Name: 標的下およびタグ付け下での切断を用いた植物におけるH3K4me3修飾のプロファイリング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: 学ぶ 植物におけるCUT&Tag法を用いたH3K4me3修飾のエピゲノムプロファイリング手法。綿葉を材料にした核分離、抗体認識、Tn5トランスポザーゼによるin situ切断の詳細なプロトコルを解説し、遺伝子発現制御の分子メカニズム研究への応用を示します。

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この研究は、中国国家自然科学財団(NSFC、31900395、31971985、31901430)、中央大学基礎研究費、海南逝州湾種子研究所(JBGS、B21HJ0403)、中国海南省自然科学財団(320LH002)、JCIC-MCPプロジェクトからの助成金によって部分的に財政的に支援されました。

1. トランスポザーゼとストック溶液の準備(1日目)
注:この部分では、オリゴヌクレオチドアダプターはTn5トランスポザーゼと複合体形成され、活性トランスポザーゼを作る。
<ol><li>アニーリングバッファー(10 mM Tris pH 8.0、50 mM NaCl、1 mM EDTA)を用いてプライマー(プライマーA、プライマーB、およびプライマーC)を100 μM濃度に希釈する(プライマーの配列情報については 表1 を参照し、作業液のレシピについては 表2 を参照)。使用時まで-20°Cで保存してください。</li>
	<li>反応1(アダプターAB)、100 μMプライマーAの10 μL、100 μMプライマーBの10 μL。反応2(アダプターAC)は、10 μLの100 μMプライマーA、10 μLの100 μMプライマーC。</li>
	<li>ヒートフタ(102°C)、75°Cで15分間、60°Cで10分間、50°Cで10分間、40°Cで10分間、25°Cで30分間、PCRマシンでアダプターをアニーリングします。 注: アダプターは部分的に二本鎖の DNA 分子です (濃度 = 50 pmol/μL)。</li>
	<li>10 μL の pA-Tn5 トランスポザーゼ (500 ng/μL または 7.5 pmol/μL)、0.75 μL のアダプター AB (50 pmol/μL)、0.75 μL のアダプター AC (50 pmol/μL)、7 μL のカップリングバッファー。ピペット20xを穏やかによく混ぜ合わせ、ウォーターバス中で30°Cで1時間インキュベートした。トランスポザーゼの最終濃度=4pmol/μL.使用時まで-20°Cで保存してください。 注:アダプターAB:アダプターAC:トランスポザーゼ=0.5:0.5:1のモル比。</li>
	<li>表2に規定されたレシピに従ってストック溶液を準備し、オートクレーブまたは濾過してストック溶液を滅菌する。</li>
	<li>オートクレーブや殺菌はさみ、ろ紙、ステンレス製のふるい、乳鉢、乳棒など</li>
</ol>2. 原子核隔離(2日目)
<ol><li>遠心分離機を4°Cに予冷する。 出発物質(綿葉)の各1gについて、25mLの核隔離緩衝液A(10mM Tris pH 8.0、50mM NaCl、1mM EDTA)、20mLの核隔離緩衝液B(10mM Tris pH 8.0、50mM NaCl、1mM EDTA)、50mLの核洗浄緩衝液(10mM Tris pH 8.0)を調製し、 150 mM NaCl、0.5 mM スペルミジン、プロテアーゼ阻害剤カクテル 0.1%)、1 mL の抗体バッファー (50 mM Tris pH 8.0、1 mM EDTA、150 mM NaCl、0.5 mM スペルミジン、1 mg/mL BSA、プロテアーゼ阻害剤カクテル 0.1%、0.05% w/v ジギトニン)。使用時までチューブを氷の上に座らせてください。</li>
	<li>液体窒素中の新鮮な葉(〜1g)を微粉末に粉砕し、25mLの冷却核分離緩衝液Aを含む50mLチューブに移す。</li>
	<li>緩衝液を穏やかに混合し、チューブを氷上で5分間穏やかに振とうして材料を均等に分散させる。</li>
	<li>4°Cで500 rcfで5分間遠心分離し、細胞ペレットを形成した。</li>
	<li>上清をデカントし、0.5%Triton X-100を添加した20 mLの冷却核隔離バッファーBでペレットを再懸濁した。チューブを静かに反転させて、ペレットを完全に再懸濁させます。 注: 20 mL 核分離バッファー B は 1 g の出発物質に適用可能であり、この容量はそれに応じてスケーリングできます。<ol>
<li>パイロットアッセイを実行して、Triton X-100の系列濃度の効果を試験する(例えば、2mLの核単離緩衝液B、100mgの粉砕組織に対してそれぞれ0.1%、0.25%、0.5%、および1%のTriton X-100を含む)。Triton X-100の適切な濃度は、底部に白/灰色の核が蓄積し、溶解および低速で遠心分離した後の濃い緑色の上清(500 rcfを4分間<)によって示される。</li>
	</ol>
</li>
	<li>得られた細胞溶解物を2つのふるいの組み合わせで濾過する:上部に500メッシュの篩で大きな組織破片を除去し、下部に1000メッシュの篩で核を回収する。 注: 植物の核サイズに応じて、ふるいに適切なメッシュサイズを選択します。</li>
	<li>ふるいの裏側に滅菌ろ紙を使用して、溶解液中の小細胞破片を吸収します。</li>
	<li>1000メッシュのふるいの頂部側に残った核含有溶解物を4本の新鮮な1.5mL遠沈管に移す。</li>
	<li>遠心分離機を4°Cで300rcfで4分間遠心分離し、核を回収した。</li>
	<li>ピペットチップを使用してできるだけ多くの上清を除去し、核洗浄バッファーでペレットを洗浄する。</li>
	<li>800 μLの核洗浄バッファーを加え、チューブを静かに反転させてペレットを再懸濁します。チューブを再び 4 °C で 300 rcf で 4 分間回転させます。</li>
	<li>合計3回の洗浄を行います。</li>
	<li>(オプション)DAPI染色のために顕微鏡下で核を画像化する。<ol>
<li>ステップ2.11から核洗浄バッファーに100 μLの核懸濁液を移す。新しい1.5 mLチューブに。900 μL の核洗浄バッファーと 2 μL の DAPI ストック溶液 (1 mg/mL) を加えて、DAPI の最終作業濃度を 2 μg/mL にします。チューブを暗所で室温で30分間インキュベートする。</li>
		<li>染色後、4°Cで300rcfで4分間遠心分離し、核を回収した。</li>
		<li>ピペットチップを使用してできるだけ多くの上清を除去します。800 μLの核洗浄バッファーで3回洗浄します。</li>
		<li>できるだけ多くの上清を除去し、100 μLの核洗浄バッファーで核を再懸濁する。</li>
		<li>DAPIチャネルを用いた蛍光顕微鏡下で核を画像化する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>2本のチューブからの核を結合する(各1.5mLチューブに約50μLの体積の核)。4°Cで300 rcfで4分間遠心分離する。 ピペットチップを使用して、残りのバッファーをできるだけ多く取り除きます。</li>
</ol>3. 抗体インキュベーション
<ol><li>各50 μLの核を1.5 mLチューブに1 mLの抗体緩衝液で再懸濁する。</li>
	<li>1.5 mL チューブで以下の反応をセットアップしました: 各チューブに 150 μL の核 (~ 1 μg のクロマチン) と 2 μL の IgG (1 mg/mL) を含む IgG 対照群の 2 つの生物学的複製、各チューブに 150 μL の核と 2 μL の抗 H3K4me3 抗体 (1 mg/mL) を含む H3K4me3 アッセイ群の 2 つの生物学的複製。</li>
	<li>溶液を穏やかに混合し、チューブを水平シェーカー上に放置し、4°Cおよび12rpmで一晩ハイブリダイゼーションを行う。</li>
	<li>遠心分離機を4°Cに予冷する。 50 mL 遠沈管で、新鮮な 50 mL の免疫沈降 (IP) 洗浄バッファー (10 mM Tris pH 8.0、150 mM NaCl、0.5 mM スペルミジン、プロテアーゼ阻害剤カクテル 0.1%、0.05% w/v ジギトニン) を準備します。チューブを氷の上に座らせます。</li>
	<li>チューブを4°Cで300 rcfで4分間遠心分離します。 各チューブから抗体緩衝液を除去する。</li>
	<li>各チューブに800 μLのIP洗浄バッファーを加え、穏やかに混合します。チューブを水平シェーカーに室温および12rpmで5分間放置する。</li>
	<li>洗浄後、チューブを4°Cで300rcfで4分間遠心分離する。 ピペットチップを用いて上清を除去する。 注:核ペレットの乱れを避けるために、核を含む緩衝液を約50〜80μL残してください。</li>
	<li>手順 3.6.-3.7 を繰り返します。あと2回。</li>
	<li>3回目の洗浄後、4°Cで300rcfで2分間遠心分離する。 残りのバッファーをできるだけ削除します。</li>
</ol>4. トランスポザーゼインキュベーション
<ol><li>1 mL の IP 洗浄バッファーと 30 μL の 5 M NaCl を混合して、新鮮な 1 mL のトランスポザーゼインキュベーションバッファー (10 mM Tris pH 8.0、300 mM NaCl、0.5 mM スペルミジン、プロテアーゼ阻害剤カクテル 0.1%、0.05% w/v ジギトニン) を作ります。</li>
	<li>インキュベーション用の Tn5 トランスポザーゼミックスを調製するには、各 150 μL のトランスポザーゼインキュベーションバッファーに 1 μL のトランスポザーゼを追加します。 注:まず反応数に応じてトランスポザーゼ溶液ミックスを調製し、次に各チューブに150μLのアリコートを加える。</li>
	<li>核を150μLのトランスポザーゼ溶液で再懸濁する。</li>
	<li>チューブを水平シェーカーに12rpmで室温で2〜3時間放置し、10〜15分ごとに混合する。</li>
	<li>トランスポザーゼインキュベーション後、チューブを4°Cで300 rcfで4分間遠心分離します。 各チューブ内のトランスポザーゼインキュベーションバッファーを除去する。</li>
	<li>チューブをIP洗浄バッファーで洗浄します。これを行うには、各チューブに800μLのIP洗浄バッファーを加え、穏やかに混合し、チューブを水平シェーカーに12rpmで室温で5分間放置します。</li>
	<li>4°Cで300 rcfで4分間遠心分離する。 ピペットチップを用いて上清を除去する。</li>
	<li>手順 4.6.-4.7 を繰り返します。あと2回。</li>
	<li>3回目の洗浄後、4°Cで300rcfで2分間遠心分離する。 残りのバッファーをできるだけ削除します。</li>
</ol>5. タグ付け
<ol><li>2 mL の IP 洗浄バッファーを 60 μL の 5 M NaCl および 20 μL の 1 M MgCl2 と混合して、2 mL のタグメント化バッファー (10 mM Tris pH 8.0、300 mM NaCl、0.5 mM スペルミジン、プロテアーゼ阻害剤カクテル 0.1%、10 mM MgCl2、10 mM MgCl2、0.05% w/v ジジトニン) を新たに作ります。</li>
	<li>核を300 μLのタグメント化バッファーで再懸濁する。</li>
	<li>溶液を混合し、タグ付けのために37°Cの水浴中で1時間インキュベートする。</li>
	<li>10 μL の 0.5 M EDTA (最終濃度〜15 mM) および 30 μL の 10% SDS (最終濃度 1%)でタグ付けを停止します。</li>
</ol>6. DNA抽出とNGSライブラリー構築
<ol><li>300 μLのCTAB DNA抽出バッファーを記載どおりに加えます7。チューブを65°Cの水浴中で30分間インキュベートする。反転して約10分ごとに混合します。</li>
	<li>600 μLのフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(25:24:1)を各チューブに加える。徹底的に混ぜる。</li>
	<li>フェーズロックゲルチューブを4°Cで13,000 rcfで2分間予備遠心分離する。 上記の溶液をフェーズロックゲルチューブに移す。</li>
	<li>4°Cで13,000 rcfで10分間遠心分離する。</li>
	<li>上清(約600 μL)を新しい1.5 mLチューブに移す。</li>
	<li>各チューブに600 μLのクロロホルムを加える。徹底的に混ぜる。</li>
	<li>4°Cで13,000 rcfで10分間遠心分離する。</li>
	<li>上清(約600 μL)を新しい1.5 mlチューブに移す。</li>
	<li>12 μL の 100% エタノールと 2 μL の GlycoBlue Coprecipitant を加える。十分に混合し、-20°Cで1時間保存する。</li>
	<li>4°Cで13,000 rcfで10分間遠心分離する。</li>
	<li>上清をデカントする。DNAペレットを75%(v/v)エタノールを用いて洗浄し、4°Cで13,000 rcfで5分間遠心分離する。</li>
	<li>上清をデカントする。DNAペレットを風乾し、25 μLのddH2OでDNAを再懸濁する。</li>
	<li>PCR反応を以下のようにセットアップする。合計 50 μL の反応に、24 μL の DNA、11 μL の ddH2O、10 μL の 5x TAE バッファー、2 μL の P5 プライマー (10 μM)、2 μL の P7 プライマー (10 μM)、および 1 μL の TruePrep Amplify Enzyme を加えます。PCRプログラム: 72 °C 3 分間, 98 °C 30 秒間;その後、98°Cで30秒、60°Cで30秒、72°Cで30秒を14サイクル、続いて72°Cで5分間。 メモ:延長のための最初の72°Cの3分間はスキップ できません 。ライブラリーの過剰増幅は、NGSにおける高レベルのPCR複製をもたらすであろう。各反応で約1 μgのクロマチンを使用する場合、H3K4me3 の PCR 反応で 12 ~ 14 回の PCR サイクルを開始します。</li>
	<li>2 μL の PCR 産物を 1.5% アガロースゲルにロードして電気泳動します。</li>
	<li>市販のDNA精製磁気ビーズを用いてPCR産物を精製する。</li>
	<li>ライブラリーを蛍光光度計およびアガロースゲル電気泳動で定量する。 注: ライブラリーの有効濃度は、良質を確保するために qPCR で >2 nM にする必要があります。</li>
	<li>次世代シーケンシング(NGS)とデータ解析を実行します。</li>
</ol>

<ol><li>Abascal, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+on+ENCODE%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Perspectives on ENCODE.</a> Nature. 583 (7818), 693-698 (2020).</li>
<li>Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq%3A+advantages+and+challenges+of+a+maturing+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (10), 669-680 (2009).</li>
<li>Kaya-Okur, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CUT%26Tag+for+efficient+epigenomic+profiling+of+small+samples+and+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 1930(2019).</li>
<li>Tao, X., Feng, S., Zhao, T., Guan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+chromatin+profiling+of+H3K4me3+modification+in+cotton+using+CUT%26Tag%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Efficient chromatin profiling of H3K4me3 modification in cotton using CUT&Tag.</a> Plant Methods. 16, 120(2020).</li>
<li>Kaya-Okur, H. S., Janssens, D. H., Henikoff, J. G., Ahmad, K., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+low-cost+chromatin+profiling+with+CUT%26Tag%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Efficient low-cost chromatin profiling with CUT&Tag.</a> Nature Protocols. 15 (10), 3264-3283 (2020).</li>
<li>Bartosovic, M., Kabbe, M., Castelo-Branco, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+CUT%26Tag+profiles+histone+modifications+and+transcription+factors+in+complex+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Single-cell CUT&Tag profiles histone modifications and transcription factors in complex tissues.</a> Nature Biotechnology. , (2021).</li>
<li>Paterson, A. H., Brubaker, C. L., Wendel, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+for+extraction+of+cotton+%28Gossypium+spp.%29+genomic+DNA+suitable+for+RFLP+or+PCR+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology+Reporter%22%5BJournal%5D)">A rapid method for extraction of cotton (Gossypium spp.) genomic DNA suitable for RFLP or PCR analysis.</a> Plant Molecular Biology Reporter. 11 (2), 122-127 (1993).</li>
<li>Haring, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation%3A+optimization%2C+quantitative+analysis+and+data+normalization%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization.</a> Plant Methods. 3 (1), 11(2007).</li>
<li>Ouyang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+low-input+profiling+of+histone+marks+in+plants+using+nucleus+CUT%26Tag%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Rapid and low-input profiling of histone marks in plants using nucleus CUT&Tag.</a> Frontiers in Plant Science. 12, 634679(2021).</li>
<li>Swift, J., Coruzzi, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+matter+of+time+-+How+transient+transcription+factor+interactions+create+dynamic+gene+regulatory+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Gene+Regulatory+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">A matter of time - How transient transcription factor interactions create dynamic gene regulatory networks.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Regulatory Mechanisms. 1860 (1), 75-83 (2017).</li>
<li>Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATAC-seq%3A+a+method+for+assaying+chromatin+accessibility+genome-wide%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">ATAC-seq: a method for assaying chromatin accessibility genome-wide.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 109, 21-29 (2015).</li>
</ol>

すべての著者は、上記の製品のいずれかを取引する会社と利益相反することはありません。

ここでは、クロマチン免疫沈降法(ChIP)と比較して、少数の細胞を用いて、非常に低いバックグラウンドでDNAライブラリーを高分解能かつ極めて低いバックグラウンドで生成する技術であるCUT&Tagについて説明しました。綿の葉のH3K4me3プロファイリングでの成功は、最初に動物細胞用に設計されたCUT&Tagが植物細胞にも使用できることを示唆しています。ChIPアッセイ8に一般的に使用されるトリスバッファーシステムと、動物のCUT&Tagに使用されるHEPESバッファーシステムは、植物核4,9を使用してCUT&Tagに機能します。無傷の植物核の単離は、植物へのCUT&Tagの適用を成功させるための重要なステップです。以前に報告された核単離の方法論4では、粉砕された組織の溶液を、細胞溶解前に2層のMiraclothで濾過した。我々は、ミラクロスが粉砕された組織の大部分を保持するため、比較的老化した葉(例えば、生後2ヶ月の綿花植物の...

ヒストン修飾マークに関連する転写因子結合DNA部位およびオープンクロマチンは、遺伝子発現の調節において重要な機能的役割を果たし、エピジェネティック研究の主要な焦点である1。従来、ディープシーケンシング(ChIP-seq)と組み合わせたクロマチン免疫沈降アッセイ(ChIP)は、特定のタンパク質を有する特定のクロマチンヒストン修飾またはDNA標的のゲノムワイドな同定に用いられており、エピジェネティクスの分野で広く採用されています2。標的下での切断とタグ付け(CUT&Tag)技術は、もともとゲノム全体でタンパク質関連DNA断片を捕捉するためにHenikoff Labによって開発されました5。ChIPと比較すると、CUT&Tagcanは、簡略化された手順で少数の細胞を使用して、高解像度で非常に低いバックグラウンドでDNAライブラリを生成します3。今日まで、CUT&Tagを用いて特定のヒストン修飾を有するクロマチン領域を分析する方法が動物細胞において確立されている4,5。具体的には、単一細胞CUT&Tag(scCUT&Tag)もヒトの組織や細胞向けに開発に成功しています6。しかし、細胞壁と二次代謝産物の複雑さのために、CUT&Tagは植物組織にとって依然として技術的に困難です。
以前、我々は同種四倍体綿葉から単離された無傷の核を用いたCUT&Tagプロトコルを報告した4。植物組織を用いた核単離およびDNA捕捉の効率を実証するために、プロファイリング手順をここに提示する。主なステップには、インタクトな核単離、クロマチン修飾のための抗体との in situ インキュベーション、トランスポザーゼインキュベーション、アダプター統合、およびDNAライブラリー調製が含まれる。トラブルシューティングでは、植物核の分離と品質管理のためのCUT&Tagライブラリの準備に焦点を当てています。 
この研究では、植物に対する洗練されたCUT&Tag戦略を提示します。綿葉のH3K4me3プロファイリングのためのステップバイステップのプロトコルを提供するだけでなく、適切な細胞溶解のための洗剤の濃度を選択するための戦略や核をろ過する戦略など、植物核単離のための最適化された方法論も提供します。批判的なコメントを含む詳細な手順も、この更新されたプロトコルに含まれています。

<table><tbody><tr><td>抗体</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-H3K4me3</td>ミリ<td>ポア</td><td>07-473</td><td></td></tr><tr><td>正常なウサギIgG</td><td>ミリポア</td><td>12-370</td><td></td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン(BSA)</td><td></td><td></td><td>10 mg / mlBSAストック溶液を作ります。-20°Cで保管します。C</td></tr><tr><td>ジギトニン (~50% (TLC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D141</td><td>5% ジギトニン原液 (200 mg ジギトニン [~50% 純度] から 2 mL DMSO) を調製します。注:0.22ミクロンフィルターを使用して滅菌します。-20°Cで保管します。C</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド(DMSO)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸(EDTA)</td><td></td><td></td><td>0.5 M EDTA(pH = 8.5)の原液を作ります。注:100 mL の 0.5-M EDTA(pH = 8.5)を調製するには、pH</td></tr><tr><td>エタノール</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GlycoBlue 共沈剤 (15 mg/mL)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム (MgCl2)</td><td></td><td></td><td>Make 1 M MgCl2 Stock Solution</td></tr><tr><td>Protacease Inhibitor カクテル</td><td>Calbiochem を調整するために、約 2 g の水酸化ナトリウム (NaOH) ペレットが必要です</td><td>539133-1SET</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム(KCl)</td><td></td><td></td><td>1 M KCl原液フェ</td></tr><tr><td>ノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(25:24:1、v:v:v)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム(NaCl)</td><td></td><td></td><td>5 M NaCl原液スペル</td></tr><tr><td>ミジン</td><td></td><td></td>を作ります2 <td>Mスペルミジン原液を作り、-20°Cで保管します。</td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)</td><td></td><td></td><td>10%SDSストック溶液を作ります。注:オートクレーブはしないでください。0.22ミクロンフィルターを使用して滅菌します</td></tr><tr><td>トリスベース</td><td></td><td></td><td>1 M トリス (pH = 8.0) ストック溶液を作</td></tr>製 <tr><td>Triton X-100</td><td></td><td></td><td>20% Triton X-100 ストック溶液</td></tr><tr><td>Enzyme</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hyperactive pG-Tn5/pA-Tn5 transposase for CUT&タグ</td><td>Vazyme</td><td>S602/S603</td><td>Tn5と融合したプロテインAまたはプロテインGの抗体親和性を確認します。一般的に、タンパク質AとGは幅広い抗体親和性を持っています。しかし、プロテインAはウサギ抗体に対して比較的高い親和性を持ち、プロテインGはマウス抗体に対して比較的高い親和性を持っています。抗体に一致する適切なトランスポゼース製品を選択してください。</td></tr><tr><td>TruePrep Amplify Enzyme</td><td>Vazyme</td><td>TD601</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>PCR machine</td><td>Applied Biosystems</td><td>ABI9700</td><td></td></tr><tr><td>Orbital shaker</td><td>MIULAB</td><td>HS-25</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop One&nbsp; 分光光度計</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-ワンW</td><td></td></tr></tbody></table>

標的下およびタグ付け下での切断を用いた植物におけるh3k4me3修飾のプロファイリング

Profiling of H3K4me3 Modification in Plants using Cleavage under Targets and Tagmentation

DNAおよびヒストン修飾、転写因子の挙動、およびそれらのリクルートされたタンパク質を有する非コードRNAを含む、有彩色レベルでのエピゲノム調節は、遺伝子発現の時間的および空間的制御をもたらす。標的下での切断およびタグ付け(CUT&Tag)は、特定のクロマチンタンパク質を最初にその特異的抗体によって認識し、次に抗体がプロテインA-トランスポザーゼ(pA-Tn5)融合タンパク質をテテルする酵素テザリング法であり、マグネシウムイオンの活性化によって標的クロマチンを その場で 切断する。ここでは、以前に公開されたCUT&Tagプロトコルを、改変したアロール四倍体コットン葉から単離された無傷の核を用いて提供する。このステップバイステップのプロトコルは、植物におけるエピゲノム研究に使用することができます。さらに、植物核単離のための実質的な改変は、批判的なコメントと共に提供される。

図 1 は、CUT&amp;Tag ワークフローを示しています。 図2は 、無傷の核のDAPI染色を示す。「核単離」工程の目的は、その後のCUT&amp;Tag反応に十分な量で無傷の核を得ることであった。 図3は 、PCR産物のアガロースゲル電気泳動を示す。IgGネガティブコントロールは、実験を設定する際に並行して必要です。IgG対照群と比較して、H3K4me3抗体サンプルで引き出されたDNA断片の大部分は、〜280〜500塩基対の範囲であった。 図4 は、IgG陰性対照群と比較した抗H3K4me3抗体について得られた次世代シークエンシングを示す。
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標的下での切断とタグ付け(CUT&Tag)は、効率的なクロマチンエピゲノムプロファイリング戦略です。このプロトコルは、植物におけるヒストン修飾のプロファイリングのための洗練されたCUT&Tag戦略を提示する。

標的下およびタグ付け下での切断を用いた植物におけるH3K4me3修飾のプロファイリング

Epigenomic regulation at the chromatic level, including DNA and histone modifications, behaviors of transcription factors, and non-coding RNAs with their ...

実験の全体的な目標は、クロマチンの状態を反映したゲノム全体のタンパク質関連DNA断片を同定することでした。この目標を達成するために、3つの特別な操作が行われました。まず、植物細胞から無傷の核を単離した。第二に、クロマチンへの修飾は、その場で特定の抗体によって認識された。第三に、プロテインA-トランスポザーゼ融合タンパク質であるTn5トランスポザーゼを連結する抗体は、マグネシウムイオンの活性化下でその場でクロマチンを切断する。次いで、DNA断片およびクロマチン修飾結合部位をアダプターと統合し、DNA調製の準備を整えた。ポリメラーゼ連鎖反応濃縮増強生成シーケンシング。DNAおよびヒストン修飾、転写因子の挙動、およびそれらのリクルートされたタンパク質を有する非コードRNAを含む、色レベルでのエピゲノミクス調節は、遺伝子発現の時間的および空間的制御をもたらす。Henikoff Labが開発したCUT&Tag技術は、クロマチンエピゲノミクスプロファイリングを高効率で行うための酵素テザリング法です。ここでは、実験材料として綿葉を採用し、一例としてヒストンH3リジン-4トリメチル化の抗体を用いてクロマチンプロファイリングを行った。私たちは、プラントでのCUT&Tagパフォーマンスのためのビデオで洗練されたプロトコルを提供しています。CUT&Tagを用いた各サンプル調製について、綿葉組織グラムを採取した。葉を液体窒素で微粉末に粉砕し、25mLの冷却核隔離緩衝液A.The緩衝液を入れた50mLファルコンチューブに移し、緩衝液を穏やかに混合し、チューブを氷上で5分間穏やかに振とうして材料を均一に分散させた。次いで、500相対遠心力またはrcfで、摂氏4度で、5分間スピンし、細胞ペレットを形成した。上清をデカントし、ペレットを20mLの冷却核分離緩衝液Bで再懸濁し、0.5%Tritonを補充した。チューブを穏やかに反転させ、ペレットを完全に再懸濁させた。次いで、得られた細胞溶解物を2つの篩の組み合わせで濾過し、500メッシュの篩を上に用いて、より大きな組織破片を除去した。そして底に1000メッシュの篩を用いて核を回収した。ふるいの適切なメッシュサイズの選択は、植物の核のサイズに依存する。滅菌ろ紙を篩の裏側に使用して、溶解物および小細胞破片の一部を吸収させた。核を含む溶解液を新鮮な1.5ミリリットルの遠沈管に移し、300rcfで4分間、摂氏4度で紡糸して核を回収した。遠心分離後、ピペットチップを使用して、できるだけ多くの上清を除去した。800マイクロリットルの量で、核洗浄緩衝液を加えた。そしてチューブを穏やかに反転させ、核を再懸濁させた。チューブを300 rcfで再び回転させ、摂氏4度で4分間回転させた。合計3回の洗浄の後、得られた核を新鮮な1.5ミリリットルの遠沈管で合わせ、摂氏4度で4分間、300rcfで回転させた。ピペットチップを使用して、残りのバッファーをできるだけ多く除去しました。次のステップは、抗体のインキュベーションであった。50マイクロリットルの核のアリコートを、ジギトニン中のEDTA、BSA、プロテアーゼ阻害剤カクテルを添加した1ミリリットルの抗体緩衝液に再懸濁した。150マイクロリットルの核懸濁液のアリコートを、1回の反応のために新鮮な1.5ミリリットルのチューブに入れ、2マイクロリットルの抗体を各チューブに添加した。このアッセイでは、抗ヒストン−H3−リジン−4−トリメチル化抗体および免疫グロブリンG陰性対照群についての2つの生物学的複製を、抗体添加後にセットアップした。溶液を穏やかに混合し、チューブを水平シェーカー上に放置し、12rpmで摂氏4度で一晩ハイブリダイゼーションさせた。翌朝、チューブを取り出し、800マイクロリットルの免疫沈降洗浄緩衝液を用いて核を洗浄した。チューブを穏やかに反転させて混合し、水平シェーカー上に室温で12rpmで5分間放置した。洗浄後、チューブを摂氏4度で4分間、300rcfで回転させた。遠心分離後、上清をピペットチップを用いて除去した。これを合計3回の洗浄で繰り返した。3回目の洗浄後、チューブを摂氏4度で2分間300 rcf回転させ、ピペットチップを使用して残りのバッファーを可能な限り除去しました。インキュベーションのためにTn5トランスポザーゼミックスを調製した。1マイクロリットルのトランスポザーゼを、各150マイクロリットルのトランスポザーゼインキュベーション緩衝液に添加した。反応回数に応じて、まずトランスポザーゼ溶液ミックスを調製することをお勧めします。次いで、各チューブに150マイクロリットルのアリコートを加えた。溶液を穏やかに混合し、室温で12rpmで水平振とう機上に2時間放置した。チューブを10〜15分ごとに穏やかに混合した。インキュベーション後、室温で800マイクロリットルの免疫沈降洗浄バッファーを用いて核を3回洗浄し、未結合のTn5トランスポザーゼを除去した。3回目の洗浄後、チューブを摂氏4度で2分間300 rcfで回転させ、ピペットチップを使用して残りのバッファーを除去しました。タグ付け工程のために、300マイクロリットルのタグ付け緩衝液を反応管に添加した。溶液をよく混合し、摂氏37度で1時間インキュベートした。10マイクロリットルの10マイクロリットルの10マイクロリットルのEDTAを30マイクロリットルの10%SDSでインキュベートした後、反応を決定した。次に300マイクロリットルのDNA抽出緩衝液を加えた。不規則なDNA抽出を行った。DNA断片を25マイクロリットルの滅菌水に溶解した。24マイクロリットルをNGSライブラリー構築におけるPCR増幅に使用した。この図は、DAPIによる無傷の核染色を画像化し、顕微鏡下で十分な量の無傷で比較的きれいな核を得ることがCUT&Tagにとって重要なステップであることを示しています。PCR後、2マイクロリットルを移入し、DNAのサイズを1.5%アガロースゲル上でチェックした。この図は、ネガティブコントロールの免疫グロブリン遺伝子と比較することを示している。ヒストンH3リジン4トリメチル化サンプルからのDNA断片の大部分は、280〜500塩基対の範囲であるべきである。DNA断片を精製し、ハイスループットシーケンシングによってプロファイリングすることができます。この図は、抗ヒストンH3リジン4トリメチル化抗体についての生成シークエンシングを免疫グロブリンG陰性対照群と比較した結果を示す。この技術は、ChIP-seqと比較して、手順が簡素化された少数の細胞を使用して、高解像度で非常に低いバックグラウンドでDNAライブラリを生成します。CUT&Tagは新しい方法であり、まだ進行中です。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

特定の植物遺伝子上にヒストン修飾を検出するために信頼性の高い有用なアプローチが説明されています。アプローチは、クロマチン免疫沈降（ChIP）とリアルタイム定量PCRを兼ね備えています。それは、多様な生理学的プロセスにおいて役割を持つ特定の遺伝子のヒストン修飾の検出を可能にする。...

植物の葉におけるヒストン修飾の検出

ネイティブ組み合わせると高解像度質量分析とクロマチン免疫沈降を架橋することにより、ChroPアプローチはヒストン修飾、変異体及び機能的に異なるクロマチンドメインで相乗非histonicタンパク質の複合プロテオミクスアーキテクチャを分析することができます。...

ChroPアプローチは、クロマチンの遺伝子座特異的プロテオームの風景を分析するために、チップと質量分析を組み合わせ

私たちは、免疫染色、蛍光in situハイブリダイゼーション 、ホールマウントシロイヌナズナ胚珠の量的、高分解能イメージングに続いてDNA染色のためにここに効率的で信頼性の高いプロトコルを提供する。この方法は、正常なクロマチン修飾および核構造を分析するために使用した。...

ホールマウント胚珠内でのクロマチン修飾や核構造の定量的、単一細胞分析のための効率的な方法<em&gt;シロイヌナズナ</em

クロマチン免疫沈降は、DNAは、インビボでのシロイヌナズナのタンパク質の結合部位を同定するための強力な技術です。この手順は、クロマチン架橋および断片化、目的のタンパク質に対する選択的な抗体を用いた免疫沈降、および結合したDNAの定量PCR分析を含みます。私たちは、シロイヌナズナ植物用に最適化され、単純なChIPアッセイを説明します。...

シロイヌナズナタンパク質-DNA相互作用の同定のための免疫沈降アッセイクロマチン<em&gt;インビボ</em

ヒストン 3 リジン 79 ジメチル化 (H3K79me2) - 内にあるヒストン マークのクロマチン免疫沈降 (チップ) の胎生期および生後の脳組織から神経前駆細胞の培養を特定し効果的かつ再現可能な手法を提案しますヒストン 3...

3 ヒストンのリジン 79 ジメチル化マークのクロマチン免疫沈降に続いて神経前駆細胞の分離と培養

このプロトコルは、エンジニアリングの干ばつ耐性作物を支援するための潜在的なエピジェネティックマーカーとして機能するヒストン翻訳後修飾のプロファイリングのために、ソルガム葉材料から無傷のヒストンを効果的に抽出するために開発されました。...

潜在的エピジェネティックマーカーのトップダウン質量分析プロファイリングのためのソルガム葉組織からのヒストンの分離

ここでは、M.オリザエおよび他の糸状菌の病因における新しい標的遺伝子を同定することができるヒストン修飾のゲノム全体の分布を分析するプロトコルを提示する。...

マグナペアテオリザエにおけるクロマチン免疫沈降シーケンシング法を用いたヒストン修飾分布のゲノム解析

液体クロマトグラフィー、トラップ型イオンモビリティー分光、飛行時間型質量分析(LC-TIMS-ToF...

液体クロマトグラフィー、トラップ型イオンモビリティー分光分析、飛行時間型質量分析を用いたヒストン修飾スクリーニング(英語)

エピジェネティックな分野に不慣れな研究者は、CUT&amp;TagがChIPアッセイの非常に簡単な代替手段であることに気づくでしょう。CUT&amp;Tagは、希少細胞集団と初代細胞集団のエピジェネティック研究に多大な恩恵をもたらし、非常に少数の細胞から高品質のデータを生成しました。このプロトコールでは、マウス後肢筋から単離したマウス筋芽細胞に対するH3K4me1...

Cleavage Under Targets and Tagmentation (CUT&#38;Tag) Assay in Mouse Myobblast Researchにおける活用

このプロトコルにより、さまざまな臨床サンプルから効率的なヒストン抽出が可能となり、その後の翻訳修飾解析(LC-MS/MS)が可能となります。主要なヒストン修飾の堅牢な検出を促進することで、大規模な臨床コホートにおける包括的なエピジェネティックプロファイリングの貴重なツールとなります。...

質量分析によるエピジェネティックプロファイリングのための臨床標本からヒストン抽出

本研究は、組織切片の直接的な空間バーコードと単一細胞マルチオーム解析を組み合わせた空間的Trekker–CUT&amp;Tagマルチオームプロトコルを提示します。このアプローチにより、遺伝子発現とヒストンH3K27ac修飾の空間的に分解された単一細胞プロファイリングを同時に可能にし、組織微細解剖学の文脈における遺伝子調節に関する機構的洞察を提供します。...

凍結組織切片におけるトランスクリプトームおよびエピゲノム標的の空間的に分解された統合マルチオミクスプロファイリング

学ぶ 植物におけるCUT&Tag法を用いたH3K4me3修飾のエピゲノムプロファイリング手法。綿葉を材料にした核分離、抗体認識、Tn5トランスポザーゼによるin situ切断の詳細なプロトコルを解説し、遺伝子発現制御の分子メカニズム研究への応用を示します。

標的下およびタグ付け下での切断を用いた植物におけるH3K4me3修飾のプロファイリング

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