Name: インフルエンザ菌に対する呼吸器免疫応答の評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: 学ぶ インフルエンザ菌に対する呼吸器免疫応答の評価法。フローサイトメトリーと共焦点顕微鏡を用いて、貪食作用やサイトカイン産生、プロテアーゼ活性を解析し、COPDや肺炎などの慢性肺疾患における免疫機構を解明する。

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著者らは、この作業を支援してくれたMonash Healthの臨床免疫学のスタッフに感謝したいと思います。

<ol><li>Smith-Vaughan, H. C., Sriprakash, K. S., Leach, A. J., Mathews, J. D., Kemp, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+genetic+diversity+of+Haemophilus+influenzae+type+b+compared+to+nonencapsulated+H.+influenzae+in+a+population+in+which+H.+influenzae+is+highly+endemic%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Low genetic diversity of Haemophilus influenzae type b compared to nonencapsulated H. influenzae in a population in which H. influenzae is highly endemic.</a> Infection and Immunity. 66, 3403-3409 (1998).</li>
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<li>Cheng, O. Z., Palaniyar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NET+balancing%3A+a+problem+in+inflammatory+lung+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">NET balancing: a problem in inflammatory lung diseases.</a> Frontiers in Immunology. 4, 1(2013).</li>
<li>Jacobs, D. M., Ochs-Balcom, H. M., Zhao, J., Murphy, T. F., Sethi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lower+airway+bacterial+colonization+patterns+and+species-specific+interactions+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Lower airway bacterial colonization patterns and species-specific interactions in chronic obstructive pulmonary disease.</a> Journal of Clinical Microbiology. 56, (2018).</li>
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<li>King, P. T., Ngui, J., Gunawardena, D., Holmes, P. W., Farmer, M. W., Holdsworth, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+humoral+immunity+to+non-typeable+Haemophilus+influenzae%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Immunology%22%5BJournal%5D)">Systemic humoral immunity to non-typeable Haemophilus influenzae.</a> Clinical & Experimental Immunology. 153, 376-384 (2008).</li>
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<li>Tsujikawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+cell+detection+and+segmentation+for+image+cytometry+reveal+th17+cell+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Robust cell detection and segmentation for image cytometry reveal th17 cell heterogeneity.</a> Cytometry A. 95, 389-398 (2019).</li>
<li>Sharma, R., O'Sullivan, K. M., Holdsworth, S. R., Bardin, P. G., King, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+macrophage+extracellular+traps+using+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Visualizing macrophage extracellular traps using confocal microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e56459(2017).</li>
<li>Stiefel, P., Schmidt-Emrich, S., Maniura-Weber, K., Ren, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+aspects+of+using+bacterial+cell+viability+assays+with+the+fluorophores+SYTO9+and+propidium+iodide%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide.</a> BMC Microbiology. 15, 36(2015).</li>
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<li>Essilfie, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+Haemophilus+influenzae+respiratory+infection+and+allergic+airways+disease+drives+chronic+infection+and+features+of+neutrophilic+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Combined Haemophilus influenzae respiratory infection and allergic airways disease drives chronic infection and features of neutrophilic asthma.</a> Thorax. 67, 588-599 (2012).</li>
<li>Huvenne, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exacerbation+of+cigarette+smoke-induced+pulmonary+inflammation+by+Staphylococcus+aureus+enterotoxin+B+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Respiratory+Research%22%5BJournal%5D)">Exacerbation of cigarette smoke-induced pulmonary inflammation by Staphylococcus aureus enterotoxin B in mice.</a> Respiratory Research. 12, 69(2011).</li>
<li>Radhakrishna, N., Farmer, M., Steinfort, D. P., King, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comparison+of+Techniques+for+Optimal+Performance+of+Bronchoalveolar+Lavage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bronchology+%26+Interventional+Pulmonology%22%5BJournal%5D)">A Comparison of Techniques for Optimal Performance of Bronchoalveolar Lavage.</a> Journal of Bronchology & Interventional Pulmonology. 22, 300-305 (2015).</li>
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<li>Yu, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+the+comprehensive+flow+cytometric+analysis+of+immune+cells+in+normal+and+inflamed+murine+non-lymphoid+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues.</a> PLoS One. 11, 0150606(2016).</li>
<li>Duan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+macrophage+subpopulations+characterize+acute+infection+and+chronic+inflammatory+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Distinct macrophage subpopulations characterize acute infection and chronic inflammatory lung disease.</a> Journal of Immunology. 189, 946-955 (2012).</li>
</ol>

著者は開示するものは何もありません。

ここにリストされている方法は、Hiに対する炎症性肺応答に関する詳細な情報を得るために併用することができる蛍光ベースのフローサイトメトリーおよび共焦点顕微鏡技術を使用する。
使用するHiの適切な抗原製剤を確立することは重要であり、この点に関して微生物学者から特定の意見を得ることをお勧めします。Live Hiはより強い反応を誘発しますが、殺されたHi製剤とHiコンポーネントはより標準化されており、保管が容易です。PIは死んだバクテリア22にのみラベルを付けます。カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル(CFSE)などの他の色素を使用して、食作用アッセイ23の生細菌を標識することができます。適切な抗原を最適化するために、一連の予備実験を実施する必要があります。ライブ NTHi を使用する場合は、100:1 の MOI が最適です。低いMOIは明確な免疫応答を誘導しない可能性がありますが、より高いMOIは細胞に有毒である可能性があります。しかしながら、用量反応曲線は、有用な情報を与え得、...

インフルエンザ菌 (Hi)は、ほとんどの健康な成人の咽頭に存在する正常な共生細菌です。Hiは、多糖カプセル(タイプA〜F、例えばタイプBまたはHiB)を有するか、またはカプセルを欠いており、タイプ不可能(NTHi)1である。この細菌による粘膜のコロニー形成は幼児期に始まり、異なるコロニー形成株の代謝回転があります2。この細菌はまた、上気道と下気道の両方に侵入することができます。これに関連して、免疫応答および炎症の活性化を誘導し得る3、4。この炎症反応は臨床疾患を引き起こし、副鼻腔炎、中耳炎、気管支炎、嚢胞性線維症、肺炎、慢性閉塞性肺疾患(COPD)など、さまざまな重要な呼吸器疾患の一因となる可能性があります。これらの状態のほとんどは、NTHi株2によるものです。この記事では、フローサイトメトリーと共焦点顕微鏡を使用してHiに対する呼吸免疫応答を評価する方法について説明します。
以下に記載される方法は、Hiに対する炎症反応を評価するために改変された十分に確立された技術から適応されている。Hiの適切な抗原形態の選択は、この評価の重要な部分です。抗原製剤は、細胞壁成分から生きた細菌まで多岐にわたります。アッセイを確立して標準化するために、末梢血サンプルの使用は最初は非常に役立つかもしれません。
フローサイトメトリーは、細胞レベルで1つのサンプルからさまざまなパラメータと機能アッセイの測定を可能にします。この技術は、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)またはELISspotなどの他のより一般的な方法と比較した場合に、特定の細胞応答(例えば、活性酸素種(ROS)の産生または細胞内サイトカイン産生)を評価できるという利点を有する。
細胞外トラップは、好中球(NET)5,6,7およびマクロファージ(MET)などの他の細胞によって発現されます8。それらは、特に肺9の感染症において、重要な炎症反応としてますます認識されています。それらは共焦点蛍光顕微鏡によって評価され得る。この手法により、NET/METの決定的な同定が可能になり、その発現が他の形態の細胞死と区別されます6。
フローサイトメトリーと共焦点顕微鏡はどちらも蛍光ベースのアッセイです。それらの成功は、生物学的サンプルの最適なひずみプロトコルに依存しています。これらの方法は学習に時間がかかり、適切な監督の専門知識が必要です。関連する機器は、購入と実行の両方に費用がかかります。それらの使用に最適な設定には、主要な大学と三次紹介病院が含まれます。
このプロトコルで使用される方法は、呼吸器疾患に関与する他の同様の生物(例えば、 Moxarella catarrhalis および 肺炎連鎖球菌)の研究に転用可能である。NTHiはまた、他の一般的な呼吸器細菌とも相互作用します10。

<table><tbody><tr><td>塩化アンモニウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>213330</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B6542</td><td></td></tr><tr><td>CD28</td><td>サーモフィッシャー</td><td>16-0289-81</td><td></td></tr><tr><td>CD49d</td><td>サーモフィッシャー</td><td>534048</td><td></td></tr><tr><td>DAPI 長持ち金</td><td>サーモフィッシャー</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>DHR123</td><td>Σ Aldrich</td><td>109244-58-8</td><td></td></tr><tr><td>Filcon滅菌ナイロンメッシュ</td><td>ベクトンディキンソン</td><td>340606</td><td></td></tr><tr><td>ゼラチン基質、Enzchek</td><td>分子プローブ</td><td>E12055</td><td></td></tr><tr><td>MACSミックスチューブ回転子</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-753</td><td></td></tr><tr><td>Medimachine</td><td>ベクトンディキンソン</td><td></td><td>カタログ番号は利用できません</td></tr><tr><td>Medicons 50 & micro;m</td><td>ベクトン ディキンソン</td><td>340592</td><td></td></tr><tr><td>パンソービン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>507858</td><td></td></tr><tr><td>ヨウ化プロピジウム</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>サポニン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>8047152</td><td></td></tr><tr><td>スーパーフロスト スライド</td><td>サーモフィッシャー</td><td>11562203</td><td></td></tr></tbody></table>

インフルエンザ菌に対する呼吸器免疫応答の評価

Assessing Respiratory Immune Responses to Haemophilus Influenzae

インフルエンザ菌 (Hi)は、さまざまな呼吸器疾患に見られる一般的な細菌です。この細菌に対する呼吸器免疫/炎症反応を評価するために、さまざまな異なるアッセイ/技術を使用できます。フローサイトメトリーと共焦点顕微鏡は、生物学的反応の詳細な特性評価を可能にする蛍光ベースの技術です。細胞壁成分、死滅/不活化製剤、生菌など、さまざまな形態のHi抗原を使用できます。Hiは、濃縮培地を必要とする潔癖な細菌ですが、一般的に標準的な実験室の設定では増殖しやすいです。Hiによる刺激のための組織サンプルは、末梢血、気管支鏡検査、または切除された肺から得ることができる(例えば、肺癌の治療のための手術を受けている患者において)。マクロファージおよび好中球の機能は、食作用、活性酸素種、細胞内サイトカイン産生など、さまざまなパラメータを測定したフローサイトメトリーを使用して包括的に評価できます。リンパ球機能(例えば、T細胞およびNK細胞機能)は、主に細胞内サイトカイン産生について、フローサイトメトリーを用いて特異的に評価され得る。Hi感染は、好中球(NET)とマクロファージ(MET)の両方による細胞外トラップ産生の強力な誘導因子です。共焦点顕微鏡法は、NETおよびMET発現を評価するための最も最適な方法であり、プロテアーゼ活性の評価にも使用できます。 インフルエンザ 菌に対する肺免疫は、フローサイトメトリーと共焦点顕微鏡を使用して評価できます。

代表的な結果は、NTHiに対する炎症性免疫応答をフローサイトメトリーおよび共焦点顕微鏡によってどのように評価/定量できるかを示しています。結果の解釈の重要な部分は、対照サンプルと刺激サンプル間の蛍光の比較です。サンプルの染色を最適化するには、通常、いくつかの予備実験が必要です。同時に検査できる色の数は、フローサイトメーター/共焦点顕微鏡で利用可能なチャンネル数によって異なります。1)ROS産生、2)ヒト肺組織の細胞内サイトカイン染色、および3)肺タンパク質分解を測定するための in situ ザイモグラフィの評価の結果が示されています。
図1 は、単球によるROS産生の表現を示す。ROSの測定は、蛍光を生成するDHR123の酸化によるものです。細胞をゲートオンにし、蛍光の中央値をフローサイトメトリーで評価します。刺激されたサンプルの蛍光の中央値をコントロールと比較します。
図2 は、ヒト肺組...

インフルエンザ 菌は気道に炎症を誘発します。この記事では、フローサイトメトリーと共焦点顕微鏡を使用して、この細菌に応答する食細胞とリンパ球による免疫応答を定義することに焦点を当てます。

Haemophilus influenzae (Hi) is a prevalent bacterium found in a range of respiratory conditions. A variety of different assays/techniques may be used to ...

インフルエンザ菌は、COPDや肺炎などのさまざまな慢性肺疾患の炎症の主な原因です。このプロトコルは、肺の炎症に対するヘモフィルスの影響を評価する方法を説明しています。この技術の利点は、自然免疫応答と適応免疫応答の包括的な評価を可能にすることです。450マイクロリットルの末梢血と50マイクロリットルの活性化ヨウ化プロピジウム標識Hインフルエンザを5ミリリットルのチューブで摂氏37度のウォーターバスで20分間インキュベートします。サンプルを水浴から取り出し、5マイクロリットルのDHRとボルテックスを10秒間加えます。その後、さらに10分間水浴に戻します。サンプルを水浴から取り出した後、赤血球を5ミリリットルの0.8%塩化アンモニウム溶液で溶解し、本文に記載されているようにフローサイトメーターでサンプルを分析します。末梢血サンプルをコントロールと抗原刺激のためにアリコートに分割します。両方のサンプルに共刺激抗体を追加します。次に、非定型インフルエンザ菌を抗原サンプルに加え、摂氏37度、二酸化炭素5%で1時間インキュベートします。次に、ゴルジ系ブロッキング剤ブレフェルジンAをサンプルに加え、さらに5時間インキュベートします。前述のように赤血球を溶解した後、500マイクロリットルの1〜2%パラホルムアルデヒドを1時間使用して白血球を固定します。血球計算盤を使用して細胞をカウントし、100マイクロリットルの0.1%サポニンで15分間100万個の細胞を透過処理します。次に、細胞を適切な蛍光標識抗体でインキュベートします。細胞を洗浄し、フローサイトメーターを使用して分析します。関連するリンパ球集団を取得することにより、抗原応答細胞の割合を決定します。分析するすべてのサイトカインについて、非刺激細胞のバックグラウンド染色を実行します。約20〜40グラムの葉切除サンプルを3〜5立方ミリメートルのセクションにスライスします。それらを滅菌50マイクロリットルのチャンバー内に置き、適切なディスアグリゲーターを使用して組織を機械的に断片化します。組織脱凝集後、実証されたように赤血球を溶解し、細胞を滅菌RPMIに再懸濁します。次に、100マイクロメートルの滅菌ナイロンメッシュで細胞をろ過し、トリパンブルー排除法を使用して生細胞をカウントします。感染アッセイでは、肺細胞をRPMIで、チューブあたりミリリットルあたり400万個の最終濃度まで再懸濁します。次に、細胞あたり100細菌のMOIで細胞を感染させます。キャップを半回転緩めて、チューブ内のガス移動を可能にします。細胞をチューブローテーターに入れ、12RPMで回転させながら摂氏37度でインキュベートします。刺激の1時間後、サイトカインの細胞外輸送を防ぐためにグレフェルジンAを添加し、細胞懸濁液を回転しながらさらに16〜22時間インキュベートします。翌日、1%ウシ血清アルブミンと0.01%アジ化ナトリウムを含む500マイクロリットルのPBSで細胞懸濁液を洗浄します。次に、特定のヒトリンパ球細胞表面マーカーの細胞懸濁液を1時間染色する。次に、細胞をPBSで洗浄し、前に示したように固定して透過処理します。次に、細胞内サイトカイン染色抗体を用いて細胞を1時間インキュベートする。その後、細胞を洗浄し、フローサイトメーターでデータを取得する前に100マイクロリットルのPBSに再懸濁します。メタロプロテイナーゼの作用によりタンパク質分解を測定し、フルオレセイン標識ゼラチン基質を肺組織切片スライドに直接加えます。スライドを水平に置き、摂氏37度の光で保護された加湿チャンバーで1時間インキュベートします。ネガティブコントロールを調製するには、蛍光ゼラチンを含まない1つの反応バッファーを切片に追加し、さらに分析します。末梢血単核球を、食細胞集団を定義するために前方散乱および側方散乱を用いてゲーティングした。食細胞集団をさらに、単球を標識するためにCD14発現によって定義した。ROS測定は、蛍光を生成するためにDHR 123の酸化を介して実行されました。刺激されたサンプルの蛍光の中央値をコントロールと比較した。リンパ球による細胞内サイトカイン産生は、フローサイトメトリーを用いて測定した。細胞は、最初に白血球マーカーCD45の発現について分析され、次にCD3およびCD4、CD8について分析された。CD3枚、CD陽性細胞4枚を、コントロールおよび刺激試料における細胞内サイトカイン産生について評価した。プロテアーゼ活性は、未固定肺組織切片におけるNCツーザイモグラフィにより測定した。蛍光染色はMMP活性の存在を示し、これもクロマチンの発現と共局在した。肺組織サンプルに抗体を添加するには濃縮が必要であり、細胞の染色には予備実験での最適化が必要です。肺組織サンプルの上清は、ELISAなどの技術を用いて他の炎症メディエーターについてさらに分析することができ、これらの技術は、肺炎症に対する潜在的な治療法の効果を評価するために使用することができる。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

このビデオは、型指定不可能なインフルエンザ菌(NTHi)を介してリンパ球を刺激し、免疫応答を評価するin...

病原菌を介してリンパ球を刺激するIn Vitro技術

このビデオは、ヒトの肺組織由来免疫細胞をインフルエンザ菌とインキュベートすることにより、感染中の炎症メディエーターの定量化を示しています。フローサイトメトリーは、標識リンパ球のサイトカイン蛍光を測定するために使用され、細菌感染に応答した炎症誘発性サイトカインの産生と相関します。...

感染したヒト組織由来細胞における炎症性メディエーターの定量化

このビデオは、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)に対する中和抗体を測定するためのアッセイを示しています。RSV中和抗体を含む血清とプレインキュベートすると、ウイルス粒子が中和され、細胞感染とプラーク形成が減少します。次に、ウイルスに感染した細胞を固定、ブロッキング、およびフルオロフォア標識抗体標識してプラークを可視化します。このプロセスにより、RSV の 50% を中和する最も高い血清希釈液 (中和力価を表す)...

呼吸器合胞体ウイルスに特異的な中和抗体価を測定するためのアッセイ

ヒト呼吸器合胞体ウイルス(HRSV)は、幼児に重度の細気管支炎を引き起こす可能性があります。重度のHRSV疾患の病因の一部は、宿主の免疫応答によって引き起こされます。HRSVによるヒト初代免疫細胞の刺激は、炎症経路と感染の活性化を研究するための迅速で再現性の高いモデルシステムを提供します。...

ヒト呼吸器合胞体ウイルス感染に対するヒト末梢血単核細胞の免疫応答を研究するためのインビトロモデル

マウスの下気道へのインフルエンザ菌の気管内接種手順を実演します。これは、マウスモデルで気道の炎症を調節するシグナル伝達経路を研究するための非常に有用なツールです。...

の気管内の管理<em&gt;インフルエンザ菌</em&gt;マウスモデルにおいて気道炎症を研究します

このプロトコルでは、上気道から邪魔されず粘膜被覆液のサンプリングのための非侵襲的技術について説明します。それは、すべての年齢層の被験者でタンパク質メディエーター、サイトカイン、ケモカインなどの生体内レベルの定量化を実行する使用できます。...

体内上部気道免疫メディエーター レベルの定量化のための粘膜内層流体の非侵襲的サンプリング

示されたプロトコルでは、インフルエンザ ワクチン接種者の血清サンプルからインフルエンザ特異抗体価を定量化する赤血球凝集抑制法を実行する方法について説明します。最初のアッセイは、凝集によって最適なウイルス抗原濃度を決定します。2 番目の分析は,...

インフルエンザ特異抗体価を定量化する最適化された赤血球凝集抑制 (HI) 試験

インフルエンザ ウイルスのヘマグルチニンを対象とする抗体による Fc を介したエフェクターの機能の活性化を測定する手法を提案します。この試金は、Fc...

インフルエンザ血球凝集素抗体による Fc を介したエフェクター機能を評価する方法

本稿の目的は、二重チャンバー容積脈波による意識下マウスにおける呼吸機能を評価するための推奨される手順の詳細な説明を提供するためにです。...

ダブル室容積脈波による意識下マウスにおける呼吸機能の評価

ここで生体内でワクチンの評価のためのエレガントなプロトコルの有効性と宿主免疫応答を提示します。このプロトコルは、ウイルス、細菌、ワクチンのモデルまたは寄生病原体に対する適応ことができます。...

宿主-病原体応答とマウスでワクチンの有効性の評価

このプロトコルは、ウイルス感染した鼻上皮細胞と先天性細胞活性化との間の初期の相互作用の調査を詳述する。免疫細胞の個々のサブセットは、ウイルス感染に応答したそれらの活性化に基づいて区別することができる。その後、それらをさらに調査して、早期の抗ウイルス反応に対するそれらの効果を決定することができる。...

呼吸器ウイルス感染時の自然免疫細胞活性化研究のための非接触共培養モデル

学ぶ インフルエンザ菌に対する呼吸器免疫応答の評価法。フローサイトメトリーと共焦点顕微鏡を用いて、貪食作用やサイトカイン産生、プロテアーゼ活性を解析し、COPDや肺炎などの慢性肺疾患における免疫機構を解明する。

インフルエンザ菌に対する呼吸器免疫応答の評価

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