Name: 哺乳類細胞におけるエンドサイトリサイクルを調べた密度勾配超遠心分離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-30T13:15:00.000+00:00
Duration: 5 min 13 s
Description: 学ぶ 哺乳類細胞からのリサイクリングエンドソーム分離法。密度勾配超遠心分離を用いてエンドサイトーシス経由のタンパク質輸送を調査する信頼性の高いプロトコルです。組織と細胞サンプルの両方に適用可能です。

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この研究は、研究助成金評議会香港、CUHK直接助成金制度、ユナイテッド・カレッジ・エンダウメント・ファンド、TUYF慈善信託からの資金によって支えられました。この研究の数字は、2020年10月にFASEBジャーナルに掲載された「ARF6-Rac1シグナル伝達性神経突起伸長は、ARF6とELMO1のオーケストレーションを通じてニューロンアダプタFE65によって増強される」と述べた。

哺乳類細胞培養とトランスフェクション
<ol><li>100mm培養皿に2 x106 細胞をプレート。トランスフェクションごとに4つの料理を使用してください。 注: 必要なセルの数は、セルの行によって異なる場合があります。分離の手順に進む前に最適化が必要な場合があります。</li>
	<li>翌日, メーカーの指示に従ってリポフェクタミンで細胞をトランスフェクト.</li>
</ol>2. 細胞の収穫
<ol><li>培養後48時間の培養培地を廃棄する。</li>
	<li>氷冷PBS(10 mMリン酸ナトリウム、2.68mM塩化カリウム、140mM塩化ナトリウム)で細胞を2回洗浄します。</li>
	<li>1 mLの氷冷PBS+(0.5xプロテアーゼ阻害剤カクテルと0.5xホスファターゼ阻害剤カクテルを加えたPBS)を各料理に加えます。</li>
	<li>細胞スクレーパーで細胞を収集し、細胞懸濁液を15 mL遠心分離管に移します。</li>
	<li>400xgで5分間スイングバケットローターを用いて遠心分離により細胞をペレット化した。</li>
	<li>上澄み液を捨て、細胞ペレットを5mLの均質化バッファー(HB;250 mMスクロース、pH 7.4で3mMイミダゾール、0.03 mMシクロヘキシミド、1xプロテアーゼ阻害剤、1xホスファターゼカクテル阻害剤を添加した1 mM EDTA)で穏やかに再懸濁します。</li>
	<li>10分間1,300xgで遠心分離して細胞を回収します。</li>
	<li>HBの1 mLで細胞ペレットを再懸濁する。</li>
	<li>15-20ストロークのためのDounceホモジナイザーで細胞を均質化します。 注: 他のホモジナイゼーション方法(例えば、サンプルを注射器を通す)を使用することができます。均質化効率は、相コントラスト顕微鏡下でホモゲン酸を観察することによって明らかにすることができる。</li>
	<li>ホモゲン酸を2 mL遠心チューブに移します。 注:5xサンプルバッファーの12.5 μLで50μLのホモゲン酸を収穫し、トータルリセートとしてラベル付けしてください。</li>
	<li>0.7 mLのHBをホモジネートに加えます。</li>
	<li>希釈したホモゲネートを2,000 x g で4°Cで10分間回転させます。 注:ペレットには核と切れ目のない細胞が含まれています。</li>
	<li>上清の1.5mLを収集し、ステップ2.12を一度繰り返します。</li>
	<li>上清の1.4mLを収集し、ポスト核上清(PNS)としてラベル付けします。</li>
</ol>3. 密度勾配カラムの準備
<ol><li>1.2 mLのPNSを超遠心チューブに移します。</li>
	<li>サンプルに62%スクロース溶液(2.351 Mショ糖、pH 7.4で3 mMイミダゾール)の1 mLを加え、穏やかなピペットでよく混ぜます。 注:結果として得られたソリューションは40.6%のスクロース溶液です。</li>
	<li>サンプルの上に3.3 mLの35%スクロース溶液(1.177 Mスクロース、pH 7.4で3 mMイミダゾール)を慎重に加えます。</li>
	<li>25%スクロース溶液(0.806 Mショ糖、pH 7.4で3 mMイミダゾール)の2.2 mLを慎重に加え、35%スクロース溶液の上に添加します。 注:室温での62%、40.6%、35%、および25%のスクロース溶液の屈折率は、それぞれ1.44、1.40、1.39、1.37です。スクロース溶液の屈折率は、実験の精度と一貫性を確保するために、屈折計で確認することができます。</li>
	<li>超遠心チューブをHBで満たします。 注:準備された密度勾配列を4°Cに一時的に保管してください。</li>
</ol>4. 分画と循環性の分画の回収
<ol><li>4°Cで3時間210,000 x g でカラムを遠心分離します。</li>
	<li>12 分の部分 (それぞれ 1 mL) を慎重に収集し、グラデーションの上から開始します。 注:リサイクル内生は、35%から25%のスクロースソリューションの間のインターフェースで見つけられる必要があります。回収された分率は液体窒素でスナップ凍結し、-80°Cで保存することができる。</li>
	<li>希釈バッファーの 1 mL ですべての分画を希釈します (3 mM イミダゾール pH 7.4, 1 mM EDTA)。</li>
	<li>4°Cで1時間100,000xgで希釈したサンプルを遠心分離する。</li>
	<li>上清を吸引し、50 μLの1xサンプルバッファーを加え、分画を収穫します。</li>
	<li>分画中のタンパク質内容物をウェスタンブロッティングで分析します。</li>
</ol>

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</ol>

著者らは、この記事の内容と利益相反はないと宣言している。

上記のプロトコルは、超遠心分離によって培養細胞から培養された細胞から循環性の内生体を単離するための手順を概説する。この方法の信頼性は最新の刊行22によって実証されており、リサイクル用のエンドーソームがゴルジ装置やミトコンドリアなどの他のオルガネラ(図1)から正常に分離されていることを証明している。いくつかの重要なステップは、良好な分離結果を得るために注意する必要があります。スクロース溶液を調製する間、屈折計で溶液の屈折率を検証することが推奨されます。室温での62%、35%、および25%のスクロース溶液の屈折率は、それぞれ1.44、1.39、および1.37である。また、気泡は勾配から避けるべきです。列に気泡が存在すると、グラデーションの連続性が崩る可能性があります。洗剤はオルガネラの膜に損傷を与えるので、均質化プロセスでは避けるべきです。これは、膜結合型小器官からのタンパク質の放出につながり、重度の汚染をもたらす可能性があります。また、均質化中のタンパク質分解を避けるために、使用前にすべての均質化ツールを事前に冷却する必要があります...

内経性の人身売買は、様々な生物学的事象1、例えば、シグナル伝達受容体、イオンチャネル、および接着分子の輸送を含む必須の生理学的プロセスである。血漿膜に局在するタンパク質は、エンドサイトーシス2によって内在化される。その後、内部化されたタンパク質は初期の内期3によってソートされる。タンパク質の一部は分解のためにリソソームを標的としている。しかし、大量のタンパク質は、高速リサイクルと低速リサイクルプロセスによって細胞表面にリサイクルされます。高速リサイクルでは、タンパク質は初期の子宮体を離れ、原形質膜に直接戻ります。逆に、遅いリサイクルでは、タンパク質はまずエンドサイトリサイクルコンパートメントに分類され、次に形質膜に戻されます。種々のカーゴタンパク質は、例えば、クラトリン、レトロマー複合体、レトリバー複合体及びウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質、及びSCARホモローグ(WASH)複合体、4、5、6、7、8、9等の膜リサイクルプロセスに関与する。エンドサイトーシスとリサイクルイベントのバランスは、細胞の生存に不可欠であり、例えば、細胞接着、細胞移動、細胞極性、およびシグナル伝達などの様々な細胞事象10に寄与する。
ARF6は、小さなGTPaseで、内視鏡7、11、12の報告されたレギュレータです。関心のある研究グループは、内視鏡リサイクルにおけるARF6の重要性を図示しています13,14,15,16, 17.この研究は、ARF6媒介性神経突起成長とエンドサイトリサイクルとの関係を調査することを目的としている。前の報告は、ARF6の活性化がサイトカネシス1(DOCK180)複合体18のELMO1-ディディケーターに作用してRac1活性に上流であることを示唆している。しかし、ARF6がどのようにELMO1-DOCK180仲介Rac1シグナリングを引き起こすかは不明です。このような過程におけるARF6媒介型エントサイトリサイクルの役割を調査するために、密度勾配超遠心分離が採用された。それを用いることによって、細胞ライセート19から循環性のendosome含有分率が得られた。分画を、タンパク質含量分析用のウェスタンブロッティングを行った。免疫ブロットの結果は、脳に富んだアダプタータンパク質であるFE65の存在下で、活性ARF6が、エンドーソーム含有分率のリサイクルにおけるELMO1のレベルを実質的に増加させたことを明らかにした。以下のプロトコルには、(1)哺乳類細胞をトランスフェクトするための手順が含まれています。(2) サンプルと密度勾配列の準備(3)循環性のendosome含有分率を得る。

<table><tbody><tr><td>1 mL、オープントップ厚壁ポリプロピレンチューブ、11 x 34 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>347287</td><td></td></tr><tr><td>100 mm tissue culture dish</td><td>SPL</td><td>20100</td><td></td></tr><tr><td>13.2 mL、認定フリーオープントップ薄壁ウルトラクリアチューブ、14 x 89 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>C14277</td><td></td></tr><tr><td>5x Sample Buffer</td><td>GenScript</td><td>MB01015</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete、EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>COX IV (3E11) Rabbit mAb</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>4850S</td><td>COX IVを検出するためのウサギモノクローナル抗体。</td></tr><tr><td>シクロヘキシミド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1988</td><td></td></tr><tr><td>Dounce Tissue Grinder, 7 mL</td><td>DWK Life Sciences</td><td>357542</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with low glucose</td><td>HyClone</td><td>SH30021.01</td><td></td></tr><tr><td>ELMO1 antibody (B-7)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-271519</td><td>ELMO1 を検出するためのマウスモノクローナル抗体。</td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>FE65 抗体 (E-20)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-19751</td><td>FE65 を検出するためのヤギポリクローナル抗体。</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, Research Grade</td><td>HyClone</td><td>SV30160.03</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH モノクローナル抗体 (6C5)</td><td>Ambion</td><td>AM4300</td><td>Mouse monoclonal antibody for detecting GAPDH.</td></tr><tr><td>ImageLab ソフトウェア</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>バンド強度の測定</td></tr><tr><td>イミダゾール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2399</td><td></td></tr><tr><td>リポフェクタミン 2000 トランスフェクション試薬</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>モノクローナル抗体 アンチベータ--COP 抗体</td><td>Sigma</td><td>G6160</td><td>マウスモノクローナル抗体 &beta;-COP.</td></tr><tr><td>Mycタグ (9B11) マウス mAb</td><td>細胞シグナル伝達技術</td><td>2276S</td><td>mycタグ付きタンパク質を検出するためのマウスモノクローナル抗体。</td></tr><tr><td>OmniPur EDTA、二ナトリウム塩、二水和物</td><td>Calbiochem</td><td>4010-OP</td><td></td></tr><tr><td>Optima L-100 XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>392050</td><td></td></tr><tr><td>Optima MAX-TL</td><td>Beckman Coulter</td><td>A95761</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Reduced Serum Media</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>PBS Tablets</td><td>Gibco</td><td>18912014</td><td></td></tr><tr><td>PhosSTOP</td><td>Roche</td><td></td><td></td>4906845001</tr><tr><td>RAB11A特異的ポリクローナル抗体</td><td>Proteintech</td><td>20229-1-AP</td><td>Rab11を検出するためのウサギポリクローナル抗体。</td></tr><tr><td>スクロー</td>ス<td>Affymetrix</td><td>AAJ21931A4</td><td></td></tr><tr><td>SW 41 Tiスイングバケットローター</td>ベ<td>ックマンコールター</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>TLA-120.2固定角ローター</td>ベ<td>ックマンコールター</td><td>362046</td><td></td></tr><tr><td>トリプシンEDTA(0.05%)、フェノールレッド</td><td>Gibco</td><td>25300062</td><td></td></tr></tbody></table>

哺乳類細胞におけるエンドサイトリサイクルを調べた密度勾配超遠心分離

Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells

内皮の人身売買は、生物学的事象の広い範囲を調節する不可欠な細胞プロセスです。タンパク質は、原形質膜から内在化し、初期の子宮間体に輸送されます。インターロナイズされたタンパク質は、分解のためにリソソームに通過したり、細胞膜にリサイクルすることができます。エンドサイトーシスからの膜材料の除去のバランスをとるためには、堅牢なエンドサイト循環型の循環経路が必要です。ADP-リボシル化因子6(ARF6)を含む様々なタンパク質が経路を調節すると報告されている。密度勾配超遠心分離は、細胞分画の古典的な方法である。遠心分離後、オルガネラはイソピクセンの表面で沈み込む。分数は収集され、他のダウンストリーム・アプリケーションに使用されます。ここで説明するプロトコルは、密度勾配超遠心分離を用いて、トランスフェクションされた哺乳動物細胞からendosome含有分率をリサイクルして得るプロトコルである。単離された分画を、それらのタンパク質内容物を分析するための標準的なウエスタンブロッティングを行った。この方法を用いることで、Ras関連C3ボツリヌス毒素基質1(Rac1)グアニンヌクレオチド交換因子である巻込みおよび細胞運動性1(ELMO1)の細胞膜ターゲティングが、ARF6媒介性エンドサイトリサイクルを介してであることを同定した。

非トランスフェクトされたHEK293細胞を密度勾配超遠心分離により分画した後、勾配の上から12個の画分を採取した。収穫された分率を希釈し、希釈バッファーを1:1比で希釈し、第2回遠心分離を行った。その後、サンプルを、タンパク質の内容物を分析するためのウェスタンブロットを行った。 図1に示すように、循環型の気になるマーカーRab11が分画720で検出される。β-COP、COX IV、GAPDH、EEA1、Rab7、およびLamp1を含む他の細胞下マーカーもプローブされた。正のEEA1信号も画分7でも検出されます。分画7およびPNSの両方のGAPDH、COX IV、およびRab11のバンド強度をImageLabソフトウェア(バイオ・ラッド)で測定した。分数7からPNSのマーカーの強度比を計算し、SD±棒グラフで表した。
これまでの研究では、ARF6とELMO1がFE65と相互作用して、Rac1媒介性神経突起の成長を促進</...

本論文は、ショ糖密度勾配超遠心化を用いて哺乳動物細胞からの子宮体をリサイクルする方法を提示することを目的とする。

Endosomal trafficking is an essential cellular process that regulates a broad range of biological events. Proteins are internalized from the plasma ...

このプロトコルは、感染した哺乳類細胞からの分画を含むリサイクルエンドソームを分離し、エンドサイト人身売買によるタンパク質の密売の調査を容易にするのに役立ちます。この技術は扱いやすく、組織および細胞サンプルの両方に適用可能である。この手順のデモンストレーションは、ラオス博士の研究室の博士課程の学生、ミス・ザイ・ユー・チーです。まず、100ミリメートル培養皿中の6細胞に2回10を10回プレートする。翌日, メーカーの指示に従ってリポフェクタミンで細胞をトランスフェクト.細胞を収穫するために、培養後48時間培養液を廃棄し、氷冷PBSで細胞を2回洗浄する。その後、各皿に0.5Xホスファターゼ阻害剤カクテルで0.5Xプロテアーゼ阻害剤カクテルを補った氷冷PBSの1ミリリットルを追加します。次に、細胞スクレーパーを用いて、細胞を回収し、細胞懸濁液を15ミリリットル遠心管に移す。スイングバケットローターを用いた遠心分離による細胞。上清を捨て、細胞ペレットを5ミリリットルの均質化バッファーに穏やかに再懸濁します。遠心分離によって細胞を再び収集し、均質化バッファーの1ミリリットルで細胞ペレットを再懸濁します。15~20ストロークを使用して、Dounceホモジナイザーで細胞を均質化します。次にホモゴネートを2ミリリットル遠心チューブに移します。ホモゴネートに700マイクロリットルの均質化バッファーを加えます。その後、希釈したホモゴネートを回転させ、上清の1.5ミリリットルを集める。収集した上清を再び回転させ、1.4ミリリットルの上清を集め、核後上清としてラベルを付けます。密度勾配カラムを作成するには、核後上清の1.2ミリリットルを超遠心チューブに移します。その後、サンプルに62%スクロース溶液の1ミリリットルを追加し、穏やかなピペットによってよく混ぜます。次に、サンプルの上に35%スクロース溶液の3.3ミリリットルを慎重に加え、35%スクロース溶液の上に2.2ミリリットルの25%スクロース溶液を加えます。最後に、超遠心チューブを均質化バッファーで上部に充填します。密度勾配列を遠心分離し、勾配の上から始めて、それぞれ12分の1ミリリットルを慎重に収集します。次に、希釈バッファーの1ミリリットルですべての分画を希釈し、希釈したサンプルを遠心分離します。遠心分離後、上清を吸引し、50マイクロリットルの1Xサンプルバッファーを加えて分画を収穫する。リサイクル内粉マーカーRab11は、フラクション7で検出された。他の細胞下マーカーは、ベータCOP、COX IV、GAPDH、EEA1、ラブ7、およびLamp1を含む、また、プローブされた。正のEEA1シグナルもFraction 7で検出されました。クオーター7とポスト核上清の両方でGAPDH、コックスIV、およびRab11の測定されたバンド強度をここに示します。ELMO1、ELMO1 ARF6Q67L、またはELMO1 ARF6Q67L FE65のいずれかを有するHEC293細胞を転移した後、ARF6Q67LおよびFE65過剰発現を有するELMO1分布に変化は見つからなかった。フラクション7のELMO1レベルを異なるトランスフェクション間で比較し、ARF6Q67Lのコトランスフェクション後に上昇することが判明した。ARF6Q67LとFE65の両方が共発現した場合、さらなる増加が認められた。逆に、FE65をノックアウトすると、ARF6仲介Elmo1エンリッチメントが分数7で減少しました。得られた分数は、その後の分析に使用することができます。例えば、分画中のタンパク質レベル変化を可視化するウェスタンブロッティング。

density-gradient-ultracentrifugation-for-investigating-endocytic

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

この記事では、真核細胞からリボソームを翻訳するの抽出のためのプロトコルについて説明します。解凍したら、リボソームが異なるリボソーム集団を分析できるようにショ糖密度勾配分画によってmonosomesとpolyribosomesに分かれています。このように、このメソッドは、翻訳の調節を調べるためのゴールドスタンダードです。...

真核生物のポリリボソームプロファイル解析

このビデオでは、グラジエント遠心分離を使用して単一核を単離するシンプルで効率的なプロトコルについて説明します。単離されたこれらの核は、シーケンシングやゲノム解析に使用できます。...

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このビデオは、特性評価研究に適した細胞外小胞の亜集団を分離するための密度勾配超遠心分離ベースの精製方法を示しています。...

細胞外小胞の亜集団の精製:密度勾配超遠心分離法を用いた細胞外小胞の亜集団の精製技術

ここでは、細胞膜、細胞質、高速遠心分離を使用せず U937...

高速遠心分離のない状態で U937 細胞のセル分別

この分画プロトコルにより、研究者は哺乳類細胞から細胞質、核、ミトコンドリア、および膜タンパク質を単離することができます。後者の2つの細胞内画分は、等密度密度勾配を介してさらに精製される。...

等密度勾配精製によるU937細胞の細胞分画

このプロトコルでは、マイコバクテリウム・スメグマティス(Msm)の軸種培養からの天然マイコバクテリア細胞外小胞(mEV)の濃縮と、mCherry(赤色蛍光レポーター)含有組換えMsmEVsの設計と濃縮方法について詳しく説明します。最後に、結核菌のEsxAタンパク質を含むMsmEVを濃縮することで、新しいアプローチを検証します。...

マイコバクテリアの天然および組換え細胞外小胞の濃縮

ミトコンドリアコンタクトサイトは、ミトコンドリアの内膜および外膜タンパク質と相互作用するタンパク質複合体です。これらの部位は、ミトコンドリア膜間のコミュニケーション、したがって細胞質とミトコンドリアマトリックスの間のコミュニケーションに不可欠です。ここでは、この特定のクラスのタンパク質に適格な候補を同定する方法について説明します。...

ミトコンドリア接触部位を単離するための改良された方法

本研究では、密度勾配遠心分離(DGC) により...

密度勾配遠心分離法を用いたヒト糞便からの細菌細胞外小胞の単離と精製(英語)

このプロトコルでは、密度勾配遠心分離を使用してHSDを給餌した塩分感受性ラットからの腸内微生物EVの分離について説明しています。EVは、ナノ粒子追跡、TEM、LPS/BCA アッセイ、および 16S rRNA シーケンシングによって特徴付けられ、サイズ、形態、組成、および微生物叢の起源を解析しました。...

高塩食条件下での塩分感受性ラットにおける腸内微生物細胞外小胞の分離と鑑別特性評価

このプロトコルは、高密度リポタンパク質の小さなRNAの単離と定量化を説明しています。...

非コード小型RNA定量化のための高密度リポタンパク質の単離

学ぶ 哺乳類細胞からのリサイクリングエンドソーム分離法。密度勾配超遠心分離を用いてエンドサイトーシス経由のタンパク質輸送を調査する信頼性の高いプロトコルです。組織と細胞サンプルの両方に適用可能です。

哺乳類細胞におけるエンドサイトリサイクルを調べた密度勾配超遠心分離

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