Name: 真空支援吸着剤抽出によるヒト関連サンプルからの活発に生産された微生物揮発性有機化合物の捕捉 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: 学ぶ真空支援吸着剤抽出法による微生物由来揮発性有機化合物の分析技術。糞便・唾液・痰などのヒト関連サンプルから低容量で高感度にVOCを検出し、安定同位体標識で代謝活性を追跡する手法です。

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ヘザー・モーガンとリンダ・M・カリキンに、この原稿を慎重に編集してくれたことに感謝します。この研究はNIH NHLBIの支援を受けた(助成金5R01HL136647-04)。

1. ヘッドスペース吸着ペン(HSP)とサンプル分析の考慮事項
注:吸着剤テナックスTAを含むHSPは、広範囲の揮発性物質を捕捉するために選択された。テナックスは、他の吸着剤と比較して水に対する親和性が低いため、水分の高いサンプルからより多くのVOCを捕捉することができます。テナックスはまた、不純物のレベルが低く、再利用のために調整することができます。吸着剤の選択もGC-MSに設置したカラムを考慮して行われました( 材料表参照)。
<ol><li>サンプル抽出に使用したのと同じ条件でメディアおよび/またはサンプルブランクを抽出することによって、ネガティブコントロールを生成します。</li>
	<li>抽出されたサンプルを分析する前に、GC-MS上のブランクHSP(以前にクリーンで有意なバックグラウンドがないことが以前に確認された)を分析します。サンプルタイプ間でブランクを実行します(例えば、細菌の単一培養の3回の反復、ブランク、細菌の共培養の3回の反復、ブランクなど)。</li>
	<li>サンプルの抽出と分析の前に、香りのよいパーソナルケアアイテムの使用や臭いのする食品の消費を制限してください。理想的には、アルコールまたは他の揮発性クリーナーによって少なくとも30分間洗浄されていないバイオセーフティフードにサンプルを調製する。サンプル調製の前に、バイオセーフティフード内の空気の流れを30〜60分間オンにします。</li>
	<li>サンプル調製中の揮発性放出を制限するために、サンプルを氷上に保管してください。</li>
</ol>2. 単一および共培養の調製
<ol><li>バイオセーフティフード内で、 A. baumannii、黄色ブドウ球菌、 および 緑膿菌 の培養物をトッド・ヒューイット増殖培地に接種する。200rpmの攪拌で37°Cで一晩インキュベートする。</li>
	<li>一晩のインキュベーションの後、バイオセーフティフード内で培養ハンドリングを行う。各培養物を500nmで光学密度0.05に希釈する。</li>
	<li>共培養物を等分に混合し、200 μLのコントロール培地、モノ、または共培養を96ウェルプレートの各ウェルにピペットで混合し、37°Cのインキュベーターに24時間置いた。48時間インキュベーション用の第2プレートを準備する。</li>
	<li>インキュベーション期間の終わりに、セクション4で抽出用のサンプルを準備します。ピペット液体培養物を微量遠心チューブに入れ、-80°Cで保存した。 注: この時点で、サンプルは -80 °C で保存して、必要に応じて後で抽出できます。</li>
</ol>3. 生体試料調製における安定同位体プロービング
注:糞便および唾液サンプルは、カリフォルニア大学アーバイン治験審査委員会(HS#2017-3867)の承認を得て、匿名のドナーから寄付されました。下水はカリフォルニア州サンディエゴから来ました。喀痰サンプルは、ミシガン大学医学部治験審査委員会(HUM00037056)によって承認されたより大きな研究の一環として、嚢胞性線維症の被験者から収集された。
<ol><li>バイオセーフティフード内のすべての生物学的サンプル調製を行う。<ol>
<li>糞便サンプルを調製するには、1.5mL微量遠心管内の100mgの糞便に1mLの脱イオン水を加え、3分間渦巻き込む。使用していないときは氷の上に置きます。<ol>
<li>15 μL の糞便と水の混合物に、20 mM 13C グルコースを含む 485 μL のブレインハート注入 (BHI) 培地、または BHI と 30% 重水素 (D2O) を加えます。サンプルの最終容量が 500 μL であることを確認します。サンプルを技術的な 3 連で準備します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>下水サンプルを調製するには、500 μL の下水を 20 mM 13 C グルコースを含む BHI 500 μL に、または BHIを 30% D2O と共に 1 mL の総量で加えます。サンプルを3連で準備する。使用していないときは氷の上に置きます。</li>
		<li>唾液サンプルを調製するには、20 mM 13Cグルコースを含む500 μLのBHIに50 μLの唾液を加え、30%D2 Oを含むBHIを350 μLの総容量で加えます。使用していないときは氷の上に置きます。</li>
		<li>培養前後の試料中に存在する揮発分を比較するために喀痰試料を調製するには、15μLの喀痰で最初の抽出を行う。サンプルを3連で準備する。使用していないときは氷の上に置きます。試料抽出用のセクション4に進み、200rpmの攪拌で37°Cで18時間抽出する。</li>
		<li>未培養の喀痰サンプルの最初の抽出の終了後、バイアルを喀痰と共に保存する。3.5.1からの痰でバイアルに20mM 13Cグルコースを含む500μLの BHIを加える。使用していないときは氷の上に置きます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>サンプル抽出のセクション 4 に進みます。</li>
</ol>4. サンプル抽出
<ol><li>空の揮発性有機分析(VOA)バイアル(20mL)をコールドプレートの上に置き、コールドプレートをバイオセーフティフードの氷の上に置きます。</li>
	<li>5600吸着ペン抽出ユニット(SPEU)の電源を入れ、各方法の必要に応じて所望の温度に調整します。 注:37°Cでの安定同位体プロービング実験の場合、設定値に達するには最大15分かかることがあります。70 °C での単一および共培養実験の場合、設定値に達するまでに最大 60 分かかることがあります。</li>
	<li>メディアまたはサンプル コントロールの HSP を含め、準備されたサンプルの数に等しいクリーンな HSP を収集します。</li>
	<li>20 mL VOA バイアルを、必要に応じてサンプル、複製、および HSP ID に従ってラベル付けします。氷の上にいる間にバイアルの外側に結露が形成された場合に備えて、水に抵抗するマーカーを使用してください。</li>
	<li>バイオセーフティフードの内側で、バイアルの白いキャップのネジを外し、サンプルをバイアルに素早くピペッティングし、黒いキャップ、蓋ライナー、HSPを組み立てます。 注:サンプルはHSPと接触してはならず、サンプル量はサンプルの種類によって異なります。</li>
	<li>サンプルとHSPを含むバイアルをコールドプレートに戻します。</li>
	<li>サンプルごとに手順 4.5 と 4.6 を繰り返します。これらの手順を一度にすべて実行するのではなく、サンプルごとに実行して、サンプルの温暖化を防ぎ、したがって、揮発性の早期放出を防ぎます。</li>
	<li>すべてのサンプルをガラスバイアルに調製したら、ベンチのバイオセーフティフードの外で次の手順を実行します。真空ポンプの電源を入れ、バイアルを30mmHgの真空下に置き、真空源を取り外します。 注:バイアルは、真空の適用が完了した後、コールドトレイ上にある必要はありません。</li>
	<li>圧力計を使用してすべてのサンプルを真空下に置いた後、圧力を再確認してください。バイアルに漏れがある場合は、キャップがしっかりとねじ込まれていること、およびHSPライナーと蓋ライナーの白いOリングが正しく所定の位置にあることを確認してください。 注:シールが損なわれると、真空下のバイアルと比較して揮発性検出が低下する可能性があります。</li>
	<li>バイアルをSPEUに入れ、200rpmでの攪拌で時間と温度を最適化します。培養物を70°Cで1時間抽出する。 糞便、下水、唾液、および喀痰サンプルで安定同位体プロービング実験を37°Cで18時間抽出する。</li>
	<li>抽出期間が完了した後に使用するために-80°Cにコールドプレートを置く。</li>
	<li>抽出が完了したら、サンプルをコールドプレート上に15分間置き、HSPとバイアルヘッドスペースから水蒸気を引き出します。</li>
	<li>HSPをスリーブに移します。 注:実験は、HSPからより揮発性の高い化合物を失う前に、室温で最大1週間ここで一時停止することができます。</li>
</ol>5. ガスクロマトグラフィーでサンプルを分析する - 質量分析計(GC-MS)
<ol><li>次のGC-MS( 材料表を参照)設定を使用します:5分保持で35°C、170°Cまで10°C/分のランプ、20:1の分割比で38分の合計実行時間で230°Cまで15°C/分のランプ。</li>
	<li>脱着方法を次のように設定します:2分間、70°C予熱;2分間260°C脱着;34分、260°Cベークアウト;2分間、70°Cポストベークした。</li>
	<li>サンプルのシーケンスを設定し、インストルメンテーションに従って実行を開始します。<ol>
<li>Entechソフトウェアでシーケンスを設定するには、プログラムを開きます。計測器ドロップダウンメニューの右側にあるオプションで、[ 5800 |シーケンス。</li>
		<li>Entechソフトウェアのシーケンステーブルは、GC-MSソフトウェアの場合と同様に観察します。[サンプル ID] 列に、現在のdate_vial番号に従って名前を付けます。Name は GC-MS シーケンステーブルの Name に類似しており、5800 Method は温度ランプの速度、保持時間などを決定します (メニューが開き、ステップ 5.2 で生成されたメソッドが選択されます)。</li>
		<li>[トレイ] 列と [位置] 列は、サンプル調製レール (SPR) が HSP を拾う場所を決定することに注意してください。<ol>
<li>すぐ左にそれぞれ30個のスポットがある2つのトレイを観察し、それぞれ5つのスポットを持つ6つの列としてレイアウトします。最も左側でユーザー(手前)に最も近いトレイ位置は位置1であり、右端、最も遠いトレイ位置は位置30です。</li>
			<li>これらのトレイは HSP A または B であり、HSP B は SPR に近いトレイ(最も内側のトレイ)であり、HSP B のすぐ後ろは HSP ブランクであることに注意してください。抽出したサンプルをトレイに置き、それに応じてシーケンス上のスポットを選択します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>シーケンステーブルを保存し、左側の「 実行 」を選択してから、ブランクの HSP がデ ソーバーにある場合は、デソーバー でブランクから開始します (黄色のラベルでマークされた HSP で示されます)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>HSPは、シーケンス内の各サンプルについてSPRによって処理されることに注意してください。SPRをウォームアップさせると、空白がデソーバにあるかどうかを確認するメッセージが画面の上部に表示されます。[ スキップ ]をクリックして、ペンがあることを確認します。SPR がすべてのサンプルを自動的に実行できるようにすると、GC-MS 側のシーケンスによってデータが自動的に別々のファイルに記録されます。</li>
</ol>6. データ解析
<ol><li>GC-MSソフトウェアの品質フィルタデータ(材料表)。<ol>
<li>クロマトグラム上の各ピークを確認し、米国国立標準技術研究所(NIST)ライブラリ(または利用可能な別のライブラリ)と一致するピークに注釈を付けます。</li>
		<li>アノテーション付きクロマトグラムピークを処理方法に追加します。75% を超える確率を持つ化合物を含むようにピークを選択するための基準を設定し、化合物の各識別イオンのアライメントがピークの中心内にあることを確認します。<ol>
<li>処理方法にピークを追加するには、[ |のキャリブレーション] を選択します。複合|の編集名前の| 外部標準コンパウン ドの下にコンパウンドを挿入します。化合物の名前、保持時間、量子シグナル ターゲットイオンを追加します。3 つの最大のピークを追加します。保存するには、[OK] | を選択します。 メソッド|保存します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>プロセス方法を設定したら、 定量化に進み||の計算と 表示QEdit Quant Result.</li>
		<li>各コンパウンドを調べて、ピークが予想される保持時間と一致し、バックグラウンドノイズを超えていることを確認します。</li>
		<li>QEdit が完了したら、[ |の終了] を選択します。はい、 QEditsを保存してメインのクロマトグラムに戻ります。左側のファイルを開いて、領域統合をエクスポートします。 定量|の選択レポートの生成。</li>
		<li>DExSI で使用するためにファイルをエクスポートするには、[ファイル|] を選択します。 データを AIA 形式にエクスポートする |[新しいディレクトリを作成] を選択し、ファイルの場所を選択するか、[既存のディレクトリを使用] を選択します。</li>
		<li>エクスポートするファイルを選択するための新しいウィンドウが開きます。ファイルをウィンドウの右側に移動し、[ プロセス]をクリックします。変換されるファイルの数に応じて数秒から数分待ちます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>DExSIソフトウェア(https://github.com/DExSI/DExSI)の指示に従ってDExSIの同位体存在量を補正し、好きなソフトウェアやプログラム(Rなど)で解析を行います。図の生成に使用されるスクリプトは、<a data-saferedirecturl="https://www.google.com/url?q=https://github.com/joannlp/VOC_SIP&source=gmail&ust=1646398895210000&usg=AOvVaw18Jx-lKhdf3eNanCnF4OhQ" href="https://github.com/joannlp/VOC_SIP" target="_blank">https://github.com/joannlp/ VOC_SIP</a>にあります。</li>
</ol>

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</ol>

V. L. V.とS.J..B.D.はEntech Instruments Inc.の元従業員であり、K. W.はEntechのUniversity Programのメンバーです。J. P.、J.K.、およびC.I.R.には、宣言すべき利益相反はありません。

インビトロ培養物およびヒト関連サンプルにおける揮発性産生を同定するために、緑膿菌、黄色ブドウ球菌、およびA.バウマニイの単一および共培養物の揮発性分析、ならびに異なる生物学的サンプルの安定同位体プロービングが行われた。モノ培養および共培養についての分析において、揮発分は、70°Cで1時間の短い抽出を行うことにより検出された。 単一および共培養の揮発性分析により、個々の種によって、および他の種との相互作用中に産生される化合物の調査が可能になった。異なる文化タイプと時間ポイント間で相対的な豊富さに違いがありました。安定同位体プロービング実験では、生体試料には健常者由来の糞便や唾液、嚢胞性線維症の被験者由来の下水や痰が含まれていた。安定同位体プロファイリングにより、37°Cで18時間抽出することにより、活発に生成した揮発性分子の同定が可能となりました。 より低い温度での長い抽出時間は、生物学的サンプル中に存在する微生物の増殖および代謝を可能にした。13CグルコースおよびD2O富化物を比較すると、標識された13Cを有するより広範な同位体富化が存在す...

揮発性有機化合物(VOC)は、すべての生物から放出され、異なる微生物が固有のVOCシグネチャを有するため、細菌の検出と同定に大きな期待を寄せています。揮発性分子は、嚢胞性線維症(CF)を有する被験者と健常対照者5,6を区別することに加えて、慢性閉塞性肺疾患1、尿中結核2、人工呼吸器関連肺炎4を含む様々な呼吸器感染症を検出するための非侵襲的測定として利用されている。揮発性シグネチャは、CFにおける特定の病原体感染(黄色ブドウ球菌7、緑膿菌8、9、および黄色ブドウ球菌対緑膿菌10)を区別するためにも使用されている。 しかし、このような生物学的サンプルの複雑さにより、特定のVOCの発生源を特定することはしばしば困難である。
複数の感染微生物から揮発性プロファイルを解きほぐすための1つの戦略は、単一培養および共培養11の両方において微生物のヘッドスペース分析を行うことである。ヘッドスペース分析は、サンプル自体に埋め込まれた分析物ではなく、サンプルの上の「ヘッドスペース」に放出される分析種を調べます。微生物代謝産物は、複雑な臨床サンプル中の微生物代謝産物の起源を決定することが困難であるため、単一培養においてしばしば特徴付けられてきた。細菌単一培養物から揮発性物質をプロファイリングすることにより、微生物が インビトロで 産生する揮発性物質の種類は、その揮発性レパトアのベースラインを表し得る。細菌培養物を組み合わせること、 例えば、共培養物を作成し、産生される揮発性分子をプロファイリングすることは、細菌12間の相互作用または交配を明らかにし得る。
揮発性分子の微生物起源を同定するための別の戦略は、安定同位体で標識された栄養源を提供することである。安定同位体は、中性子の数が異なる天然に存在する非放射性の原子です。動物13の活性代謝を追跡するために1930年代初頭から利用されてきた戦略では、微生物は標識された栄養源から摂食し、安定同位体を代謝経路に組み込んでいる。より最近では、重水(D2O)の形態の安定同位体が、臨床CF喀痰試料14において代謝的に活性な黄色ブドウ球菌を同定するために使用されている。別の例では、13C標識グルコースが、緑膿菌のCF臨床分離株とRothia mucilaginosaとの間の代謝産物の交差摂食を実証するために用いられている12。
質量分析技術の進歩に伴い、揮発性の手がかりを検出する方法は、定性的な観察からより定量的な測定に移行しました。ガスクロマトグラフィー質量分析(GC-MS)を使用することにより、生物学的サンプルの処理は、ほとんどの実験室または臨床現場で手の届くところにあります。揮発性分子を調査する多くの方法は、汚染を検出するために、食品、細菌培養物、およびその他の生物学的サンプル、および空気および水などのサンプルをプロファイルするために使用されてきた。しかし、ハイスループットで揮発性サンプリングを行ういくつかの一般的な方法は、溶媒を必要とし、真空抽出によって提供される利点では実行されません。さらに、分析には、より大きな量または量(0.5mLを超える)のサンプリングされた材料がしばしば必要とされますが、これは基質固有であり、サンプルタイプおよび方法ごとに最適化する必要があります。
ここでは、真空支援吸着剤抽出(VASE)とそれに続くGC-MSでの熱脱着を用いて、細菌の単一培養物および共培養物の揮発性プロファイルを調査し、ヒト糞便、唾液、下水、および喀痰サンプルから安定同位体プロービングで積極的に産生された揮発性物質を同定した(図1)。限られたサンプル量で、VOCはわずか15μLの喀痰から抽出されました。ヒト試料を用いた同位体プロービング実験では、微生物群集の増殖を培養するために、13Cグルコースなどの安定同位体源と培地を添加する必要があった。揮発分の活性産生は、GC−MSによってより重い分子として同定された。静的真空下での揮発性分子の抽出により、揮発性分子の検出が感度が向上しました20,21,22。

<table><tbody><tr><td>13C グルコース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>389374-1G</td><td></td></tr><tr><td>2-Stg Diaph Pump</td><td>Entech Instruments</td><td>01-10-20030</td><td></td></tr><tr><td>20 mL VOA バイアル</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>5719110</td><td></td></tr><tr><td>24 mm ブラックキャップ 穴付き、セプタムなし</td><td>Entech Instruments</td><td>01-39-76044B</td><td>は、バイアルの蓋ライナーを所定の位置に保持</td></tr>します 吸着<tr><td>剤ペン用 24 mm バイアルライナー</td><td>Entech Instruments</td><td>SP-L024S</td><td>は、バイアル</td></tr><tr><td>5600 吸着剤ペン抽出ユニット(SPEU)</td><td>Entech Instruments</td><td>5600-SPES</td><td>5600 吸着剤ペン抽出ユニット-120 VAC</td></tr><tr><td>96ウェルアッセイプレート</td><td>Genesee</td><td>25-224</td><td></td></tr><tr><td>Brain Heart Infusion(BHI)メディア</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>53286-500G</td><td></td></tr><tr><td>ChemStation Stofware</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DB-624 カラム</td><td>Agilent</td><td>122-1364E</td><td>60 m、内径 0.25 mm、膜厚 1.40 ミクロン、GC-MS</td></tr><tr><td>酸化重水素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>151882-1L</td><td></td></tr><tr><td>Dexsi ソフトウェア</td><td>Dexsi (オープンソース)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GC-MS (7890A GC および 5975C 不活性 XL MSD with Triple-Axis Detector)</td><td>Agilent</td><td></td><td>7890A GC および 5975C inert XL MSD with Triple-axis検出器</td></tr><tr><td>ヘッドスペースバンドル HS-B01, 120VA</td><td>エンテックインスツルメンツ</td><td>SP-HS-B01</td><td>ヘッドスペース抽出を実行するためのアイテム バンドルに含まれる</td></tr><tr><td>ヘッドスペース吸着剤ペン (HSP) - ブランク</td><td>エンテックインスツルメンツ</td><td>SP-HS-0</td><td></td></tr><tr><td>ヘッドスペース吸着剤ペン (HSP) テナックス TA (35/60 メッシュ)</td><td>エンテックインスツルメンツ</td><td>SP-HS-T3560</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ遠心チューブ (2mL)</td><td>VWR</td><td>53550-792</td><td></td></tr><tr><td>Oリング</td><td>エンテックインスツルメンツ</td><td>SP-OR-L024</td><td></td></tr><tr><td>サンプル調製レール</td><td>エンテックインスツルメンツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>吸着剤ペンサーマルコンディショナー</td><td>エンテックインスツルメンツ</td><td>3801-SPTC</td><td></td></tr><tr><td>トッド・ヒューイット (TH) メディア</td><td>シグマ</td><td>T1438-500G</td><td></td></tr></tbody></table>

真空支援吸着剤抽出によるヒト関連サンプルからの活発に生産された微生物揮発性有機化合物の捕捉

Capturing Actively Produced Microbial Volatile Organic Compounds from Human-Associated Samples with Vacuum-Assisted Sorbent Extraction

生体試料由来の揮発性有機化合物(VOC)は起源不明です。VOCは、宿主または宿主の微生物群集内からの異なる生物に由来する可能性がある。微生物VOCの起源を解きほぐすために、 黄色ブドウ球菌、緑膿菌 、および アシネトバクター・バウマンニの細菌単培養および共培養物の揮発性ヘッドスペース分析、ならびに糞便、唾液、下水、および痰の生物学的サンプルにおける安定同位体プロービングが行われた。単一培養および共培養物を使用して、個々の細菌種からの揮発性産生を同定するか、または安定同位体プロービングと組み合わせて、生物学的サンプルからの微生物の活性代謝を同定した。
VOCsを抽出するために真空支援吸着剤抽出(VASE)が用いられた。VASEは、半揮発性および揮発性化合物用の使いやすく、商業化された無溶媒ヘッドスペース抽出法です。抽出時に使用される溶媒の不足および真空に近い条件により、 tert-ブチル化および固相マイクロ抽出などの他の抽出オプションと比較して、方法の開発が比較的容易かつ迅速に行われる。ここで説明するワークフローは、単一および共同カルチャからの特定の揮発性シグネチャを識別するために使用されました。さらに、ヒト関連生物試料の安定同位体プロービングの分析により、一般的または一意に産生されたVOCが同定された。本稿では、VASEの一般的なワークフローと実験的考察を、生きた微生物培養物の安定同位体プロービングと併せて提示する。

黄色ブドウ球菌、緑膿菌、A.バウマンニの単一および共培養 単一および共培養は、細菌種 S. aureus、P. aeruginosa、 および A. baumanniiで構成されていた。これらは、ヒトの創傷および慢性感染症に見られる一般的な日和見病原体である。モノカルチャーおよび共培養物中に存在する揮発性分子を同定するために、200rpmの攪拌で70°Cで短い1時間の抽出を行った。24時間および48時間の時点における単一および共培養から、43個の注釈付き揮発性分子が検出され(図2)、その中にはアルデヒド、ケトン、アルコール、硫酸化合物、炭化水素、カルボン酸またはエステル、および芳香族化合物が含まれていた。特定の時点で特定の単一または共培養でのみ検出された少数の揮発性分子があった。例...

このプロトコルは、真空支援吸着剤抽出法、Entechサンプル調製レールを使用した質量分析と組み合わせたガスクロマトグラフィー、およびデータ分析による生体サンプルからの揮発性有機化合物の抽出を記述しています。また、生物学的サンプルの培養および安定同位体プロービングについても記載する。

Volatile organic compounds (VOCs) from biological samples have unknown origins. VOCs may originate from the host or different organisms from within the ...

このプロトコルにより、さまざまな生物学的サンプル中の微生物生物から揮発性代謝産物および積極的に産生された揮発性物質を容易に濃縮および同定することができます。VASEは、低存在量の揮発性物質を濃縮するよりユーザーフレンドリーな方法です。必要なのは、ほぼ真空下のサンプルだけで、残りは物理学に任せてください。臨床サンプルの揮発性分析へのアクセスは、多くの異なる疾患状態における代謝バイオマーカーの発見に重要な意味を持ちます。例えば、病原体の運転と感染、または抗菌療法の成功は、唾液、喀痰、または呼気サンプルの揮発性分析によって検出することができます。糞便サンプルを調製するには、1.5ミリリットルの微量遠心管内の100ミリグラムの糞便に1ミリリットルの脱イオン水を加え、3分間渦巻きます。使用しないときは、サンプルを氷の上に保管してください。20ミリモルの13Cグルコースを含む485ミリリットルのBHI培地または30%重水素を含むBHI培地を15マイクロリットルの糞便および水の混合物に加え、サンプルの最終体積が500マイクロリットルになるようにする。技術的な3連でサンプルを準備します。下水サンプルを調製するには、13Cグルコースまたは30%重水素を含む500マイクロリットルのBHI培地に500マイクロリットルの下水を加え、総容量を1ミリリットルにする。サンプルを3連で準備し、氷の上に保管します。唾液サンプルを調製するには、500マイクロリットルの唾液を13Cグルコースまたは30%重水素を含む500マイクロリットルのBHI培地に加え、総容量550マイクロリットルにする。サンプルを3連で準備し、氷の上に保管します。喀痰サンプルを調製するには、15マイクロリットルの喀痰をバイアルに加える。サンプルを3連で準備し、氷の上に保管します。空のVOAバイアルをコールドプレートの上に置き、コールドプレートをバイオセーフティフードの氷の上に置きます。5600 SPEU の電源をオンにし、必要な温度に調整します。20ミリリットルのVOAバイアルに、氷上でバイアルの外側に結露が生じた場合に備えて水に抵抗する耐水性マーカーを使用して、サンプル、複製、およびHSP IDに従ってラベルを付けます。バイオセーフティフードの内側で、バイアルの白いキャップを緩め、サンプルをバイアルに素早くピペットし、蓋ライナー、ブラックキャップ、HSPを組み立てます。サンプルとHSPを含むバイアルをコールドプレートに戻します。すべてのサンプルをガラスバイアルに調製したら、真空ポンプをオンにし、バイアルを真空下に置き、真空源を取り外します。圧力計を使用してすべてのサンプルを真空下に置いた後、圧力を再確認してください。バイアルが漏れている場合は、キャップがしっかりとねじ込まれていること、およびHSPライナーと蓋ライナーの白いOリングが正しく固定されていることを確認してください。バイアルをSPEUに入れ、200RPMでの攪拌で時間と温度を最適化します。培養物を摂氏70度で1時間抽出し、糞便、下水、唾液、および喀痰サンプルを用いて37°Cで18時間安定アイソタイププロービング実験を抽出する。コールドプレートをマイナス80°Cに置き、抽出期間が完了した後に使用します。抽出が完了したら、サンプルをコールドプレート上に15分間置いてHSPとバイアルのヘッドスペースから水蒸気を引き出し、HSPをスリーブに移します。Entechソフトウェアでサンプルのシーケンスを設定します。プログラムを開き、[計測器]ドロップダウンメニューの右側にあるオプションで[5800]と[シーケンス]を選択します。シーケンス テーブルを保存し、左側の [実行] を選択し、空の HSP がデソーバーでない場合は、[デソーバーで空白から開始] を選択します。HSPは、シーケンス内の各サンプルについてSPRによって処理されることに注意してください。SPR をウォームアップさせます。SPR がすべてのサンプルを自動的に実行できるようにします。GC-MS側のシーケンスは、自動的にデータを別々のファイルに記録します。処理方法にピークを追加するには、[キャリブレーション]を選択し、[外部標準化合物]の下にある[化合物の編集]、[名前]、[化合物の挿入]を選択します。化合物の名前、保持時間、および量子シグナルターゲットイオンを追加します。75%を超える確率を持つ化合物を含む3つの最大のピークを追加し、化合物の各識別イオンのアライメントがピークの中心内にあることを確認します。[OK] を選択して保存し、[方法] と [保存] を選択します。プロセスメソッドを設定したら、定量化と計算に進み、次に定量結果の表示とQEDITに進み、データを定量化します。ここでは、真空支援吸着剤抽出に続いてGC-MS上で熱脱着を行い、細菌の単一および共培養物の揮発性プロファイルを調査し、ヒト糞便、唾液、下水、および喀痰サンプルから安定同位体プロービングで積極的に産生された揮発性物質を同定した。単一および共培養は、細菌種黄色ブドウ球菌、緑膿菌、およびアシネトバクターバウマンニからなっていた。43個の注釈付き揮発性分子が、24時間および48時間の時点でモノ培養および共培養物から検出された。重水素と比較して、完全に標識された揮発性分子への13Cの取り込みが多かった。13Cは、すべての糞便、下水、および唾液サンプルの2-ブタノン、3-ヒドロキシ、2,3-ブタンジオンジアセチル、酢酸、およびフェノールに取り込まれた。アセトン、ブタン酸、およびプロパン酸は、唾液および下水中で標識として検出された。一方、ジメチルトリスルフィドおよびジメチルジスルフィドは、糞便および唾液サンプルの両方で富化されていた。揮発分1−プロパノール、2−ブタノン、ベンゾフェノン、エタノール、および酢酸メチルチオールは下水中にのみ富化され、2,3−ペンタンジオンは唾液中に富化された。重水素は、唾液または下水サンプルのいずれかから揮発性酢酸、ベンズアルデヒド、4-メチルジメチルトリスルフィド、およびフェノールに取り込まれた。酢酸、三硫化ジメチル、アセトン、およびプロパノール2-メチルは、培養喀痰サンプルよりも培養喀痰サンプル中に多く含まれていた。変異体であるPERMANOVAの順列多変量解析を、嚢胞性線維症喀痰サンプルからの揮発性存在量のBray-Curtis距離行列について実施した。サンプルを寄贈した被験者は、13C標識培養喀痰の変動の51%、未培養喀痰の変動の33%を説明していることがわかりました。ここでは、嚢胞性線維症を有する7人から採取した培養喀痰試料からの揮発分中の13Cグルコースによる安定同位体標識の成功が示される。大多数のサンプルについてより高い13Cの取り込みを有する揮発性物質をパネル5Aに示し、大多数の喀痰サンプルにおいてより低いパーセントの13Cの取り込みを有するものをパネル5Bに示し、そして少数の喀痰サンプルにおいてより低い13Cパーセントの変換を有する分子をパネル5Cに示す。常に約1分後にバイアルの圧力を再確認してください。真空が壊れると、VASE法の感度と速度が損なわれます。この手順に続いて、安定同位体プロービングが実施された場合、残りの材料からDNAを抽出して、揮発性分子の産生に寄与した可能性のある微生物生物または種を同定することができる。この方法は、同位体プロービングなしで任意のサンプルタイプから揮発性物質を検出する場合にも有用である。感度とサンプル量が少ないという利点により、多くのアプリケーションがこの手法の恩恵を受けることができます。

capturing-actively-produced-microbial-volatile-organic-compounds-from

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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真空支援吸着剤抽出によるヒト関連サンプルからの活発に生産された微生物揮発性有機化合物の捕捉

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