アノフェレスガンビア胚の微小注入法
2021年7月7日
蚊のゲノムに外因性遺伝子を導入するには、マイクロインジェクション技術が不可欠です。このプロトコルは、変換された蚊を生成するために アノフェレスガンビア 胚にDNA構築物をマイクロ注入するためにジェームズ研究所によって使用される方法を説明します。
このプロトコルは、一般的な遺伝子工学技術を使用して変換することが歴史的に困難であったアノフェレスガンビアに特異的なマイクロインジェクション方法を提供するため、重要です。この技術の主な利点は、トランスジェニックアノフェレスガンビアを確実に作成する点です。この技術の応用は、集団の抑制や野生型アノフェレスガンビア集団の改変に適した蚊の作成を促進することにより、マラリア撲滅のための新しい戦略にまで及ぶ。
この方法論は、異なる蚊種に容易に適応することができる。マイクロインジェクション技術は、忍耐と実践を必要とします。学習曲線があります。
まず、吸引器を使用して、透明な50ミリリットルの円錐管に20〜30匹のメスを入れる。チューブが両端で切り開き、一方の端にラテックス歯科フィルム、もう一方の端にナイロンメッシュとフィルターペーパーで覆われ、蚊が卵を産みます。蚊で満たされたチューブを二重蒸留水で満たされた小さなペトリ皿に入れ、チューブと皿を28°Cのインキュベーターに45分間置きます。
チューブをインキュベーターから取り出し、チューブを空のケージに挿入します。チューブを軽くたたいて、蚊が飛び出します。すべての蚊が飛び出したら、ケージからチューブを取り外します。
チューブに蚊が含まれず、下のリングを緩め、ナイロンを取り外し、鉗子を使用して卵をチューブから慎重に取り除きます。卵を含んだろ過紙を水で湿らせたろん紙の層を含むプラスチックペトリ皿に入れます。きれいなガラススライドに膜を置き、きれいな鉗子を使用して膜をフィルターペーパーで覆い、約1ミリメートルの膜フィルターを覆い残します。
フィルターペーパーを脱イオン水で濡らし、ブラシを使用して30〜50個の胚を膜の端にそっと移し、卵を膜に沿って垂直に整列させます。卵がマイクロインジェクション顕微鏡で観察されるとき、後端が下の位置にあり、針で15度の角度を形成するように、卵を同じ方向に向けます。膜の縁全体を卵で並べます。
マイクロローダーチップを使用して、2マイクロリットルのDNA混合物で針を充填します。針ホルダーに針を差し込み、自動圧力ポンプチューブを接続します。針をスライドの平面に合わせて 15 度の角度になるように調整します。
最初の卵に注意して針先を開き、針の先端を後極に約10マイクロメートルに挿入します。注射が成功すると、卵の中の細胞質の小さな動きにつながります。顕微鏡同軸ステージコントロールを使用して、次の卵に移動して注入を継続します。
針先が開いたままで詰まっていないようにするには、別の胚に入る前に[注射]ボタンを押して、針の開口部にある小さな液滴を視覚化します。針が詰まったら、[クリア]ボタンを押して針をクリアし、液滴の可視化テストを繰り返します。針先の開口部が少し大きくなる場合は、必要に応じて圧力を調整し、液滴のサイズが小さく保たれるようにします。
1針で約40~50個の卵を注入します。注射が完了したら、フィルターペーパーが並び、50ミリリットルの脱イオン水で満たされたガラス容器に卵をすすぐ。このプロトコルを用いて、アノフェレスガンビアの実験室株G3の生殖細胞系列に自律遺伝子駆動系を挿入した。
このシステムは、この種の第3染色体の枢機卿オルソログ(Agcd)を標的とするように設計された。プラスミドpCO37を示す。これは、ナノ遺伝子オルソログの調節要素の制御下にレンサ球菌のpyogenesCas9エンドヌクレアーゼが含まれています。
さらに、U6遺伝子プロモーターの制御下にガイドRNAとシアン蛍光タンパク質を発現する3XP3 CFPのCFP優位マーカーカセットを有する。分子アプローチは、AgNosCd-1と指定された約10キロの塩基対DNAの正確な挿入を検証した。広範なフォローアップ分析は、AgNosCd-1が駆動において非常に効率的であり、抵抗性対立遺伝子をほとんど作り出さなかったこと、および遺伝子駆動系の統合および発現のために大きな遺伝的負荷を持たなかったことを示した。
蚊を含むホモ接合遺伝子ドライブは機能喪失変異体であり、幼虫、子犬、および赤目表現型を有する新たに出現した成人であった。このプロトコルを試みるとき、88で保つことは、灰色の卵を明るくし、白い卵を避けるために良い孵化のために重要です。
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概要
このプロトコルは、アノフェレス・ガンビアエ蚊の胚に外来遺伝子を導入するためのマイクロインジェクション技術を概説し、形質転換蚊の生成を促進します。この方法は、従来の遺伝子工学アプローチを用いてこの種を形質転換させる歴史的な課題に対処します。
主要な研究要素
科学の分野
- 遺伝子工学
- 昆虫学
- 媒介者制御
背景
- アノフェレス・ガンビアエは主要なマラリア媒介蚊です。
- この種の形質転換は標準的な技術では困難でした。
- マイクロインジェクションは形質転換蚊を作成するための信頼できる方法を提供します。
- この技術は他の蚊の種にも適応可能です。
研究の目的
- アノフェレス・ガンビアエのための特定のマイクロインジェクションプロトコルを作成すること。
- マラリア制御のための遺伝子組み換え蚊の作成を可能にすること。
- 研究分野の研究者に信頼できる方法を提供すること。
使用された方法
- 胚へのDNAコンストラクトのマイクロインジェクション。
- ジェームズ研究所によって開発された特定の技術の使用。
- 異なる蚊の種への方法の適応。
- 技術の習得のための訓練と練習。
主要な結果
- アノフェレス・ガンビアエの形質転換の成功した生成。
- マイクロインジェクション方法の信頼性の実証。
- マラリア撲滅戦略への潜在的な応用。
- 野生型蚊の個体群の修正の促進。
結論
- マイクロインジェクション技術は遺伝子の導入に効果的です。
- この方法は媒介者制御研究に大きく貢献できます。
- さらなる研究で他の種への応用を探ることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Microinjection of Anopheles gambiae embryos enables stable germline transformation, addressing a longstanding bottleneck in vector control research. This technique supports the development of gene drive systems for malaria elimination by facilitating heritable genetic modifications in a key disease vector. Reliable embryo injection enhances predictive confidence in target validation and preclinical modeling of transmission-interrupting strategies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional interrogation of genes involved in blood-feeding, immunity, and olfaction through stable transgene expression.
- Operational Value: Provides a reproducible method to generate transgenic lines for target de-risking in vector-borne disease programs.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Creates standardized transgenic mosquito strains for phenotypic screening of antiparasitic or transmission-blocking compounds.
- Operational Value: Supports assay readiness by delivering consistent genetic backgrounds for high-throughput evaluation of gene drive efficacy.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enables evaluation of gene drive performance, resistance allele formation, and genetic load in controlled laboratory settings prior to field trials.
- Operational Value: Facilitates preclinical validation of transmission-reducing traits in Anopheles gambiae strains under standardized insectary conditions.
Pipeline & Workflow Integration
The microinjection method fits within the discovery-to-preclinical continuum by enabling target validation, strain generation, and functional assessment of genetic interventions for malaria control.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of gene function in pathogen transmission and host-seeking behaviors via germline transformation.
- Screening: Generates isogenic transgenic lines for reproducible evaluation of gene drive components and effector genes.
- Analytics: Enables quantitative measurement of transgene expression, drive efficiency, and phenotypic outcomes such as eye color or fertility.
- Translational Research: Connects molecular constructs to organismal phenotypes in a disease-relevant system for risk-adjusted advancement decisions.
- Enterprise Reuse: Establishes a platform technology adaptable across mosquito species for sustained vector control pipeline support.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through heritable gene expression and phenotypic readouts.
- Operational Value: Standardized embryo handling and injection protocols improve reproducibility across laboratories.
- Strategic Value: Reduces biological risk in late-stage vector control programs by enabling early assessment of gene drive properties.
- Portfolio Impact: Informs go/no-go decisions based on drive efficiency, resistance profiles, and fitness costs in transgenic strains.
Implementation Considerations
- Expertise in mosquito embryology and microinjection instrumentation is required for successful embryo manipulation.
- Access to microinjection systems, pressure pumps, and microscopy setups with coaxial stage controls is essential.
- Standardization of embryo alignment, needle angle, and injection volume across teams ensures consistent transgenic outcomes.
- Adaptation to other mosquito species may require optimization of incubation timing, embryo staging, and membrane preparation.
- Success depends on user proficiency due to the technical learning curve inherent in delicate embryo handling.
