。このリングは、頭を固定化し、呼吸による動きを防ぎ、水中媒体として生理食音で満たされたカップを形成する役割を果たす。この技術はi)血管壁と相互作用するサイヌシド幾何学および巨核球をリアルタイムで観察するのに適している。ii) プロ血小板形成、伸び、および放出の過程で巨核球に従う;iii)血小板の動きを測定して、複雑なシヌサイド血流を監視する。このプロトコルを使用して取得したデータは最近公開されています3.

<table><tbody><tr><td>GNU Octaveソフトウェア</td><td>GNU Project</td><td></td><td>https://www.gnu.org/software/octave/</td></tr><tr><td>&nbsp;ヒストアクリル 5 x 0, 5 mL</td><td>ブラウン</td><td>1050052</td><td>外科用接着剤の注射液</td></tr><tr><td>HyD ハイブリッド検出器 ライカ マイクロシステムズ 4tunes</td><td>ライカ マイクロシステム</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>GNU プロジェクト</td><td></td><td>必要な最小バージョン</td></tr><tr><td>イマルジーン/ケタミン 1000 fl/10 mL</td><td>ベーリング</td><td>03661103003199</td><td>目の保護</td></tr><tr><td>具Leica SP8 MP DIVE 顕微鏡、25 倍水対物レンズ、開口数 0.95</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>AlexaFluor-488 と Qtracker-655 の同時励起</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>MathWorks</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>https://www.mathworks.com/ Ocrygel 10 g</td><td>Laboratoires T.V.M.</td><td>03700454505621</td><td>シリコン デンタルペースト 青と黄色</td></tr><tr><td>ピコデント ツインシン スピード</td><td>ロテック</td><td>13001002</td><td></td></tr><tr><td>Qtracker 655 血管ラベル</td><td>Invitrogen</td><td>Q21021MP</td><td>注射液</td></tr><tr><td>レゾナントスキャナー、8 kHz または 12 kHz</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ロンプン キシラジン 2% fl/25 mL</td><td>バイエル</td><td>04007221032311</td><td></td></tr><tr><td>瞬間接着剤</td><td></td><td></td> <td>ゲルリングを骨に接着する</td></tr><tr><td>Surflo IVカテーテル - Blue 22 G</td><td>Terumo</td><td>SR-OX2225C1</td><td></td></tr><tr><td>Ti:Saphパルスレーザー(コヒーレント)(フェムト秒)</td><td>コヒーレント</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

イン・ヴィヴォ マウスの頭蓋骨骨髄における巨核球とプロ血小板の2光子イメージング

In Vivo Two-photon Imaging of Megakaryocytes and Proplatelets in the Mouse Skull Bone Marrow

血小板は、骨髄に位置する特殊な細胞である巨核球によって産生される。メガカルヨサイトをリアルタイムで画像化する可能性とそのネイティブ環境は10年以上前に記述され、血小板形成のプロセスに新たな光を当てています。巨核球は、シヌソイド血管の内皮層を通して、プロ血滴と呼ばれる細長い突起を拡張する。本論文は、頭蓋骨骨髄およびサイヌシド血管において、蛍光標識された巨核球をリアルタイムで同時に画像化するプロトコルを提示する。この技術は、炎症反応を制限するために頭蓋骨をそのまま維持するマイナーな手術に依存しています。マウスの頭部は、呼吸の動きを防ぐために頭蓋骨に接着リングで固定化されています。
2光子顕微鏡を用いて、巨核球を最大数時間可視化することができ、細胞突起や原形の伸びの過程での細胞突起の観察が可能になります。これにより、突起の形態(幅、長さ、狭窄領域の存在)およびその伸び動作(速度、規則性、または一時停止または引き込みフェーズの存在)に関連するいくつかのパラメータを定量化することができます。この技術はまた、血小板速度および血流方向を決定するために、シヌソイド血管内の循環血小板の同時記録を可能にする。この方法は、遺伝子組み換えマウスを用いた血小板形成における関心遺伝子の役割を研究するのに特に有用であり、また、薬理学的検査(血小板産生障害の治療における薬剤の評価のメカニズムを研究する)にも適している。それは、インビボとインビトロプロ血小板形成が異なるメカニズムに依存することが知られているように、特にインビトロ研究を補完するために、非常に貴重なツールとなっています。例えば、体外微小管は、それらそれ以上の前小板伸長に必要とすることが示されている。しかし、生体内では足場として機能し、伸びは主に血流力によって促進される。

このプロトコルを用いて、蛍光トレーサーQtracker-655は、矢印によって示されるように、頭蓋骨骨髄および流れ方向における吻像骨髄正弦管を画像に静脈内投与した(図4A、左)。mTmGマウスを用いて、各容器枝に20s以上のeGFP蛍光小板を記録し、その速度をImageJおよびGNUオクターブソフトウェアを用いて測定した(図4A、右)。流速と方向の異質性に注意してください。Sinusoid血管は、 ビデオ1に記録された分岐に示すように、流れリフローおよびスタシスの存在を伴う、アナストモーゼによる複雑な流れを提示する。同じ分岐を 図 4B( 左)に示し、赤と青の矢印が反対の流れを強調しています。この分岐における血小板速度は、グラフで測定され、報告されている(図4B、右)。赤いトレースは、左の船枝の速度と、右の容器分岐の速度に対する青色のトレースに対応します。これは、加速...

ここでは、2光子顕微鏡を用いて生きているマウスの頭蓋骨の骨髄にメガカルヨサイトおよびプロ血小板をイメージングする方法について説明する。

Platelets are produced by megakaryocytes, specialized cells located in the bone marrow. The possibility to image megakaryocytes in real time and their ...

この方法は、巨核球などの頭蓋骨マウスの骨髄で起こり、脳内のプロ血小板を伸ばして、異なる事象のリアルタイムで可視化することを可能にする。この技術の主な利点は、炎症反応を最小限に抑えるために必要なマイナーな手術であり、ほぼ工場の状態でのイベントのインビボビジュアライゼーションを可能にする。開始するには、マウスを撮像室に搬送します。顕微鏡とコンピュータの電源を入れ、必要なパラメータを設定します。マウスが完全に麻酔をかけられたら、加熱されたプレートの上にマウスを置き、次のすべての操作のために摂氏37度に温め、マウスの頭と喉を剃り、乾燥を防ぐために目にゲルを塗ります。背中にマウスを置き、喉を伸ばすために外科用テープで前脚を固定します。喉を消毒した後、はさみを使用して右または左の頸静脈の上に0.7〜1センチメートルの切開を行い、隣接する結合組織を伸ばして胸筋の上に外部ジャグラー静脈を露出させます。カテーテルに温かい、無菌の生理食塩水を充填します。胸筋を通してカテーテルを貫通し、その後、静脈にカテーテルを挿入します。針を静かに取り出し、注射器を蛍光トレーサと接続し、カテーテルのデッドボリュームを注入します。カテーテルを安定させるために外科用接着剤を一滴入れる。マウスを慎重に、起こりやすい位置に戻します。ゆるい髪を取り除きながら、70%エタノールで頭皮をペーパータオルで消毒します。無菌の細かいはさみとピンセットを使用して、頭皮の耳の間に1センチメートルまでの正中線でT字型の切開を行い、カルバリウムを露出させる。頭蓋骨をピンセットで露出させ、ハサミとピンセットを使用してペリオスを慎重に取り除きます。滅菌綿棒を浸し、生理食塩水を使用して、すべての骨膜および画像を変更する可能性のある破片や髪を取り除きます。頭蓋骨を生理食い物ですすいで血液の痕跡を取り除き、綿棒で骨を急速に乾燥させます。リングに接着剤ジェルを塗布し、リングを露出した骨の上に置き、数秒間維持してリングが頭蓋骨にしっかりと取り付けられるようにします。スカルを軽く湿らせ、生理布切りの綿棒で湿ら。青色と黄色の成分を1対1の比率で慎重に混合して、シリコンデンタルペーストを準備します。画像撮影時の漏れを防ぐために、歯科用ペーストを塗布してリングを密封します。リングに入った歯科用ペーストや接着剤は慎重に取り外してください。その後、漏れを確認するために生理音でリングを埋めます。サポートの上にマウスを置き、動物の頭の下に折りたたまれた圧縮を置いて頭を上げ、ホルダーに取り付けたときに頭蓋骨からリングが切り離されるのを防ぎます。ブロックホルダーのリングをねじ込みます。サポートとマウスアセンブリを加熱された顕微鏡室に置きます。選択した4つの四つ、および放出された光の回復のための適切なレーザーの波長を設定します。インタージャガーカテーテルを使用して、脈管構造を標識するために、蛍光トレーサーの0.2マイクロモル溶液の50マイクロリットルを注入する。顕微鏡の目的の下に支持およびマウスと顕微鏡の段階を置く。リングが常に生理音で満たされていることを確認し、必要に応じて補充し、目的と生理を浸します。蛍光を使用して骨髄血管を見つけ、正弦波血管に沿って整列した巨核球を観察します。長い取得のために、8キロのヘルツ共鳴スキャナと双方向モードを使用して384 x 384ピクセルの画像で3D時空の取得を設定します。良好な解像度でライン平均を使用し、最適化されたZステップサイズを選択し、取得を開始する前に必要な時間間隔を設定します。短時間で迅速に取得するには、空間、時間取得タイプを選択し、画像サイズを最小化します。必要に応じて、撮像場を回転させることで、画像を容器に合わせて調整します。使用可能な最高のスキャン速度と双方向スキャンを使用します。ライン平均を最小化して、画像定義と取得の迅速性の間の最適な妥協点を見つけます。Z プランを 1 つだけ取得し、取得の時間間隔を最小限に抑えます。血小板速度を測定するためには、取得の10〜20秒で十分であるべきである。蛍光トレーサーを静脈内投与し、矢印で描かれた流れ方向を有する頭蓋骨骨髄内の吻合骨髄中位症血管を画像化した。蛍光血小板速度を各容器枝に記録し、その変動を観察した。このシヌサイド血管は、流量のリフローやスタシスの存在を伴う、アナストモーゼによる複雑な流れを示す。矢印は分岐での流れの反対方向を示した。血小板速度はまた、加速、スタシスおよび減速の段階を有する各容器分岐における時間の経過とともに不規則性を示した左および右の容器の枝についても測定した。不規則なマージンを有するプロ血小板を含むプロ血小板の異なる形態が観察され、その後、長いプロ血小板および厚くて短いプロ血小板を含む。巨核球が複雑な流れの領域でプロ血小板を伸ばしたとき、プロ血小板は流れ方向に応じて一方の容器から他方の容器に球化した。血流を止めると、プロ血小板がリラックスし、マウスが予期せず心停止を起こし、プロ血小板伸びにおける流体力の重要性が示された。プロ血小板の幅と長さも5.2マイクロメートルの平均幅を測定し、約185マイクロメートルの平均最大長を観測した。時間の関数としてプロメトレットの長さをプロットすると、伸び、スタシス、あるいは引き込みの段階でプロメクレットの挙動を視覚化することができます。1分間に約10マイクロメートルの平均伸び速度が観測された。カテーテルの設置は、プロ血小板形成または関心のある他の事象に対する効果をリアルタイムで研究する薬物の注射を可能にした。

in-vivo-two-photon-imaging-megakaryocytes-proplatelets-mouse-skull

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このビデオでは、露出した頭蓋骨に頭蓋リングアセンブリを埋め込み、さらにマウスの頭部を固定して長時間高解像度の脳イメージングを行う外科的処置について説明します。...

マウスモデルにおける頭蓋リングアセンブリの取り付け:高解像度頭蓋骨骨髄イメージングのためのマウス頭蓋骨に視覚化ウィンドウアセンブリを移植する外科的処置

生きている動物のTime-lapse imaging...

二光子<em&gt; in vivoで</em&gt;間引き頭蓋骨の準備を使用して、マウス皮質における樹状突起棘のイメージング

造血幹細胞および前駆細胞のマーキングコンビナトリアル5蛍光タンパク質は、再生中に、骨髄の造血アーキテクチャへの洞察を提供し、共焦点および2光子顕微鏡を経由して、生体内のクローン追跡になります。この方法は、移植後の時間の大規模な期間、無傷の組織におけるスペクトル的にコード化されたHSPCs由来細胞の非侵襲的な運命のマッピングが可能になります。...

共焦点および多光子顕微鏡を用いて5蛍光タンパク質によってマーク造血幹細胞および前駆細胞の生体内でクローン追跡で

造血幹細胞および前駆細胞（HSPCs）および骨髄ニッチの間の相互作用の性質は、ほとんど理解されている。カスタムハードウェアの修正および多段階取得プロトコルは、ex vivo画像骨髄エリア内ホーミング標識HSPCs、追跡相互作用及び運動に二光子共焦点顕微鏡の使用を可能にする。...

成体マウス頭蓋冠骨髄中の造血幹細胞および前駆細胞のin vivo 4次元トラッキングで

単球は自然免疫の主要な調節因子であり、末梢の単核食作用系の更新や炎症の場合に重要な役割を果たします。この原稿では、単球の動員メカニズムを研究するためのマウスのカルバリア骨髄のリアルタイムイメージングの手順について説明します。...

マウス骨髄単球の追跡<em&gt;インビボ</em

私たちは、麻酔をかけたマウスの生体内共焦点顕微鏡を使用して、定常状態および炎症条件下で腸間膜静脈の好中球と単球の挙動を監視するためのプロトコルを詳述しています。...

リアルタイムで麻酔したマウスに生体顕微鏡により腸間膜静脈に好中球および単球のイメージング

このプロトコルは、生体内で大腿骨骨髄内の細胞の動きを追跡するために使用できる新しいマウス大腿骨窓室モデルについて説明しています。生体内多光子蛍光顕微鏡は、大腿骨骨髄の3つの成分(血管系、コラーゲンマトリックス、好中球)を経時的にイメージングするために使用されます。...

以下のための大腿骨のウィンドウチャンバーモデル<em&gt;インビボ</emマウス骨髄内&gt;細胞トラッキング

ホーミングや骨髄 (BM) のニッチに造血細胞の生着を研究する遺伝的動物モデルとの組み合わせで、calvarium の生体内蛍光顕微鏡 (IVFM)...

骨髄ニッチに造血細胞の生着のダイナミクスを研究する遺伝的モデルと生体内蛍光顕微鏡 (IVFM) を組み合わせること

ここでは、透過型電子顕微鏡(TEM)を用いて、その 場で 巨核球の超構造を解析するプロトコルを紹介する。マウス骨マロウは、収集され、固定され、エポキシ樹脂に埋め込まれ、超薄切片で切断される。コントラスト染色後、骨髄は120kVのTEM顕微鏡下で観察される。...

イン・シトゥ 透過電子顕微鏡を用いたネズミ巨核生物の探索

ここでは、骨髄外植法について詳述し、サンプル調製から顕微鏡スライド解析まで、それらの生理環境において分化した巨核球がプロ血小板を形成する能力を評価する。...

マウスの新鮮な骨髄のプロ血小板形成ダイナミクス

生体内顕微鏡検査は、組織再生や腫瘍発生などのダイナミックな生物学的プロセスの研究を可能にします。非常に動的な組織である頭蓋骨髄は、造血と血管機能に関する洞察を提供します。生体適合性のある3Dプリントされた頭部固定インプラントを使用すると、反復的な縦方向のイメージングが可能になり、組織ダイナミクスと腫瘍微小環境の理解が深まります。...

Calvarial Bone Marrowにおける血管動態の生体内縦断的イメージング

学ぶマウス頭蓋骨骨髄における巨核球とプロ血小板の2光子イメージング法。蛍光標識とマイナー外科手術を用いて、血小板産生の動態をリアルタイムで可視化・定量化する技術です。

イン・ヴィヴォマウスの頭蓋骨骨髄における巨核球とプロ血小板の2光子イメージング

さらに動画を探す

イン・ヴィヴォ マウスの頭蓋骨骨髄における巨核球とプロ血小板の2光子イメージング

さらに動画を探す

イン・ヴィヴォマウスの頭蓋骨骨髄における巨核球とプロ血小板の2光子イメージング