Name: フローサイトメトリーによる分析のための子宮内生リンパ球細胞の分離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-14T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: 学ぶ子宮内リンパ球細胞の分離法。マウスの子宮組織から酵素処理と密度勾遠心によりinnate lymphoid cellsを単離し、フローサイトメトリーで表現型解析を行う。細胞生存率と機能性を保持し、生殖免疫学の研究に応用可能です。

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ジャン=マルク・ドイヌ、ノーマン・シュリーブ、イヴァ・フィリポビッチ、アニタ・クオールズなど、この方法の開発を支援してくれた前のチームメンバーと現在のチームメンバーに感謝します。この研究は、ウェルカム信託[グラント番号200841/Z/16/Z]と医学研究評議会(MR/P001092/1)によって資金提供されました。オープンアクセスを目的として、著者はCC BY公的著作権ライセンスを、この提出から生じる著者承諾原稿版に適用しました。

本論文に記載されているすべての動物実験は、英国内務省が発行したPP2363781に基づき、1986年の動物(科学的手順)法に従って実施された。以下のプロトコルは、マウスの畜産から始まり、FACS分析のための染色で仕上げのいくつかのセクションで構成されています。 図 3 は、プロトコルの主な手順を示しています。プロトコルで使用されるマテリアルは、 材料表にリストされています。
1. 一般的なマウスの夫,交配,解剖
<ol><li>7-14週齢の雌マウスを特定の病原体フリー(SPF)状態下に保ち、グループ収容(ケージサイズと動物の体重に応じて通常4〜6匹の女性)を10〜14日間保ち、イブート効果を引き起こし、それが発情同期化を引き起こす。</li>
	<li>SPF状態でスタッドの男性を保ち、一戸舎で、交配(精子再生のための時間)の間に少なくとも48時間休んでください。彼らは通常、若いものよりもパフォーマンスが高いので、経験豊富な実績のある3〜4ヶ月の古いスタッド男性を使用することが好ましいです。</li>
	<li>女性が妊娠する可能性を高めるために、交配の3日前に女性のケージに男性のケージから汚れた寝具を導入する。これは、男性の尿フェロモンへの暴露によってウィッテン効果18 を引き起こし、同期した発情および交配のための強化された受容性をもたらす。</li>
	<li>0日目(D0)に、雌2匹につき1匹のスタッド雄を使用して交配用のマウスを設定します。プラグレートは約20%~25%と考えてください。 注:マウスは夜行性の動物であるため、交配は夜間に発生する可能性が高いです。</li>
	<li>交尾後の朝(D0.5)に、交尾の指標である膣プラグの有無を確認します(図4)。膣プラグは、男性の射精の集合体であり、通常、交配後8〜24時間まで持続する。早朝にプラグを確認してください。</li>
	<li>差し込んだ女性を新しいケージに入れ、それらをイヤマークします。男性をケージに戻して休みます。</li>
	<li>交配後D9.5または10.5で、組織の採取のために1 mL無菌HBSS 1x(Mg2+ およびCa2+)で5 mLチューブを調製し、氷の上に置きます。</li>
	<li>子宮頸部脱臼で動物安楽死に進み、続いて死亡を確認するために排泄する。</li>
	<li>下流のアプリケーションが必要な場合は、無菌環境で作業します。安楽死後直ぐに、70%エタノールでマウス本体を拭き取り、滅菌器具を用いた層状フラックスキャビネットの下で解剖を進める。</li>
	<li>妊娠中の子宮に心間脂肪を含まない切断(図5)、準備された適切に5mLのチューブに子宮全体を入れる。チューブを氷の上に置いておきなさい。</li>
</ol>2. 子宮の機械的および酵素的消化
<ol><li>酵素消化液を調製するには、生殖不能HBSS 1xの子宮当たり3mLを30μg/mLのDNAseと0.1ヴュンシュユニット(WU)/mLのリベレーターDHまたはリベレーターTMの0.52 WU/mLと混合します。水浴に37°Cの溶液を入れる。 注:リベラーTMとリベラーDHの両方を使用することができます。一方の選択は、その後のフローサイトメトリー分析に使用される抗体によって認識されるエピトープに対する潜在的な効果によって導かれなければならない。 注意:凍結乾燥酵素を使用する場合は、フードの下で動作します。</li>
	<li>PBSで5 mM EDTAの20 mLを準備します(Ca2+/Mg2+なし)。水浴に37°Cの溶液の半分を置き、氷の上に残りの半分を置きます。</li>
	<li>層フラックスキャビネットの下で、妊娠中の子宮を取り巻く脂肪を滅菌ペトリ皿の無菌器具でそっと取り除きます。組織を乾燥させないでください。</li>
	<li>胎児(タツノオトシゴ形の半明体構造、長さ約1mm)を除去するために、各注入部位を無菌の器具で解剖する(図6A)。胎児を捨てる。</li>
	<li>子宮を元のコレクション5 mLチューブに戻し、5mLチューブと回収媒体に直接はさみを使用して組織をミンチします。手順の間に常に氷の上にチューブを保ちます。</li>
	<li>37°Cの水浴に、ひき肉を含む5mLチューブを水浴中に入れます。</li>
	<li>各サンプルに3mLの温かい酵素消化ミックスを加えて、チューブ内の液体の総体積が4mL(ひき子宮を用いた1mLの収集媒体、酵素消化溶液3 mL)になるようにします。37°Cで30分間、酵素消化活性を高める5 mLチューブをインキュベートします。</li>
	<li>5 mLのチューブをボルテックスし、氷の上に置いて酵素の作用を阻害します。次いで、その後、適切にラベル付けされた15 mL遠心管に内容物を移す。</li>
	<li>氷冷5 mM EDTA PBS溶液の10 mLを使用して、5 mLチューブから15 mL遠心管にすべてを洗い流します。</li>
	<li>消化した組織を含む15 mL遠心分離管を400 x gで10分間遠心分離する。</li>
	<li>上清を捨て、ペレットを軽くフリックし、10 mLの温かい(37°C)5 mM EDTA PBS溶液に再懸濁します。</li>
	<li>37 mL遠心分離管のサンプルを15分間撹拌して15分間インキュベートし、残った消化媒体を取り除き、細胞の凝集を減らします。</li>
	<li>さらに組織解離を促進するために10sの高い上のサンプルを渦。</li>
</ol>3. 子宮を単一細胞懸濁液に加工
<ol><li>滅菌1 mLシリンジのプランジャーを使用して、消化した組織を70μmのストレーナーを通して適切に標識された無菌50 mL遠心分離管に押し付け、細胞塊および解剖されていない組織を除去する。</li>
	<li>すべての細胞を収集するために冷たいPBSの合計10 mLでストレーナーを数回洗浄します。</li>
	<li>50 mL 遠心管を400 x gで10分間回転 させます。 注:オプションAまたはオプションBを使用してさらなる手順を実行し、オプションBよりも少ない破片および間質細胞汚染でリンパ球のより良い濃縮を可能にします。しかし、オプションBは、細胞損失が少なく、サンプル間の細胞収量の変動性が低いため、より高い免疫細胞収量を与えます。オプション B も技術的に実行しやすくなります。したがって、設定に応じて、オプション A またはオプション B に進みます。<ol>
<li>オプション A の手順は次のとおりです。<ol>
<li>PBSで希釈した80%(v/v)等張性パーコールの5 mLを含むサンプルごとに1つの無菌15 mL遠心分離管にラベルを付けます。</li>
			<li>スピン後、50 mL遠心チューブから上清を捨てます。ピペットの少年を使用して、PBSの40%(v/v)等張性パーコルの8 mLで各ペレットを再懸濁させます。</li>
			<li>ピペットの少年を遅い速度で使用して、40%Percoll溶液に再懸濁されたペレットを80%Percoll溶液に慎重にオーバーレイします。ピペットはゆっくりと、継続的に;15 mLチューブを45°の角度で保持します(図6B)。</li>
			<li>オーバーレイを邪魔することなく、室温(中加速度と最小ブレーク)で850 x gで20分間15 mL遠心管を遠心分離します。</li>
			<li>パーコル層を乱さずに遠心分離機からチューブを慎重に取り外します(図6C)。</li>
			<li>2つのパーコール溶液の界面で白血球のリングを乱すことなく、無菌パスツールピペットを使用して、上部パーコール層の約0.5〜1mLを除くすべての廃棄を行います。</li>
			<li>最小量のPercoll溶液(合計4〜5 mLまで)を吸おうとしている間、白血球のリングを慎重に採取し、細胞を新しいラベル付けされた15 mL遠心分離管に移します。</li>
			<li>各サンプルに10 mLの無菌RMPI-1640培地を加え、熱不活化FBSの10%を補充します。</li>
			<li>4°Cで500× g で5分間の遠心分離機。</li>
			<li>上清を捨ててRBCライシスに進みます。</li>
		</ol>
</li>
		<li>オプション B の手順は次のとおりです。<ol>
<li>サンプルごとに1つの無菌15 mL遠心分離チューブにラベルを付けます。</li>
			<li>スピン後、50 mL遠心チューブから上清を捨てます。ピペットの少年を使用して、RPMI-1640培地で8mLの35%(v/v)等張性パーコールを再懸濁させます。</li>
			<li>サンプルを15 mL遠心チューブに移します。</li>
			<li>中加速度と最小ブレークで室温で10分間、940 x g でサンプルを遠心します。</li>
			<li>吸上器やピペットの少年を使用して慎重に上清を吸引する(チューブを反転させることではない)。</li>
			<li>10%の熱不活性化FBSを補充したRPMI-1640培地の14mLでペレットを再懸濁し、4°Cで5分間500 x g でサンプルを遠心分離します。</li>
			<li>吸引によって上清を捨て、RBCライシスに進みます。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4.RBC ライシス
<ol><li>RBCを溶解するには、サンプルを1x RBC溶解溶液の3 mLで再懸濁し、室温で3分間インキュベートする。</li>
	<li>10 mLのPBSをサンプルに加え、反応を止めます。</li>
	<li>チューブを400xgで5分間遠心し、上清を捨てます。</li>
	<li>PBSを10 mL追加し、ステップ4.3を繰り返します。</li>
	<li>各ペレットを1mLのRPMI-1640培地に再懸濁し、熱不活性化FBSの10%を補充します。</li>
	<li>滅菌70 μmの細胞のストレーナーを通してサンプルを渡す。</li>
	<li>メーカーの指示に従って、トリパンブルーとノイバウアーチャンバーを使用してセルカウントを実行します。</li>
	<li>細胞懸濁液の濃度を、PBSまたは培地の100μLで100μLの1〜200万個の細胞に調整します。</li>
</ol>5. パネル設計戦略と制御
注意:この論文で説明したパネルはuILC1、trNK、およびcNK細胞の識別に適しており、5レーザーBD LSRFortessaで使用されるように設計されています。異なる細胞集団を研究し、代替蛍光色素を使用するためにマイナーな変更を行うことができます。最適な分離のために滴定された抗体を使用して、メーカーの明るさ指数を調べ、NKp46のような低発現抗原のための最も明るい染料を使用し、一般的なガイドラインに従って、機器の構成を確認することをお勧めします19。NKp46の蛍光マイナス1(FMO)コントロールを含めるのが推奨されます。
6. FACSのフェノタイピングのための自然なリンパ球の細胞染色
<ol><li>丸底96ウェルプレートにウェルあたり1〜200万個の細胞を移します。</li>
	<li>プレートを4°Cで3分間回転させ、上清をシンクにフリックして捨てます。</li>
	<li>マルチチャネルピペットを使用して、細胞ペレットを100 μLのPBS(タンパク質およびアジドフリー)に再懸濁します。 注: PBS に、後のステップでアジドナトリウム、トリス、またはタンパク質が含まれていることを確認します。</li>
	<li>ステップ 6.2 を繰り返します。</li>
	<li>細胞を50μLの固定性生き生き色素で再懸濁し、PBS(タンパク質およびアジドフリー)(1:1,000)で希釈した。暗闇の中で30分間室温で細胞をインキュベートします。 注: PBS にアジドナトリウム、トリス、FBS や BSA などのタンパク質が含まれないようにすると、死んだ細胞の染色強度が低下したり、生きている細胞のバックグラウンド染色が増加したりする可能性があります。 注意:生菌性染料が粉末化されている場合は、ボンネットの下で使用してください。</li>
	<li>PBSを150μL加え、マルチチャンネルピペットで細胞を再中断し、ステップ6.2を繰り返します。</li>
	<li>Fc受容体遮断試薬を含むFACSバッファ(PBSは1%BSAまたは2%FBSを補充)の25 μLで細胞を再懸濁する。4°Cで5分間細胞をインキュベートする。</li>
	<li>表面抗体カクテルを25 μL加えます。 注:常に抗体を活性化し、実験の前に抗体パネルを最適化してください。</li>
	<li>暗い中で20分間室温でサンプルをインキュベートします。</li>
	<li>各ウェルに150 μLのFACSバッファを加え、十分に混ぜ合わせ、ステップ6.2を繰り返します。</li>
	<li>ステップ 6.10 を繰り返します。 注: オプション A またはオプション B を使用してさらに手順を実行し、オプション A を使用してセルをサーフェス マーカーで染色します。オプションBを使用して、フローサイトメトリーによる細胞内マーカーを調べてください。<ol>
<li>オプション A の手順は次のとおりです。<ol>
<li>1ウェルあたり4%パラホルムアルデヒド(PFA)の100 μLでサンプルを再懸濁し、室温で20分間インキュベートします。 注意: ボンネットの下に PFA を使用してください。PFAに接触したPFA廃棄物/物品(ピペットなど)を安全に廃棄するための安全シートをご参照ください。</li>
			<li>ステップ 6.2 を 2 回繰り返します。 注意: PFA が含まれているため、ここでシンクにフリックして破棄しないでください。ピペットで吸気し、安全シートに従って廃棄物を廃棄します。</li>
			<li>サンプルを200 μLのPBSで再中断します。</li>
			<li>サンプルをラベル付きFACSチューブに移し、100 μLのPBSを上に上げろ。FACS分析で処理するまで、チューブを氷の上または冷蔵庫に保管してください。フローサイトメーター上のサンプルを24時間以内に取得します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>オプション B の手順は次のとおりです。<ol>
<li>1ウェルあたり100μLの固定/透過液化溶液(パラホルムアルデヒドを含む)でサンプルを再懸濁し、4°Cで20分間インキュベートします。 注意: ボンネットの下に PFA を使用してください。PFAに接触したPFA廃棄物/物品(ピペットなど)を安全に廃棄するための安全シートをご参照ください。</li>
			<li>ステップ 6.2 を繰り返します。 注意: PFA が含まれているため、ここでシンクにフリックして破棄しないでください。ピペットで吸気し、安全シートに従って廃棄物を廃棄します。</li>
			<li>1xパーメアビライゼーション/洗浄バッファーの200 μLを加え、よく混ぜてから、ステップ6.2を繰り返します。</li>
			<li>ステップ 6.11.2.3 を繰り返します。</li>
			<li>細胞内染色用の抗体ミックスを含む1xパーメアビライゼーション/洗浄バッファーの50 μLで固定および透過細胞を再懸濁します。</li>
			<li>暗い部分で30分間、4°Cでサンプルをインキュベートします。</li>
			<li>1x透過/洗浄液の200 μLを加え、よく混ぜてから、ステップ6.2を繰り返します。</li>
			<li>ステップ 6.11.2.7 を繰り返します。</li>
			<li>サンプルを200 μLのPBSで再中断します。</li>
			<li>サンプルをラベル付きFACSチューブに移し、100 μLのPBSを上に上げろ。FACS分析で処理するまで、チューブを氷の上または冷蔵庫に保管してください。フローサイトメーター上のサンプルを24時間以内に取得します。 注: このプロトコルを実行した後、デシデュアル セル サスペンションは FACS 分析の準備ができています。サンプルごとにできるだけ多くのイベントを記録することをお勧めします。信頼できる結果を得るには、親の人口の少なくとも1,000-3,000のイベントを取得する必要があります。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もなく、利益相反もない。

このメソッドには、以降に説明するいくつかの重要な手順が含まれています。最初の重要なステップは、白血球集団の相対的な頻度が妊娠を通じて変化するにつれて、複数の同期妊娠を得ることです。同じ妊娠日に複数のダムを有することで、同じ実験で生物学的反復を行うか、個々のダムからリンパ球をプールして下流の用途に必要な数を増やすことができます。時取り合いにより、研究者は24時間以内に概念を特定することができます。マウスは約2.5年生きるが、生後4~7週間から6~8ヶ月の間、生殖年齢となる。若いマウスは通常小さな子犬を産生するので、雌マウスは一般的に6〜8週間の間になるまで交尾せず、雄マウスは8〜10週の間になるまで交尾しない。発芽はマウスで約15時間続き、4〜5日ごとに起こることを考えると、典型的な交配速度(膣プラグで明らかにされた図 4を参照)は約25%である。したがって、マウスをエストラスで使用し、所定の実験に必要なダム数を得るのに十分な数を計画することが重要です。この経尿期は、膣スミア細胞診22によって決定することができる。プラグレートは、交配前に男性48時間を休ませ、ウィッテン効果18を利用することによって改善することができます。あるいは、内因性卵胞刺激ホルモンの効果を模倣する妊娠中の馬血清を投与することができ、卵母細胞成熟を誘発し、42〜50時間後に、内因性黄体形成ホルモンの効果を模倣するヒト絨毛性ゴナドトロピンは、排卵を誘発する。このホルモン治療は、エストラスの要件をバイパスし、事実上すべての治療された女性を受容させます。
第2の重要なステップは、FACS染色の品質を確保することです。フローサイトメトリーで使用される抗体は、常に最適な濃度で滴定して使用する必要があり、酵素消化が重要な抗原エピトープを切断しないことを確認する必要があります。酵素がエピトープを切断するかどうかを評価するために、1つは同じサンプルの2つの部分を並行して染色し、1つは酵素的に、もう1つは機械的消化を受ける可能性があります。同様に、信頼性の高いデータを得るためには、適切なコントロールと単一の汚れの使用が重要です。まれなイベントでは、ビーズを使用して単一の染色サンプルを生成できます。電圧を設定するためにビーズを使用するのではなく、リンパ球や脾細胞などの他の白血球を含む細胞の集団を使用することをお勧めします。ビーズを使用する場合は、ビーズ染色用の抗体を適量化する必要があるため、染色されたビーズの蛍光強度は細胞の蛍光強度に匹敵します。特定のマーカーに対して負の細胞から正を分離することが困難な場合、FMOコントロールを使用して特定のマーカーの格座を容易にすることもできます。細胞内マーカーの場合、アイソタイプコントロールは、細胞内染色が残留非結合抗体をもたらし、洗浄工程後も細胞内に存在し、したがってバックグラウンドシグナルを増加させる可能性があるため、使用する必要があります。オート蛍光は時間の経過とともに大幅に増加し、一部の抗体の蛍光強度が時間の経過とともに低下する可能性があるため、FACS分析によって表現型で最良の結果を得るために、細胞を固定する24時間以内にサンプルを実行することをお勧めします。
考慮すべきもう一つの重要な要因は、プロトコルで得られた単一細胞懸濁液のダウンストリームアプリケーションです。機能アッセイの場合、滅菌状態で働く必要があります。同様に、その後のオミクス研究では、無菌およびRNase、DNaseおよびプロテアーゼフリーで働くことを重要である。
ここで紹介するプロトコルは、フェノタイピンググループ1のICに焦点を当てていますが、抗体パネルを改変することで他の細胞タイプのフェノタイピングに適応することができます。酵素処理による表面エピトープの損失/変化を検出するために、すべての抗体を消化および非消化細胞懸濁液に対して試験することが推奨されます。同様に、組織を消化して細胞収量を増加させるために異なる酵素を使用することができますが、重要な抗原エピトープに対するその効果は慎重に検討する必要があります。NKp46は脾臓NK細胞のマーカーであり、実験室用マウスのすべての株で働きますが、C57BL/ 6マウスのuNK細胞に対するNKp46の発現は脾臓NK細胞よりもかなり低いです。NK1.1とNKp46の両方を同時に染色するのが最適です。複数の臓器を直接比較する場合、脾臓や骨髄などの組織に酵素消化が必要ない場合でも、すべてのサンプルを均等に扱うことをお勧めします。ここで示す方法は非妊娠子宮に適用可能であるが、2相Percoll勾配によるリンパ球環の単離は困難であり、単離された細胞の収率は信頼性の高いFACS分析には低すぎる可能性があるため、個々の非妊娠マウス23の子宮から分離された細胞を一緒にプールする必要がある。
データの解釈に考慮すべきプロトコルには制限があります。すべての組織の場合と同様に、血液から来る循環リンパ球は、組織居住細胞と一緒に単離される。循環リンパ球の排除がデータ解釈に不可欠である場合、循環細胞を標識するために生体内染色を行うことができる。さらに、プロトコルの第2の制限は、組織から抽出され得る細胞の一部が全ての細胞を抽出できるわけではないので失われるということである。最も一般的な問題とそのトラブルシューティングは 、表 2 に示されています。
歴史的に、組織における細胞の研究は、組織切片の組織学的検査に依存してきた。サンドラ・ピールの優れたレビュー24 は、80年代後半まで100年以上にわたって行われた作業を要約しています。後にuNK細胞として知られる細胞の記述は、リンパ球が発見される前に半世紀以上前に出版された原稿に実際に現れます。そこで、1975年にNK細胞が発見される前に、uNK細胞は母体グリコーゲン細胞または顆粒状心房腺細胞として示されてきました。アン・クロイは、フィールド25 で大きな貢献をし、親切に彼女が最適化した解剖をチームに教えました3、そしてそれは現在使用されています。uNK細胞の形態や組織位置を記述するのに役立ちますが、古典的な組織学的検査は、対象細胞上のほんの数個のマーカーの検出に限定されます。2008年、子宮リンパ球上の複数のマーカーを同時に検出するフローサイトメトリーベースの方法が26に記載された。これは、基本的に、このペーパーで説明されている方法です。質量サイトメトリーによる空間転写学やイメージングなどの最近の技術は、組織学とフローサイトメトリーの力を兼ね備え、複数の遺伝子またはタンパク質の同時検出と正常組織アーキテクチャの保存の両方を可能にします。
ここで説明する方法の用途は、複数であり、FACS表現型、機能アッセイ(ELISPOT、脱顆粒または細胞傷害アッセイなど)、細胞のソート、および後続のトランスクリプトミクスまたはプロテオミクスが含まれる。この方法に基づいて開発できるさらなる応用として、負の枯渇による細胞選別または濃縮後のデシデュアルNK細胞の培養と拡張が挙げられる。現在、マウスuNK細胞を培養および拡張し、その生存率と機能を長期間保持するプロトコルはなく、IL-2またはIL-12とIL-15の組み合わせを添加して7-14日間培養および拡張することができるヒトNK細胞と同様の方法で培養および機能性を維持する。このようなマウスuNK細胞の最適化は、機能アッセイを実行する際により柔軟性を提供し、より高い細胞数で複数の条件をテストすることを可能にするであろう。一方、培養条件は、リンパ球の独特の表現型を改変し、その機能も変える可能性もある。

ここで説明する、個々の妊娠子宮から子宮内在性リンパ球の高収率を得るための簡単な方法がある。この方法は、子宮内生リンパ球のタンパク質表面発現および機能性を維持し、FACSフェノタイピング、RNAseq、プロテオミクスまたは機能的アッセイなどのその後の用途に適しています。ここで、フローサイトメトリーによるグループ1 uICのフェノタイピングに焦点を当てています。
子宮は、子宮内膜、ミオメトリウム、およびペリメトリウムの3つの層で構成されています(図1)。子宮内膜は粘膜であり、子宮の内腔を覆う。黄体によって産生されるプロゲステロンは、子宮内膜をデシドゥアに変換する。子宮筋膜は、子宮壁を構成する平滑筋の2層で構成されています。ペリメトリウムは、子宮を包み込み、メソムトリウムと呼ばれる広い靭帯を通して腹膜に接続するセロサである。子宮の断面では、内腔の反対側の部分はメソメ面側と呼ばれ、内腔に近い部分は抗心膜側と呼ばれます。様々な母体白血球が子宮内膜とデシドゥアに生息し、数種類の細胞を含み、自然免疫細胞が大多数の細胞を占める。自然性リンパ球細胞(INC)、マクロファージ、樹状細胞(DC)、CD4+およびCD8+Tリンパ球、調節性T細胞(Tregs)、および稀なB細胞は、すべて妊娠全体を通して子宮環境の調節において重要な役割を果たし得る1,2。子宮内のICは、粘膜だけでなく、マウスのミオメトリウムにも見られる。IRCの3つのグループすべてを含め、子宮は確かにグループ1 ILCによって最も密度の高い器官である。子宮組織の構造転換により、子宮白血球の数と割合も変化する(グループ1 uILCサブセットの割合の変動の例については図2Aを参照)。3,4。
本論文でマウスを紹介する場合、近親交配の実験用マウスのC57BL/6株を意味する。繁殖マウス(例えば、NMRIマウス)は、生殖率が高いため、生殖研究でよく使用されます。しかし、近交系株の使用は一貫した結果を生成するために必要であり、免疫学者の好きな遺伝的背景はB6としても知られているC57BL / 6である。
妊娠中期のB6ダムの子宮白血球の約30%はg1 uILCであり、これは生き生きとしたCD45+CD3-CD19-NK1.1+NKp46+細胞(図2B):前血管新生組織居住NK(trNK)、IFN-g産生従来型NK(cNK)、および5LCと定義される。uNK細胞の割合はヒトにおいてさらに高く、最初の三半期では約70%に達する。ヒトとマウスuNKとuILC7,8の違いよりも類似点が多い。違いを念頭に置いておくのは重要ですが、2つの種に関する情報を統合することは有用です。ヒトと実験室のげっ歯類のuILCを調べ得た情報を組み合わせると、NK細胞が動脈完全性9およびスパイラル動脈リモデリング10の維持、ならびにトロホブラストの浸潤11,12を含む子宮の生物学に不可欠なホメティック静動態変化を助けることは明らかである。彼らはまた、病原体13,14に対する防御において特定の役割を果たしています。マウスおよびラットでは、移植部位の周りのデシドゥアを充填する以外に、NK細胞は、過去に心房腺としても知られている一過性構造のダムの筋膜の2つの筋肉層の間に蓄積する(MLAp)15(図1B)、その機能はまだ発見されていない。
ここで説明する方法の詳細なプロトコルは、機械的分解と酵素消化の組み合わせを使用して、妊娠中のマウスの子宮からリンパ球を分離するために実験室で使用される方法の詳細なプロトコルです。子宮全体がこの方法で使用されるので、妊娠中に子宮から分離されたリンパ球は、デシデュアル細胞と筋膜細胞の混合物である。子宮壁およびそのMLApからのデシドゥアのさらなる解剖が可能であり、前16に記載されている。ここで説明する方法は、タンパク質表面の発現、細胞機能、および生存率を維持しながら子宮リンパ球を得るために開発されました。結果は、最小の残存細胞の破片を有する単一細胞懸濁液であり、一般的に妊娠中の子宮の妊娠中(10.5日)に1〜500万個の細胞の範囲の収量である。この方法の用途は、フローサイトメトリーによる表現型、その後の転写またはプロテオミクス研究のための細胞選別、細胞内サイトカイン産生、脱顆粒、ELISPOTまたは細胞傷害アッセイなどの機能研究を包含する。ここで紹介するプロトコルは、グループ1のICを特定することに焦点を当てていますが、FACS分析に使用される抗体パネルのわずかな変更を伴う他のILC、T細胞、B細胞、DC、またはマクロファージなどの他の細胞タイプに適応することができます。このプロトコルは、他の組織から細胞を分離し、プールされた非妊娠子宮のためにも使用することができる。

<table><tbody><tr><td>70 & マイクロ;m細胞ストレーナー</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A9647-100G</td><td></td></tr><tr><td>CD19抗体</td><td>BD</td><td>562701</td><td></td></tr><tr><td>CD3抗体</td><td>BD</td><td>562600</td><td></td></tr><tr><td>CD45抗体</td><td>BioLegend</td><td>103108</td><td></td></tr><tr><td>CD49a抗体</td><td>BD</td><td>740262</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche (Sigma)</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>EOMES抗体</td><td>eBioscience</td><td>12-4875-82</td><td></td></tr><tr><td>Fc block Trustain fcx</td><td>BioLegend</td><td>101320</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Gibco</td><td>10217-106</td><td></td></tr><tr><td>Fix/Perm buffer (part of BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit)</td><td></td>BD <td>554714</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, カルシウム, マグネシウム, フェノールレッド</td><td>Gibco</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>リベラーゼ DH</td><td>ロシュ (シグマ)</td><td>5401089001</td><td></td></tr><tr><td>溶解バッファー Pharmlyse</td><td>BD</td><td>555899</td><td></td></tr><tr><td>NK1.1 抗体</td><td>BioLegend</td><td>108739</td><td></td></tr><tr><td>NKp46&nbsp; 抗体</td><td>BioLegend</td><td>137608</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド 16% 溶液 (メタノールフリー)</td><td>Agar Scientific</td><td>AGR1026</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Gibco</td><td>14030-048</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x (Ca2+ or Mg2+なし)</td><td>Thermo Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>VWR international</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5368-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>Pre-Separation filters</td><td>Miltenyi</td><td>130-095-823</td><td></td></tr><tr><td>RMPI-1640 medium + GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0.5M EDTA、pH 8.0</td><td>Thermo Scientific</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>Zombie Violet Fixable Viability Dye</td><td>BioLegend</td><td>423113</td><td></td></tr></tbody></table>

フローサイトメトリーによる分析のための子宮内生リンパ球細胞の分離

Isolation of Uterine Innate Lymphoid Cells for Analysis by Flow Cytometry

ここで説明する簡単な方法は、フローサイトメトリーによって個々の妊娠子宮から1個の子宮内生性リンパ球細胞(g1 uIC)を単離し、表現型マウス群である。このプロトコルは、複数の同期ダムを得るために時間交配を設定する方法、妊娠中の子宮の機械的および酵素的消化、単細胞懸濁液の染色、およびg1 uILCを表現および識別するためのFACS戦略を記述する。この方法は必然的に組織内の細胞分布の空間的情報を失うが、プロトコルはuILC異質性、妊娠に影響を与える母親および胎児因子に対するそれらの応答、それらの遺伝子発現プロファイル、およびそれらの機能を決定するために正常に適用されている。

これは、妊娠中および非妊娠マウスの両方から子宮リンパ球細胞を単離する方法である。この方法は、FACSの表現型、細胞分類、機能アッセイ、RNA-seq、プロテオミクスなどの複数の下流アプリケーションに使用できます。ここでのプロトコルは、フローサイトメトリーによる細胞性の細胞の1個の子宮型を表示しています。

Described here is a simple method to isolate and phenotype mouse group 1 uterine innate lymphoid cells (g1 uILCs) from individual pregnant uterus by flow ...

我々の方法は、妊娠および非妊娠動物の子宮組織に存在する異なるリンパ球亜集団の組成および機能的特徴の評価を可能にする。このプロトコルは、タンパク質の表面発現、細胞の生存率、および機能性を維持しながら、子宮リンパ球の単離を可能にする。したがって、後続の用途の範囲に適しています。実験の開始時の胎児の除去と白血球コレクションは技術的に困難なステップです。それは長い実験であるため、抗体染色ステップに達したら、特に注意と焦点が必要です。まず、妊娠中のC57黒6匹の雌マウスから採取した子宮組織を無菌のシャーレに移し、滅菌器具を使用して組織を取り巻く脂肪を穏やかに取り除き、組織を乾燥させないように注意する。各移植部位を滅菌器具で解剖して胎児を取り除き、1ミリリットルの回収培地を含む元の5ミリリットルのコレクションチューブに子宮を戻す。はさみを使用して、コレクションチューブ内の組織をミンチし、37°Cの水浴にチューブを置きます。次に、チューブに事前に温めた酵素消化ミックスの3ミリリットルを追加します。酵素消化活性を高めるために、攪拌で30°Cで30分間インキュベートします。インキュベートが完了した後、チューブをボルテックスし、氷の上に保って酵素活性を阻害し、消化組織を適切に標識された15ミリリットル遠心分離管に移す。5ミリリットルの回収管を合計10ミリリットルの氷冷5ミリモルEDTA PBS溶液でリンスし、残りの組織をすべて採取し、15ミリリットル遠心管に移します。消化した組織サンプルを400倍G.G.で10分間遠心分離し、ペレットを軽くフリックし、次いで5ミリモルEDTA PBS溶液を温めて10ミリリットルに再懸濁した。細胞の凝集を減らすために、攪拌で摂氏37度でサンプルをインキュベートし、続いて高い渦を10秒間回転させます。非関連組織の細胞塊を除去するには、無菌50ミリリットル遠心管の上に70マイクロメートルのストレーナーを置き、滅菌1ミリリットルシリンジのプランジャーを使用して、ストレーナーを通して消化した組織をチューブに強制します。ストレーナーを合計10ミリリットルの冷たいPBSで数回洗浄してすべての細胞を収集し、50ミリリットル遠心管をG.400回G.400回10分間使用します。次に、ピペットのボイを遅い速度で使用し、15ミリリットル遠心管の再懸濁されたペレットに8ミリリットル、コール溶液あたり40%を慎重にオーバーレイします。ピペットはゆっくりと連続的に、15ミリリットルを約45度の角度に保持する。オーバーレイを邪魔することなく、室温で中加速度と最小の休憩を備えた850倍Gでチューブを20分間遠心します。遠心分離が完了したら、コール層ごとに邪魔することなく、慎重に遠心分離機からチューブを取り外します。次に、コール溶液当たりの2つの界面で白血球のリングを乱すことなく、無菌パスツールピペットを使用して、コール層ごとにトップの0.5〜1ミリリットルを除くすべてを廃棄する。ピペットに吸い込まれたコール溶液あたりの量を最小限に抑えようとしながら、白血球のリングを慎重に収集し、細胞を新しいラベル付けされた15ミリリットル遠心分離管に移します。10%の熱と活性化FBSを加えた無菌RPMI培地を10ミリリットル加え、G500倍と摂氏4度で5分間遠心します。上清を捨てて赤血球のリシスに進みます。オプションBを使用して細胞を単離するには、前述のように細胞ストレーナーを通して消化した組織を通過し、細胞懸濁液の結果を遠心分離した後、コールおよびRPMI培地あたり35%の等張性の8ミリリットルでペレットを再懸濁し、細胞を15ミリリットルのチューブに移す。中加速度と最小の休憩で室温で10分間、940倍Gでチューブを遠心分離します。次に、吸引器またはピペット・ヴォイを使用して、10%の熱と活性FBSを添加したRPMI培地の14ミリリットルでペレットを再懸濁する前に、上清を慎重に吸引する。試料を500倍Gと摂氏4度で再び5分間遠心し、吸引で上清を捨てて赤血球のリシスに進みます。赤血球を溶解するには、1つのX赤血球溶解溶液の3ミリリットルでサンプルを再懸濁し、室温で3分間インキュベートし、その後、10ミリリットルのPBSをサンプルに加えて反応を停止します。上清を捨ててから5分間Gの400倍のチューブを遠心し、PBSを10ミリリットル加えて遠心分離を繰り返す。10%熱不活化FBSを添加したRPMI培地の1ミリリットルでペレットを再懸濁し、滅菌70マイクロメートル細胞ストレーナーを介して細胞内懸濁液中に通過させる。細胞を数えた後、細胞懸濁液の濃度を100マイクロリットルのPBSで1〜200万個の細胞に調整し、染色およびファクの分析に進む。子宮グループ1のILCは、従来のNK細胞、組織常駐NK細胞、および生命と妊娠の間に変化する割合を有するグループ1ICを含む。これらのサブセットは、まず細胞に光を散乱させる能力を合体させ、次に単一の買い込み可能なCD 45陽性CD 3個の負のCD 19陰性細胞を単離し、次にNK 1.1およびNKP 46陽性であるグループ1のICを同定することによって、フローサイトメトリーを使用して識別することができる。グループ1のIC内では、CD49A陰性のエマが従来のNK細胞である。CD49A陽性Ems陽性細胞は、組織に常駐するNK細胞である。CD49陽性Ems陰性細胞とは、グループ1個の子宮ICである。抗NKP46および抗NK1.1抗体を用いた脾臓リンパ球および子宮リンパ球の染色は、脾臓リンパ球が子宮の対応物よりも表面上に高い量のNKP 46を発現することを示している。酵素組織解離では、消化媒体に使用される酵素に応じて表面エピトープが変化する可能性があります。例えば、リベラーTMを使用するとMHC CD49 NKG2A受容体の染色が悪い。しかし、リベラーDHによる消化は、1611抗体クローンによるNKG2A認識を保持する。妊娠8.5日目の子宮組織サンプルに存在するグループ1のICの約6.5%が血液由来である。血液汚染物質は、フルオロクロムと共役した抗CD45抗体によるインビタル染色を介して除外することができる。タイムミーティングを設定する場合は、マウスが夜行性であることを考慮する必要があります。したがって、夜間に交配が行われるため、午後にはできるだけ遅く設定する必要があります。また、女性を選択する際には、膣中隔がないことを確認する必要があります。我々は通常、細胞の外側および細胞内の多くのタンパク質を見るために細胞測定分析を流す。また、RNAシーケンシングを含む遺伝子発現を研究するために核酸抽出を行います。また、機能的アッセイの周りに管理し、子宮内陸性リンパ球細胞の応答を研究しています。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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