哺乳類細胞におけるエンドサイトリサイクルを調べた密度勾配超遠心分離
2021年6月30日
本論文は、ショ糖密度勾配超遠心化を用いて哺乳動物細胞からの子宮体をリサイクルする方法を提示することを目的とする。
このプロトコルは、感染した哺乳類細胞からの分画を含むリサイクルエンドソームを分離し、エンドサイト人身売買によるタンパク質の密売の調査を容易にするのに役立ちます。この技術は扱いやすく、組織および細胞サンプルの両方に適用可能である。この手順のデモンストレーションは、ラオス博士の研究室の博士課程の学生、ミス・ザイ・ユー・チーです。
まず、100ミリメートル培養皿中の6細胞に2回10を10回プレートする。翌日, メーカーの指示に従ってリポフェクタミンで細胞をトランスフェクト.細胞を収穫するために、培養後48時間培養液を廃棄し、氷冷PBSで細胞を2回洗浄する。
その後、各皿に0.5Xホスファターゼ阻害剤カクテルで0.5Xプロテアーゼ阻害剤カクテルを補った氷冷PBSの1ミリリットルを追加します。次に、細胞スクレーパーを用いて、細胞を回収し、細胞懸濁液を15ミリリットル遠心管に移す。スイングバケットローターを用いた遠心分離による細胞。
上清を捨て、細胞ペレットを5ミリリットルの均質化バッファーに穏やかに再懸濁します。遠心分離によって細胞を再び収集し、均質化バッファーの1ミリリットルで細胞ペレットを再懸濁します。15~20ストロークを使用して、Dounceホモジナイザーで細胞を均質化します。
次にホモゴネートを2ミリリットル遠心チューブに移します。ホモゴネートに700マイクロリットルの均質化バッファーを加えます。その後、希釈したホモゴネートを回転させ、上清の1.5ミリリットルを集める。
収集した上清を再び回転させ、1.4ミリリットルの上清を集め、核後上清としてラベルを付けます。密度勾配カラムを作成するには、核後上清の1.2ミリリットルを超遠心チューブに移します。その後、サンプルに62%スクロース溶液の1ミリリットルを追加し、穏やかなピペットによってよく混ぜます。
次に、サンプルの上に35%スクロース溶液の3.3ミリリットルを慎重に加え、35%スクロース溶液の上に2.2ミリリットルの25%スクロース溶液を加えます。最後に、超遠心チューブを均質化バッファーで上部に充填します。密度勾配列を遠心分離し、勾配の上から始めて、それぞれ12分の1ミリリットルを慎重に収集します。
次に、希釈バッファーの1ミリリットルですべての分画を希釈し、希釈したサンプルを遠心分離します。遠心分離後、上清を吸引し、50マイクロリットルの1Xサンプルバッファーを加えて分画を収穫する。リサイクル内粉マーカーRab11は、フラクション7で検出された。
他の細胞下マーカーは、ベータCOP、COX IV、GAPDH、EEA1、ラブ7、およびLamp1を含む、また、プローブされた。正のEEA1シグナルもFraction 7で検出されました。クオーター7とポスト核上清の両方でGAPDH、コックスIV、およびRab11の測定されたバンド強度をここに示します。
ELMO1、ELMO1 ARF6Q67L、またはELMO1 ARF6Q67L FE65のいずれかを有するHEC293細胞を転移した後、ARF6Q67LおよびFE65過剰発現を有するELMO1分布に変化は見つからなかった。フラクション7のELMO1レベルを異なるトランスフェクション間で比較し、ARF6Q67Lのコトランスフェクション後に上昇することが判明した。ARF6Q67LとFE65の両方が共発現した場合、さらなる増加が認められた。
逆に、FE65をノックアウトすると、ARF6仲介Elmo1エンリッチメントが分数7で減少しました。得られた分数は、その後の分析に使用することができます。例えば、分画中のタンパク質レベル変化を可視化するウェスタンブロッティング。
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概要
本論文では、ショ糖密度勾配超遠心法を用いて哺乳類細胞からリサイクルエンドソームを調製するためのプロトコルを提示します。この手法は、エンドサイトーシス経路を介したタンパク質輸送の研究を容易にすることを目的として設計されています。
研究の主要構成要素
科学分野
- 細胞生物学
- エンドサイトーシス
- タンパク質輸送
背景
- リサイクリングエンドソームは、細胞内輸送において極めて重要な役割を担っています。
- タンパク質輸送の理解は、さまざまな細胞プロセスを解明する上で不可欠です。
- 超遠心分離法は、細胞成分を単離するために広く用いられている手法です。
- 本プロトコルは、組織サンプルと細胞サンプルの両方に適用可能です。
研究目的
- リサイクリングエンドソームを単離するための信頼性の高い手法を提供すること。
- エンドサイトーシスによる輸送メカニズムの理解を深めること。
- 細胞内におけるタンパク質ダイナミクスの今後の研究を支援すること。
使用方法
- Lipofectamineを用いた哺乳類細胞へのトランスフェクション。
- トランスフェクションから48時間後の細胞回収。
- 氷冷PBSを用いた細胞の洗浄。
- 単離のためのショ糖密度勾配超遠心分離の利用。
主要な結果
- 形質導入細胞からのリサイクリングエンドソームの単離に成功。
- 博士課程の学生によるプロトコルの実演。
- タンパク質輸送に関するさらなる研究の促進。
- さまざまなサンプルタイプに対する本手法の適用可能性の検証。
結論
- 本プロトコルは、リサイクルエンドソームを単離するための簡便な手法を提供します。
- 本手法は、タンパク質輸送の理解に寄与することが期待されます。
- この方法は、さまざまな生物学的研究の文脈で活用可能です。
よくある質問
業界における重要性
リサイクリングエンドソームを単離することで、定量的サブセルラー分画データが得られ、エンドサイトーシス輸送ターゲットのメカニズムにおけるリスク低減が可能になります。これにより、ARF6エフェクターなどの膜タンパク質リサイクリングを制御するタンパク質のターゲットバリデーションおよびアッセイ開発が促進されます。本手法は、タンパク質の局在を機能的なリサイクリング経路に結びつけることで、リード化合物同定における予測の信頼性を向上させます。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：ARF6やELMO1などのエンドサイトーシス・リサイクル調節因子に関する治療仮説を検証する。
- 運用の価値：分画データを提供し、経路特異的なタンパク質輸送メカニズムを明らかにする。
- 科学的価値：リサイクルエンドソーム分画におけるターゲットエンゲージメントを検証することで、生物学的なリスク低減をサポートする。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： ダウンストリームのWestern blot解析に向け、検証済みのリサイクルエンドソーム含有画分を調製する。
- 実用的価値： 定量的なタンパク質測定のための、標準化され再現性のあるオルガネラ単離を可能にする。
- 科学的価値： エンドサイトーシスによるリサイクルを調節する化合物のスクリーニングに向けた、アッセイの準備を容易にする。
翻訳および前臨床研究
- 科学的価値：Rab11陽性画分の単離により、探索段階の輸送データを前臨床モデルへと結びつけます。
- 運用の価値：細胞内分画から疾患関連システムでの機能検証までの一貫性を確保します。
- 科学的価値：リサイクリング経路におけるターゲットの局在を確認することで、リスクを調整した研究の進展を支援します。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、ターゲットの検証およびリード化合物の同定に関する意思決定に寄与する細胞内分画を単離することで、初期の創薬ワークフローに組み込まれます。
- 探索生物学： 分画およびマーカー分析を通じて、エンドサイトーシス・リサイクリング調節因子の仮説検証をサポートします。
- スクリーニング： タンパク質定量に向けたRab11陽性分画の標準的な単離により、アッセイ開発を可能にします。
- 分析： 分画から定量的なウェスタンブロットの結果を得ることで、異なる条件下でのタンパク質の濃縮度を比較します。
- トランスレーショナルリサーチ： リサイクリングエンドソームの単離を検証することで、分画データを前臨床の連続性に結びつけます。
- 企業での再利用： 複数のターゲット検証プロジェクトにわたる、細胞内分画のための再利用可能なプラットフォームを提供します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：輸送経路におけるメカニズム的な曖昧さを排除することで、ターゲットバリデーションにおける予測の信頼性を向上させる。
- 運用的価値：一貫したダウンストリーム解析を実現するため、オルガネラ単離の再現性とスケーラビリティを確保する。
- 戦略的価値：リサイクリング経路のターゲットに関する細胞内局在データを提供することで、Go/No-Go判断を改善する。
- ポートフォリオへの影響：リサイクリングエンドソームの濃縮データに基づいた、リスク調整後のターゲット優先順位付けを可能にする。
実施上の考慮事項
- 細胞培養、トランスフェクション、および超遠心分離技術の専門知識が必要です。
- 密度勾配分離のためのスイングバケットローターおよび超遠心機へのアクセスが必須となります。
- 比較可能なRab11画分を単離するためには、チーム間で分画プロトコルの標準化を行う必要があります。
- 異なる細胞型や輸送経路に応じて、マーカーパネル（例：Rab11、EEA1）を最適化させる必要があります。
- ダウンストリームのアプリケーションに適用する前に、画分の純度を確認するためのバリデーションマーカーが必要であるという制約があります。
バイオファーマに関するよくあるご質問
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:33
Mammalian Cell Culture, Transfection and Cell Harvest
2:07
Density Gradient Column Preparation
2:46
Fractionation and Recovery of Recycling Endosome-Containing Fraction
3:17
Results: Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells
4:47
Conclusion
