真空支援吸着剤抽出によるヒト関連サンプルからの活発に生産された微生物揮発性有機化合物の捕捉
June 1st, 2022
このプロトコルは、真空支援吸着剤抽出法、Entechサンプル調製レールを使用した質量分析と組み合わせたガスクロマトグラフィー、およびデータ分析による生体サンプルからの揮発性有機化合物の抽出を記述しています。また、生物学的サンプルの培養および安定同位体プロービングについても記載する。
このプロトコルにより、さまざまな生物学的サンプル中の微生物生物から揮発性代謝産物および積極的に産生された揮発性物質を容易に濃縮および同定することができます。VASEは、低存在量の揮発性物質を濃縮するよりユーザーフレンドリーな方法です。必要なのは、ほぼ真空下のサンプルだけで、残りは物理学に任せてください。
臨床サンプルの揮発性分析へのアクセスは、多くの異なる疾患状態における代謝バイオマーカーの発見に重要な意味を持ちます。例えば、病原体の運転と感染、または抗菌療法の成功は、唾液、喀痰、または呼気サンプルの揮発性分析によって検出することができます。糞便サンプルを調製するには、1.5ミリリットルの微量遠心管内の100ミリグラムの糞便に1ミリリットルの脱イオン水を加え、3分間渦巻きます。
使用しないときは、サンプルを氷の上に保管してください。20ミリモルの13Cグルコースを含む485ミリリットルのBHI培地または30%重水素を含むBHI培地を15マイクロリットルの糞便および水の混合物に加え、サンプルの最終体積が500マイクロリットルになるようにする。技術的な3連でサンプルを準備します。
下水サンプルを調製するには、13Cグルコースまたは30%重水素を含む500マイクロリットルのBHI培地に500マイクロリットルの下水を加え、総容量を1ミリリットルにする。サンプルを3連で準備し、氷の上に保管します。唾液サンプルを調製するには、500マイクロリットルの唾液を13Cグルコースまたは30%重水素を含む500マイクロリットルのBHI培地に加え、総容量550マイクロリットルにする。
サンプルを3連で準備し、氷の上に保管します。喀痰サンプルを調製するには、15マイクロリットルの喀痰をバイアルに加える。サンプルを3連で準備し、氷の上に保管します。
空のVOAバイアルをコールドプレートの上に置き、コールドプレートをバイオセーフティフードの氷の上に置きます。5600 SPEU の電源をオンにし、必要な温度に調整します。20ミリリットルのVOAバイアルに、氷上でバイアルの外側に結露が生じた場合に備えて水に抵抗する耐水性マーカーを使用して、サンプル、複製、およびHSP IDに従ってラベルを付けます。
バイオセーフティフードの内側で、バイアルの白いキャップを緩め、サンプルをバイアルに素早くピペットし、蓋ライナー、ブラックキャップ、HSPを組み立てます。サンプルとHSPを含むバイアルをコールドプレートに戻します。すべてのサンプルをガラスバイアルに調製したら、真空ポンプをオンにし、バイアルを真空下に置き、真空源を取り外します。
圧力計を使用してすべてのサンプルを真空下に置いた後、圧力を再確認してください。バイアルが漏れている場合は、キャップがしっかりとねじ込まれていること、およびHSPライナーと蓋ライナーの白いOリングが正しく固定されていることを確認してください。バイアルをSPEUに入れ、200RPMでの攪拌で時間と温度を最適化します。
培養物を摂氏70度で1時間抽出し、糞便、下水、唾液、および喀痰サンプルを用いて37°Cで18時間安定アイソタイププロービング実験を抽出する。コールドプレートをマイナス80°Cに置き、抽出期間が完了した後に使用します。抽出が完了したら、サンプルをコールドプレート上に15分間置いてHSPとバイアルのヘッドスペースから水蒸気を引き出し、HSPをスリーブに移します。
Entechソフトウェアでサンプルのシーケンスを設定します。プログラムを開き、[計測器]ドロップダウンメニューの右側にあるオプションで[5800]と[シーケンス]を選択します。シーケンス テーブルを保存し、左側の [実行] を選択し、空の HSP がデソーバーでない場合は、[デソーバーで空白から開始] を選択します。
HSPは、シーケンス内の各サンプルについてSPRによって処理されることに注意してください。SPR をウォームアップさせます。SPR がすべてのサンプルを自動的に実行できるようにします。
GC-MS側のシーケンスは、自動的にデータを別々のファイルに記録します。処理方法にピークを追加するには、[キャリブレーション]を選択し、[外部標準化合物]の下にある[化合物の編集]、[名前]、[化合物の挿入]を選択します。化合物の名前、保持時間、および量子シグナルターゲットイオンを追加します。
75%を超える確率を持つ化合物を含む3つの最大のピークを追加し、化合物の各識別イオンのアライメントがピークの中心内にあることを確認します。[OK] を選択して保存し、[方法] と [保存] を選択します。プロセスメソッドを設定したら、定量化と計算に進み、次に定量結果の表示とQEDITに進み、データを定量化します。
ここでは、真空支援吸着剤抽出に続いてGC-MS上で熱脱着を行い、細菌の単一および共培養物の揮発性プロファイルを調査し、ヒト糞便、唾液、下水、および喀痰サンプルから安定同位体プロービングで積極的に産生された揮発性物質を同定した。単一および共培養は、細菌種黄色ブドウ球菌、緑膿菌、およびアシネトバクターバウマンニからなっていた。43個の注釈付き揮発性分子が、24時間および48時間の時点でモノ培養および共培養物から検出された。
重水素と比較して、完全に標識された揮発性分子への13Cの取り込みが多かった。13Cは、すべての糞便、下水、および唾液サンプルの2-ブタノン、3-ヒドロキシ、2,3-ブタンジオンジアセチル、酢酸、およびフェノールに取り込まれた。アセトン、ブタン酸、およびプロパン酸は、唾液および下水中で標識として検出された。
一方、ジメチルトリスルフィドおよびジメチルジスルフィドは、糞便および唾液サンプルの両方で富化されていた。揮発分1−プロパノール、2−ブタノン、ベンゾフェノン、エタノール、および酢酸メチルチオールは下水中にのみ富化され、2,3−ペンタンジオンは唾液中に富化された。重水素は、唾液または下水サンプルのいずれかから揮発性酢酸、ベンズアルデヒド、4-メチルジメチルトリスルフィド、およびフェノールに取り込まれた。
酢酸、三硫化ジメチル、アセトン、およびプロパノール2-メチルは、培養喀痰サンプルよりも培養喀痰サンプル中に多く含まれていた。変異体であるPERMANOVAの順列多変量解析を、嚢胞性線維症喀痰サンプルからの揮発性存在量のBray-Curtis距離行列について実施した。サンプルを寄贈した被験者は、13C標識培養喀痰の変動の51%、未培養喀痰の変動の33%を説明していることがわかりました。
ここでは、嚢胞性線維症を有する7人から採取した培養喀痰試料からの揮発分中の13Cグルコースによる安定同位体標識の成功が示される。大多数のサンプルについてより高い13Cの取り込みを有する揮発性物質をパネル5Aに示し、大多数の喀痰サンプルにおいてより低いパーセントの13Cの取り込みを有するものをパネル5Bに示し、そして少数の喀痰サンプルにおいてより低い13Cパーセントの変換を有する分子をパネル5Cに示す。常に約1分後にバイアルの圧力を再確認してください。
真空が壊れると、VASE法の感度と速度が損なわれます。この手順に続いて、安定同位体プロービングが実施された場合、残りの材料からDNAを抽出して、揮発性分子の産生に寄与した可能性のある微生物生物または種を同定することができる。この方法は、同位体プロービングなしで任意のサンプルタイプから揮発性物質を検出する場合にも有用である。
感度とサンプル量が少ないという利点により、多くのアプリケーションがこの手法の恩恵を受けることができます。
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概要
このプロトコルは、ユーザーフレンドリーな真空補助吸着剤抽出法を使用して、生物学的サンプルから揮発性有機化合物の抽出と同定を可能にします。この方法は、様々な疾病状態における代謝バイオマーカーの発見に重要な意味を持つ可能性のある低濃度の揮発性物質の分析に特に有用です。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 生物学的サンプル分析
- 揮発性有機化合物
- 代謝バイオマーカーの発見
背景
- 揮発性代謝物は微生物生物の代謝プロセスを示す可能性があります。
- VASEはこれらの化合物の濃縮を簡素化します。
- 臨床サンプルの分析は疾病検出に役立ちます。
- この方法は唾液や呼気を含む様々な生物学的サンプルに適用できます。
研究の目的
- 生物学的サンプルから揮発性代謝物を濃縮し同定すること。
- 臨床診断のための揮発性分析の意味を探ること。
- 研究者に簡単なプロトコルを提供すること。
使用される方法
- 真空補助吸着剤抽出（VASE）
- ガスクロマトグラフィーと質量分析の連携
- Entechサンプル準備レールを使用したサンプル準備
- 生物学的サンプルの安定同位体プロービング
主な結果
- サンプルからの低濃度の揮発性の成功的な濃縮。
- 微生物活動に関連する代謝物の同定。
- 病原体の検出と抗菌療法の評価の可能性。
- 様々なサンプルタイプでの実証された方法の有効性。
結論
- VASE法は生物学的研究における揮発性分析に効果的です。
- 揮発性分析は代謝バイオマーカーの発見に大きく貢献する可能性があります。
- さらなる研究により臨床診断への応用が拡大する可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Disentangling the microbial origins of volatile organic compounds (VOCs) in human-associated samples is critical for advancing metabolic biomarker discovery and understanding host-microbe interactions. The integration of vacuum-assisted sorbent extraction (VASE) with stable isotope probing enables precise attribution of VOCs to active microbial metabolism, supporting translational research and early biomarker validation. This workflow enhances predictive confidence in identifying disease-relevant metabolic signatures and informs risk-adjusted portfolio decisions in biopharma R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of microbial metabolic pathways through VOC profiling and stable isotope incorporation.
- Supports biological de-risking by distinguishing host versus microbial VOC sources in complex samples.
- Facilitates functional target validation for microbiome-driven biomarker programs.
Screening & Assay Development
- Prepares validated biological matrices for downstream VOC analysis workflows.
- Delivers reproducible, quantitative VOC measurements suitable for assay standardization.
- Enables scalable screening of microbial cultures and clinical samples for volatile biomarkers.
Translational & Preclinical Research
- Aligns VOC outputs with disease-relevant metabolic signatures in human samples.
- Provides continuity from discovery-stage microbial profiling to preclinical biomarker validation.
- Supports risk-adjusted advancement of candidate biomarkers based on mechanistic evidence.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery, screening, and translational research by enabling robust VOC attribution and quantitative analysis across mono- and co-cultures as well as clinical matrices.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on microbial metabolic activity using stable isotope-labeled substrates.
- Screening: Provides reproducible, quantitative VOC readouts for comparative analysis across conditions and time points.
- Analytics: Delivers annotated VOC profiles and multivariate statistical outputs (e.g., PERMANOVA) for data-driven decision making.
- Translational Research: Connects microbial VOC production to disease-relevant sample types, supporting biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, solvent-free extraction platform adaptable to diverse biological and clinical sample types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in microbial biomarker discovery and reduces mechanistic ambiguity in VOC attribution.
- Operational Value: Streamlines VOC extraction with minimal sample volume and high sensitivity, supporting reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions for biomarker programs by providing robust, quantitative metabolic data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidate biomarkers and supports cross-functional R&D integration.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microbial metabolomics and analytical chemistry for data interpretation.
- Needs access to VASE instrumentation, GC-MS platforms, and stable isotope-labeled substrates.
- Demands rigorous cross-team standardization of sample preparation and data analysis workflows.
- Adaptable to a range of biological matrices, but extraction parameters may require optimization per sample type.
- Maintaining vacuum integrity is critical for sensitivity and reproducibility, as highlighted in the protocol.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:59
Stable Isotope Probing in Biological Samples Preparation
2:17
Sample Extraction
4:10
Analyze Samples on the Gas Chromatography Mass Spectrometer (GC-MS)
4:56
Data Analysis
5:45
Results: GC-MS, Heatmaps, and Data Analysis of the 13C-Labeled Volatiles in Fecal, Saliva, Sewage, Cultured and Uncultured Sputum Samples
8:24
Conclusion
