Name: 筋萎縮性側索硬化症の C.エレガンス モデルにおける運動障害の評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-02T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: 学ぶC. elegansを用いたALSモデルの運動障害評価法。Radial Locomotion AssayとSwimming Assayにより、這行と遊泳運動を定量的に解析し、神経筋疾患の病態理解と治療開発への貢献を目指す。

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私たちは、役に立つコメントや提案のためのレビュー担当者に感謝します。素晴らしい技術支援を受けたアレーン・サクストン、ブランドン・ヘンダーソン、ジェイド・ステアに感謝します。ブライアン・クレーマーとレベッカ・コウがこれらのアッセイの開発に協力してくれたことに感謝します。この資料は、VAピュージーサウンドヘルスケアシステムでのリソースと施設の使用でサポートされている作業の結果です。この作品は、米国(米国)からの助成金によって支えられた退役軍人省(VA)生物医学研究所研究開発サービス[N.F.L.に#I01BX004044メリットレビュー助成金]

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著者らは、開示がないと宣言している。

放射状移動: このアッセイの分解能は、時間変数を変更することで容易に制御できる。時間の長さを増やすと、重症の現象を持つ動物の違いを観察しやすくなって、微妙な違いを識別できます。しかし、このアッセイは変位を測定するため、アッセイ時間が長く延長されると、N2などの正常運動性を持つ動物がプレートの端まで移動し、飼育行動がバックトラッキングにつながる。これにより、移動距離の測定が人為的に減少します。長すぎる期間は、動物がプレート全体に均等に分散するにつれて、特に重度の運動表現型の動物間で、株間の違いが消失する可能性があります。時間変数を短くすると、よりアクティブなワームがプレートのエッジを見つけないようにします。この方法では、各ワームの総移動距離は追跡されませんが、各ワームの移動距離はプレートの中心から直線距離に圧縮されます。したがって、個々のワームのトラックの全長を記録する方法よりも、本質的に堅牢性が低くなります。しかし、放射状移動アッセイは研究者の訓練をほとんど必要とせず、ほとんどのワームラボで一般的に入手可能な比較的手頃な価格の試薬を使用し、重要で再現可能な結果を生み出すのに十分な感度を持っています。自動ビデオトラッキングを好むラボでは、クロールの動きを追跡および分析するためのいくつかの方法が以前に確立されているか、この論文の水泳アッセイに使用されるソフトウェアパラメータを変更してクロールの検出と分析を可能にする可能性があります。
この実験は通常、独立した複製で30〜40ワームのセットで行われます。各複製は、プレートあたり15〜20ワームで、2つの異なる100ミリメートルまたは150ミリメートルプレートに分割されます。プレートごとに推奨されるよりも多くのワームを使用すると、効率的に得点することが困難になる可能性があります。90以上のスコアの総数は、軽度、中等度、または重度の運動障害の重要性を確立するのに十分なパワーを与えられています。スコア付けされた株間のタイミングと一致することは、正確さと再現性のために不可欠です。30分は、一般に、野生型のワームと比較してヒト変異型TDP-43を発現するトランスジェニック株などの中等度から重度の表現型間の差を確立するのに十分な長さである(図4)。時間変数を拡張する場合は、プレートのサイズを100mmから150mmに増やすことをお勧めします。温度や湿度などの環境要因は、通常は周囲室温で行われるこのアッセイに影響を与える可能性があるため、反復間で比較する場合は常に野生型(N2)コントロールを使用することが重要です。さらに、このアッセイは、液体中の正常な水泳挙動を示さないいくつかの株の運動性を測定することができ(スラッシング)、水泳アッセイに有用な補完物となる。
水泳アッセイ: イメージングおよび取得システムを使用して、ワームスイミングの追跡と分析を自動化することで、厳格で公平なデータを可能にします。ただし、実験の初期設定時には、サンプル間で制御する必要があるいくつかの要因があります。これらには、記録を開始する前に液体に順応する時間、周囲の状態(すなわち、温度、湿度)、および一貫した光および記録設定が含まれる。録音段階では、プレート間の変動を減らすのに役立ついくつかの機能があります。これには、統合されたトラックマウントカメラと明視野ステージが含まれ、記録中に反射、グレア、空気の動きを防ぐステージの周りをシールドし、ワームを確実に検出し、ビデオ後処理でトラックを手動で修正できる堅牢なソフトウェアパッケージが含まれます。このプロトコルでは、ワームを含む35 mmプレートのビデオが1分間記録され、ソフトウェアパッケージを使用して処理されます。処理後、追跡エラーを混乱させることなく、ワームの動作を正確に記録することが、トラックの手動修正によって保証されます。ターンカウントとトラック期間データは、最終読み出しとして毎分のターンを決定するために使用されます。再現性を確保するために、データは、40〜50匹の動物が採点された3つの独立した複製実験の少なくとも3つにわたって収集され、120〜150の動物の組み合わせの最終的な数を達成する。この数は、水泳の動作の小さな違いをコントロールワームから区別するのに十分です。一部のワームは、水泳のアッセイで捕獲するにはあまりにも深刻な運動の欠陥を持っています。例えば、動物が予想されるスラッシング応答を行う代わりに液体媒体カールに入れられた場合、このアッセイはそれらの動きを正確に記録せず、放射状移動などの別の運動アッセイはそれらの運動性欠陥をよりよく捕捉する可能性がある。提供されたプロトコルは、市販のイメージングシステム(詳細については 資料表 を参照)を使用しますが、他のワーム追跡システムは、オープンソース12と同様のユーティリティを提供する可能性があります。以前に公開されたメソッドは、ワームスラッシング13の手動スコアリングについて説明しています。自動分析では、個々のワームごとに多くのメトリックが生成されますが、1 分あたりのスラッシングで測定されるボディ ベンドの検出は、従来のワームスラッシングのスコアリングで実験とトラックの間で一貫した結果を提供します。

筋萎縮性側索硬化症(ALS)は、運動ニューロンに特に影響を与える衰弱、老化関連の神経変性疾患です。この疾患は、脳および脊髄および進行性運動障害における運動ニューロンの喪失を特徴とする。これは、大きな機能的障害および早期死亡をもたらし、典型的には診断後3〜5年以内に1。少なくとも38遺伝子の突然変異はALSを引き起こす可能性があります。しかし、ALSを有するほとんどの患者は、ニューロンおよびグリア細胞におけるその主要な病理としてタンパク質TDP-43のユビキチン化含包物を蓄積する2,3,4。ALS in vivo(レビューin5)を引き起こしたり寄与したりする根本的なメカニズムを研究するために、多くの動物モデルが開発されています。C.エレガンスでは、これらのモデルには、ALSを引き起こす遺伝子のホモログにおける遺伝子機能喪失変異またはヒトALS遺伝子のトランスジェニック発現が含まれる。C.エレガンスでALSをモデリングすることには多くの利点があります。C.エレガンスは、分化された神経系、よく特徴付けられた行動パラダイム、およびヒトに対するかなりの遺伝的相同性を持つ難解な単純な動物である6,7。C.エレガンスとの連携には、堅牢なゲノム編集機能、神経変性の生体内蛍光レポーター、RNAiスクリーニングパラダイム、難解遺伝学、確立された行動および表現法アッセイなど、多くのツールが存在します。ALSのC.エレガンスモデルは、不溶性タンパク質の蓄積、神経変性、早期死亡を含むヒト疾患の側面を再現する8,9.さらに、クロールと水泳の両方の挙動の乱れを特徴とする運動障害は、多くのC.エレガンスALSモデルに存在する。
このプロトコルは、C.エレガンス運動表現型を特徴付ける2つの方法、すなわち、固体表面でのクロールを評価するための放射状の移動アッセイと、WormLab自動追跡および分析を用いた液体中の泳動(スラッシング)の評価について説明する。モータの欠陥を特徴付けるためのこれらの敏感な方法は、重症度の比較を可能にし、抑制と運動の特性の強化を測定するためのツールを提供します。放射状移動アッセイは、ワームの集団間のクロール運動性(固体表面上の副次的な動き)の違いを定量化します。このアッセイは、プレート上の単一の場所にワームを配置し、特定の期間のtime10の後に最終的な位置をマークすることによって、C.エレガンス自然な刺激されない探査行動を利用します。あるいは、液体(スラッシング)アッセイで泳ぐことは、一定期間にわたって個々のワームの体の曲がりの数を数えます。人間の目による身体の曲げの手動カウントは時間がかかり、通常は実験者間でかなりの変動性を示します。コンピュータ支援の自動追跡と分析を使用することで、その変動の多くを排除できます。ALSモデルのベースライン運動障害の特徴付けに加えて、放射状運動と水泳アッセイの両方が、遺伝的または低分子の介入から異なる運動表現型の変調を検出することができる。これらの方法は、ALSモデルおよび変化した運動性を示すC.エレガン株を研究するための有用性を有する。

<table><tbody><tr><td>C. elegans</td><td>Caenorhabditis Genetics Center(CGC)</td><td>-</td><td>必要に応じてあなたの株を取得し、N2は有用な制御株です</td></tr><tr><td>使い捨てパスツールピペット、ホウケイ酸ガラス</td><td>VWR</td><td>14673-010</td><td>ガラスピペットはワームピックを作成するために使用されます - 片手でガラスピペットを持ち、もう片方の手で白金線の~1インチ(ペンチで保持)を炎の上にかざして結合します。&nbsp;</td></tr><tr><td>使い捨てペトリ皿、35x10mm</td><td>VWR</td><td>10799-192</td><td>WormLabイメージングシステム用アッセイプレート</td></tr><tr><td>使い捨てペトリ皿、60x15mm</td><td>VWR</td><td>25384-090</td><td>ワーム用ストックプレート</td></tr><tr><td>使い捨てペトリ皿、100x15mm</td><td>VWR</td><td>25384-302</td><td>標準ラジアルロコモーションアッセイプレート</td></tr><tr><td>使い捨てペトリディッシュ、150x15mm</td><td>VWR</td><td>25384-326</td><td>より長い時間枠ラジアルロコモーションアッセイプレート</td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>M80</td><td>ワームのメンテナンスとラジアルロコモーションアッセイの設定用スコープ</td></tr><tr><td>細い先端のマーカー</td><td>VWR</td><td>52877-810</td><td>ラジアルロコモーションアッセイには少なくとも2色が必要です。精度のために必要な細かいヒント。</td></tr><tr><td>フラットベッドスキャナー</td><td>Amazon</td><td>Epson Perfection V850</td><td>ラジアルロコモーションアッセイにオプション対応。プロトコルは、300dpiの解像度を想定し、ほとんどのスキャナは、</td></tr><tr>NIHが提供する<td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>の</td><td>オプションのフリーソフトウェアが正常に動作します - https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr> <tr><td>M9バッファ</td><td>VWR</td><td>IC113037012</td><td>ミディアム水泳アッセイに使用されます。ゼロから作ることができます、WormBookを参照してください:C.エレガンスのメンテナンス</td></tr><tr><td>NGM(線虫成長培地)</td><td>VWR</td><td>76347-412</td><td>C.エレガンスの栽培に使用される培地。一から作ることができます、WormBookを参照してください:C.エレガンス</td></tr><tr><td>OP50&nbsp;バクテリア</td>のメンテナンス <td>Caenorhabditis Genetics Center(CGC)</td><td>OP50</td><td>C.エレガンスの主な食料源</td></tr><tr><td>p1000ピペッター</td><td>VWR</td><td>76207-552</td><td>ピペッター、水泳アッセイに使用</td></tr><tr><td>p1000チップ</td><td>VWR</td><td>83007-384</td>ピ<td>ペッターのヒント、水泳アッセイに使用</td></tr><tr><td>プラチナワイヤー、直径0.2032mmの</td><td>VWR</td><td>BT136585-5M</td><td>ウォームピックの作成に使用されるファインゲージプラチナワイヤー - 片手でガラスピペットを持ち、もう片方の手で~1インチのプラチナワイヤー(ペンチで保持)を炎の上に持って結合します。&nbsp;</td></tr><tr><td>定規</td><td>VWR</td><td>56510-001</td><td>ラジアルロコモーションアッセイのスコアリングが必要</td></tr><tr><td>WormLabイメージングシステム</td><td>MBF Bioscience</td><td>WormLab</td><td>イメージングシステムには、WormLabハードウェア(明視野ステージ、カメラ、ハウジング)とWormLabソフトウェアが含まれています https://www.mbfbioscience.com/wormlab-imaging-system</td></tr></tbody></table>

筋萎縮性側索硬化症の c.エレガンス モデルにおける運動障害の評価

Evaluation of Motor Impairment in C. elegans Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

神経変性疾患筋萎縮性側索硬化症(ALS)は、筋力低下や運動障害を伴う運動ニューロンの進行性喪失を特徴とし、時間とともに悪化します。患者のサブセットに対するALSの遺伝的要因を決定する際にかなりの進歩がなされているが、大多数の症例は未知の病因を有する。さらに、運動ニューロン機能不全と変性の根底にあるメカニズムはよく理解されていません。したがって、これらのプロセスを研究するために代表的なモデルを開発し、特徴付ける必要が続いています。 カエノハブディティス・エレガンスは 、実験室環境で研究された2つの主要な運動パラダイムで、固体表面を這い、液体で泳ぐ2つの主要な運動パラダイムで、周囲の物理的な制約に彼らの動きを適応させることができます。これらは、感覚、運動ニューロン、および筋肉の間の複雑な相互作用を表しています。ALSの C.エレガンス モデルは、これらの運動パラダイムの一方または両方に障害を示すことができます。このプロトコルは、 C.エレガンスの運動性を評価するための2つの敏感なアッセイを記述します:固体表面でクロールを測定する最適化された放射状移動アッセイと、液体中の水泳を追跡および分析するための自動化された方法(スラッシング)。ALSモデルのベースライン運動障害の特徴付けに加えて、これらのアッセイは、遺伝的または低分子の介入による表現型の抑制または増強を検出することができる。したがって、これらの方法は、ALSモデルおよび変化した運動性を示す 任意のC.エレガン株 を研究するための有用性を有する。

このプロトコルは、筋萎縮性側索硬化症の C.エレガンス モデルにおける軽度、中等度、重度の運動障害を識別するための2つの敏感なアッセイを記述し、 C.エレガンス 株の一般的な有用性を有する運動性を有する。

筋萎縮性側索硬化症の C.エレガンス モデルにおける運動障害の評価

The neurodegenerative disease amyotrophic lateral sclerosis (ALS) features progressive loss of motor neurons accompanied by muscle weakness and motor ...

私たちのプロトコルは、C.elegansの動きを定量化する2つのアッセイを提示します。これらの方法は、筋萎縮性側索硬化症(ALS)のモデルによって示されるような運動性表現型を評価する。放射状のロコモーションアッセイは、固体表面上のクロールを検出するための費用対効果が高く、簡単に行える方法です。スイミングアッセイは、コンピュータベースのトラッキングを使用して、液体中のスラッシング運動のバイアスのない検出を行います。これらの方法は、C.elegansの運動の違いを定量化するのに役立ちます。我々はALSを研究しているが、それらは変化した運動性を有する任意の株に使用することができる。NGMアッセイプレートを上下逆さまに反転します。そして、アッセイするC.elegans株の識別子で底にラベルを付けます。逆さまのプレートの中央にマーカーを持つ小さなドットを作成します。解剖顕微鏡で作業しながら、ワームをアッセイプレートの中央に移します。そして、30分間タイマーを設定します。蓋を皿に戻し、脇に置きます。すべての株が指定されたアッセイプレート上に入るまで、ワームの移送を続けます。30分後、蓋を外し、解剖顕微鏡の下にプレートを下に置いて最初のプレートのスコアリングを開始します。すべてのワームがオーガーを通して見えるように顕微鏡の焦点を調節します。中心点とは異なる色のフェルトチップペンを使用して、各ワームの位置に小さなドットを入れます。いくつかのワームがそこに終わる可能性があるので、プレートの端を確認してください。また、中心点から移動しなかったワームの数をカウントして記録します。各ワームの中心点から最終的な位置のマーキングまでの距離を測定し、ルーラーを使用して距離を記録します。最初のワーム ポイントはダッシュでマークされます。時計回りにプレートを回転させることにより、各ドットの長さデータを連続して記録します。関連するソフトウェアを開いてビデオを設定し、録画します。ビデオ キャプチャ アイコンをクリックします。調光ノブを押し下げ、時計回りに回してライトを調整します。ビデオキャプチャウィンドウで、設定タブをクリックし、ビデオモードを2456x2052_Mono8、フレームレートを14に、モノクロで出力するように調整します。0.00300 秒の露出。1 dB にゲイン。ガンマを1つにします。そして180に回転します。キャプチャ タブに戻り、記録フォルダを選択し、ファイルのプレフィックステキスト ボックスにファイル名を入力してファイル名を割り当てます。バッファーなどの他のキャプチャ設定を 128 フレームに設定し、持続時間を 1 分に設定します。デバイスステージにライトアップされたアッセイプレートを配置し、ビデオキャプチャ画面で中央に置き、蓋を取り外します。マイクロピペットを使用して、M9の1mlで約50個のワームをアッセイプレートに洗浄します。プレートをそっと旋回して動物を中央に持ち込むか、マイクロピペットを使用してM9を数滴加え、動物を分離します。60秒間タイマーを設定して、ワームが泳ぎに順応できるようにします。ディスプレイが露出過ぎることなくできるだけ明るいように、ライトノブを調整します。ディスプレイを見ながら、カメラのレンズ本体に焦点を合わせるリングを手動で調整します。60秒後に録音ボタンを押し、ワークフローメニューの「イメージシーケンスをインポート」の最初のボタンを選択し、ビデオを見つけてダブルクリックします。ワークフローメニューから「シーケンス情報の設定」を選択します"新しいメニューウィンドウで命名スキームを確認し、メモを追加し、メタデータを検証します。「イメージを調整」を選択すると、新しいポップアップメニュー「イメージ調整」が開きます。背景スムージングを 10 に設定し、ガウス スムージングを 5 に設定し、穴を 2 つに塗りつぶし、小オブジェクト フィルタをゼロに設定し、積分微分セグメンテーションをスキップして、画像処理設定を調整します。動物が完全に緑で塗りつぶされるが、背景とは異なるものに、しきい値レベルを調整します。次に、ワークフローメニューから「検出して追跡」を選択し、3~7個のワームを選択し、検出タブの「ワーム検出」ボタンをクリックします。追跡タブに移動します。追跡パラメータで[バックトラッキングを使用する]をオンにし、画像の端にある[ワームを追跡]をオフにします。最大追跡仮説を 5 に設定します。トラッキングモードをスイミングに設定します。詳細設定セクションに移動し、ワームが境界に触れることができるフレームを 50 に設定します。フレームワームは 500 に重なる場合があります。位置許容値を 0.50 に設定します。そして、0.50に形状許容範囲。これらの設定を保存し、構成として保存して、実験内のすべてのビデオに展開します。左上のアイコン メニューで構成マネージャーに移動し、[保存]アイコンをクリックします。この構成に名前と説明を付けます。そして、「はい」をクリックして、ワークフローメニューで「プロジェクトを保存」をクリックし、ワークフローメニューに移動し、バッチ」アイコンをクリックして、ビデオを追跡します。このバッチ処理メニューのファイル選択セクションの下にある「追加」ボタンをクリックします。をクリックし、処理するすべてのプロジェクト ファイルを選択します。次に、[スタート]ボタンをクリックして開く]をクリックし、最初のファイルの緑色の進行状況インジケータを確認します。すべてのファイルを処理できるようにします。読み取ったすべてのファイルが終了したら、ソフトウェアを閉じます。[データの分析] を選択する"トラックの概要に移動します。また、右下のエクスポートボタンを使用して、スプレッドシートの読み取り可能な形式でデータをエクスポートします。「ターンカウント」と「トラックデュレーション」を使用して、スプレッドシート機能を使用する各トラックの毎分回転数を計算します。5種類の異なる株の発生ステージL4幼虫の非刺激分散液を、ラジアルロコモーションアッセイを用いて測定した。そして、1分あたりマイクロメーターとしてグラフ化された。棒グラフとして表示されるデータは、歪み間の相対的な違いをより明確にします。グラフ内にプロットされた各ワームの最終的な変位に対して、母集団内の変動をより良く視覚化することができます。液体中のスラッシングまたは起起き周波数の観点から泳ぐ率は、公平なコンピュータ支援スコアリングおよび分析を用いて測定した。そして、毎分スラッシュとしてグラフ化。棒グラフデータは、ひずみ間の相対的な違いを見やすくします。各個々のワームの採点されたデータがグラフ内にプロットされているのに対し、母集団内の変動をより良く視覚化することができます。放射状のロコモーションアッセイでは、軽度のTDP-43株は野生型N2株と有意に異なっていなかった。しかし、水泳アッセイでは、軽度と強いTDP-43株の両方が野生型N2と有意に異なるだけでなく、互いに異なっていました。ALS変異型TDP-43株は、ラジアル・ロコモーションによる重度のクロール障害を有し、液体中でスラッシュしない。タウ発現株は、ラジアルロコモーションに重度の障害を有するが、水泳アッセイでスラッシュすることができます。これらの方法で考慮すべき最も重要な側面は、反復間の一貫したコントロールを維持することです。これは、運動性の変動が環境条件ではなく、異性の違いによって引き起こされることを保証します。これらの方法は、2つの主要なC.elegans運動パラダイムの包括的な評価を提供する。フォローアップ方法には、追加の行動特徴付け、生化学的分析、または筋肉またはニューロン機能の調査が含まれる可能性があります。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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実験的自己免疫性神経炎マウスモデルにおける運動機能の評価

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電気生理学的運動単位数の推定（MUNE）マウス後肢の筋肉に複合筋活動電位（CMAP）の測定

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この手法の目的は、一次運動ニューロン (MNs) マウスの脊髄からの高濃縮文化を準備することです。ミネソタ病気を引き起こす突然変異の結果を評価するために述べるこれらの分離が magnetofection で、トランスフェクションの MNs...

株マウス一次運動ニューロンによるシャルコー ・ マリー ・ トゥース病の in Vitroモデル化

実験的自己免疫性脳脊髄炎は、多発性硬化症の最も広く使用されているマウスモデルの1つです。現在のプロトコルでは、雌雄のC57BL/6Jマウスにミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質ペプチドを免疫し、主に尾と四肢の上行麻痺を引き起こします。ここでは、EAEの誘導と評価のプロトコルについて説明します。...

両性における多発性硬化症のモデル化:MOG35-55誘発性実験的自己免疫性脳脊髄炎

本プロトコルは、若年RAC1/CED-10変異型...

初期パーキンソン病研究のためのツールとしての Caenorhabditis elegans RAC1/CED-10変異体の消化管運動評価

学ぶC. elegansを用いたALSモデルの運動障害評価法。Radial Locomotion AssayとSwimming Assayにより、這行と遊泳運動を定量的に解析し、神経筋疾患の病態理解と治療開発への貢献を目指す。

筋萎縮性側索硬化症の C.エレガンスモデルにおける運動障害の評価

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