Name: 低層構造状態のタンパク質検出のための高圧NMR実験 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-29T14:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 37 s
Description: 学ぶ高圧NMR実験の手法でタンパク質の低エネルギー構造状態を解析する方法です。窒素15標識サンプルをジルコニア管に導入し、ピーク強度と化学シフト変化を測定してタンパク質の折りたたみ経路と構造安定性を評価します。

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この作品は、ロイ・J・カーバー慈善信託からジュリアン・ロシュへの資金によって支えられました。RrM2サンプルを親切に提供してくれたJ・D・レヴェングッドとB.S.トルバートに感謝します。

注:ここで説明するプロトコルは、(i)2.5 kbarと2.5 kbarの高圧ポンプとセルを定め、(ii)NMRスペクトルの分析用のソフトウェアSPARKY19、 および(iii)曲線フィッティングソフトウェアを必要とする。
1.サンプル調製、高圧セルの組み立て、および実験を設定する。
<ol><li>バッファの選択: リン酸塩とトリス20,21などの陰イオンバッファーとカチオンバッファーの等しい混合を使用します。 注:リン酸やMESなどのアニオン性緩衝液のpKaは、実質的な反応量(すなわち、酸とイオン化産物の部分モル量の差)に関連付けられます。したがって、このようなバッファーの pH は圧力の変化 (〜0.25-0.5 pH 単位/kbar) によって大きな影響を受ける可能性があります。</li>
	<li>必要なサンプル量が、標準の直径3mmのNMRチューブ(〜300μL)と同様であることを確認してください。</li>
	<li>ガラスピペットを含む 15個のN標識サンプルをジルコニアチューブに導入します。チューブの下部にあるサンプルシートを確認します。200 μLのミネラルオイルを完備し、透過液(例えば、水)と混合するのを防ぎます。チューブの残りの部分を液体を透過して充填します。</li>
	<li>ジルコニアチューブの上に使い捨てのOリングを置き、チューブをベースにスライドさせます(図1A、B)。次に、チューブを高圧テザーラインに接続し、最初に手でセルにベースを締めます。次に、14.7 Nmのトルクを適用して、低圧での漏れを防ぎます(図1C、D)。</li>
	<li>圧力セルアセンブリの完全性を確認するには、細胞支持体と格納容器を使用して、分光計の外に最大300バーを加圧します。15分待ってから、圧力を1バーにリセットし、きれいな糸くずのないワイプで漏れをチェックします。</li>
	<li>テザーラインを慎重に導いて、無加圧チューブを分光器に挿入します。サンプルの座っている位置に到達するまで、分光計でチューブをスライドさせます(図1E)。</li>
	<li>通常どおり 1 H と15N チャネルをロック、シム、マッチ、および調整します。 注:高圧評価ジルコニアチューブ用シムは、標準のNMRチューブとは大きく異なります。今後の使用のために最適化されたシムを保存することをお勧めします。</li>
	<li>1H-15N-HSQC または TROSY-HSQC を設定し、大気条件での参照実験を記録します (1bar)。</li>
</ol>2. 高圧NMR実験の記録
<ol><li>タンパク質の全体的な安定性をテストするために、徐々に1バーから2.5 kbarに500バーインクリメントの圧力を増加させます。圧力ポンプの速度を、デフォルトで~18 bar/sに設定します。正確な折り畳み/展開速度が不明な場合は、サンプルが各500バーの増分の後に15〜20分を平衡にします。2.5 kbar でスペクトルを記録します。</li>
	<li>圧力の摂動の可逆性をテストするために、500棒ステップで1バーに戻って圧力を徐々に減らします。大気条件で別のスペクトルを記録し、化学シフトとピーク強度を、以前に同じ条件で記録された基準スペクトルの基準スペクトルと比較します。 注: 圧力が発生した後にネイティブのクロスピークがより強い場合、大気圧で溶液中に存在する小さな凝集体が解別され、適切に折り直された可能性があります。一方、強度の損失または有意な化学シフト変化は、タンパク質が高圧条件で非可逆的なミスフォールディングを経験する可能性があることを示唆している。</li>
	<li>1 つの棒から 2.5 kbar までの一連の 2D 実験を 500 bar ごとに記録します。フィットの精度を向上させるために、折り畳み/展開遷移の変曲点付近で追加の実験を記録することをお勧めします。</li>
</ol>3. ピーク強度の変化を分析する
<ol><li>すべてのスペクトルを処理し、1バーの基準スペクトルから500バーで記録されたスペクトルにバックボーンの割り当てを転送し、500バーから1kbarなどに割り当てを転送します。 注:圧力は1Hと15Nの化学シフトの不均一なシフトを誘発するので、単に1つのスペクトルから次のスペクトルにバックボーンの割り当てをコピーしないでください。手動で調整します。</li>
	<li>スパーキーメニューでピーク &gt;ピークリスト (lt)をクリックします。ピーク リスト ウィンドウで 、オプション をクリックし、 周波数(ppm) と データ高さの両方を表示するオプションを選択します。各スペクトルに対して取得したリストを保存します。</li>
	<li>カーブフィッティングソフトウェアでは、クロスピークの同一性値とピーク強度の値をコピーして、圧力値(バー)をX軸変数に、強度をY軸変数として使用します。</li>
	<li>完全またはほぼ完全な (&gt;80%) 展開が観察された場合は、個々のピーク強度プロファイルをフィットして、単純な 2 状態モデルを使用して、展開時にそれぞれ自由エネルギーと体積変化を抽出します。 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62701/62701eq01.jpg">Eq. 1 ここで、「I」は、与えられた圧力pでのクロスピークの観測強度であり、IFは完全に折り畳まれた状態で同じクロスピークの強度である。Rはガス定数、Tは絶対温度、ΔGU0は大気圧p0(1バー)で展開状態と折り畳まれた状態の間の標準的なギブス自由エネルギー差、展開時の体積変化をΔVuとする。圧力pをバーで、温度Tをケルビンに、R = 1.987 cal/K、ΔGU0はカル/モル、ΔVUはカル/モル/バーに入っています。適合から得られたΔVU値を41.84で乗算してmL/molに変換するΔVU値は、典型的には球状タンパク質22に対して-50〜-150 mL/molの範囲である。ここでは、展開反応に関して全てのパラメータが表現されますが、折りたたみ反応パラメータに簡単に変換することができます(ΔGU0 = -ΔGF0およびΔVU = -ΔVF)。</li>
</ol>4. 化学シフト変化の解析
<ol><li>圧力点を可変値として、1H 化学シフトを Y軸としてスパーキーリストから抽出するために、ソフトウェアの列を整列します。</li>
	<li>1H化学シフトの圧力依存性を単純な二次方程式に適合させます。 δ(p) = δ0(p0) + B1(p-p0) + B2 (p-p0)2 Eq. ここで、δ(p)は、1バーで記録された基準スペクトルにおける同じクロスピークの1H化学シフトをδ 0(p0)でのクロスピークの測定1H化学シフトである。B1と B2は、それぞれ ppm/bar および ppm/bar2で表される 1 番目と 2 番目のパラメーターを表します。</li>
</ol>

<ol><li>Alderson, R. T., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unveiling+invisible+protein+states+with+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Unveiling invisible protein states with NMR spectroscopy.</a> Current Opinion in Structural Biology. 60, 39-49 (2020).</li>
<li>Korzhnev, D. M., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((probing+invisible%2C+low-populated+states+of+protein+molecules+by+relaxation+dispersion+NMR+spectroscopy%3A+An+application+to+protein+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">probing invisible, low-populated states of protein molecules by relaxation dispersion NMR spectroscopy: An application to protein folding.</a> Accounts of Chemical Research. 41, 442-451 (2008).</li>
<li>Loria, P. J., Berlow, R. B., Watt, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+enzyme+motions+by+solution+NMR+relaxation+dispersion%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Characterization of enzyme motions by solution NMR relaxation dispersion.</a> Accounts of Chemical Research. 41, 214-221 (2008).</li>
<li>Ishima, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CPMG+relaxation+dispersion%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">CPMG relaxation dispersion.</a> Methods in Molecular Biology. 1084, 29-49 (2014).</li>
<li>Longo, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+exchange+saturation+transfer+%28CEST%29%3A+an+efficient+tool+for+detecting+molecular+information+on+proteins%27+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Chemical exchange saturation transfer (CEST): an efficient tool for detecting molecular information on proteins' behaviour.</a> Analyst. 39, 2687-2690 (2014).</li>
<li>Fawzi, N. L., Ying, J., Torchia, D. A., Clore, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+exchange+kinetics+and+atomic+resolution+dynamics+in+high-molecular-weight+complexes+using+dark-state+exchange+saturation+transfer+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Probing exchange kinetics and atomic resolution dynamics in high-molecular-weight complexes using dark-state exchange saturation transfer NMR spectroscopy.</a> Nature Protocols. 7, 1523-1533 (2012).</li>
<li>Anthis, N. J., Clore, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+transient+dark+states+by+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Visualizing transient dark states by NMR spectroscopy.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 48, 35-116 (2015).</li>
<li>Roche, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cavities+determine+the+pressure+unfolding+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cavities determine the pressure unfolding of proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 6945-6950 (2012).</li>
<li>Chen, C. R., Makhatadze, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+determinant+of+the+effects+of+hydrostatic+pressure+on+protein+folding+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Molecular determinant of the effects of hydrostatic pressure on protein folding stability.</a> Nature Communications. 8, 14561(2017).</li>
<li>Roche, J., Royer, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lessons+from+pressure+denaturation+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society+Interface%22%5BJournal%5D)">Lessons from pressure denaturation of proteins.</a> Journal of the Royal Society Interface. 15, 20180244(2018).</li>
<li>Xu, X., Gagné, D., Aramini, J. M., Gardner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volume+and+compressibility+differences+between+protein+conformations+revealed+by+high-pressure+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Volume and compressibility differences between protein conformations revealed by high-pressure NMR.</a> Biophysical Journal. 120, 924-935 (2021).</li>
<li>Akasaka, K., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-lying+excited+states+of+proteins+revealed+from+non-linear+pressure+shifts+in+1H+and+15N+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Low-lying excited states of proteins revealed from non-linear pressure shifts in 1H and 15N NMR.</a> Biochemistry. 40, 8665-8671 (2001).</li>
<li>Akasaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+conformational+fluctuation+of+proteins+by+pressure+perturbation%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Probing conformational fluctuation of proteins by pressure perturbation.</a> Chemical Reviews. 106, 1814-1835 (2006).</li>
<li>Kitahara, R., Yokoyama, S., Akasaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMR+snapshots+of+a+fluctuating+protein+structure%3A+ubiquitin+at+30+bar-3+kbar%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">NMR snapshots of a fluctuating protein structure: ubiquitin at 30 bar-3 kbar.</a> Journal of Molecular Biology. 347, 277-285 (2005).</li>
<li>Roche, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((remodeling+of+the+folding+free+energy+landscape+of+Staphylococcal+nuclease+by+cavity-creating+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">remodeling of the folding free energy landscape of Staphylococcal nuclease by cavity-creating mutations.</a> Biochemistry. 51, 9535-9546 (2012).</li>
<li>Nucci, N. V., Fuglestad, B., Athanasoula, E. A., Wand, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+cavities+and+hydration+in+the+pressure+unfolding+of+T4+lysozyme%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Role of cavities and hydration in the pressure unfolding of T4 lysozyme.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 13846-13851 (2014).</li>
<li>Maeno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cavity+as+a+source+of+conformational+fluctuation+and+high-energy+state%3A+High-pressure+NMR+study+of+a+cavity-enlarged+mutant+of+T4+lysozyme%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Cavity as a source of conformational fluctuation and high-energy state: High-pressure NMR study of a cavity-enlarged mutant of T4 lysozyme.</a> Biophysical Journal. 108, 133-145 (2015).</li>
<li>Peterson, R. W., Wand, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-contained+high-pressure+cell%2C+apparatus%2C+and+procedure+for+the+preparation+of+encapsulated+proteins+dissolved+in+low+viscosity+fluids+for+nuclear+magnetic+resonance+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Self-contained high-pressure cell, apparatus, and procedure for the preparation of encapsulated proteins dissolved in low viscosity fluids for nuclear magnetic resonance spectroscopy.</a> Review of Scientific Instruments. 76, 094101(2005).</li>
<li>Goddard, T. D., Kneller, D. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGoddard%2C+TD+%22Sparky+3%22">Sparky 3</a>. , University of California San Francisco. San Francisco, CA. (2010).</li>
<li>Caro, J. A., Wand, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+aspects+of+high-pressure+NMR+spectroscopy+and+its+applications+in+protein+biophysics+and+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Practical aspects of high-pressure NMR spectroscopy and its applications in protein biophysics and structural biology.</a> Methods. 148, 67-80 (2018).</li>
<li>Kitamura, T., Itoh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reaction+volume+of+protonic+ionization+for+buffering+agents.+Prediction+of+pressure+dependence+of+pH+and+pOH%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Solution+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Reaction volume of protonic ionization for buffering agents. Prediction of pressure dependence of pH and pOH.</a> Journal of Solution Chemistry. 16, 715-725 (1987).</li>
<li>Royer, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+volume+changes+in+pressure-induced+protein+unfolding%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Revisiting volume changes in pressure-induced protein unfolding.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1595, 201-209 (2002).</li>
<li>Erlach, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+nonliner+pressure-induced+chemical+shift+changes+and+thermodynamic+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Relationship between nonliner pressure-induced chemical shift changes and thermodynamic parameters.</a> Journal of Physical Chemistry B. 118, 5681-5690 (2014).</li>
<li>de Oliveira, G. A. P., Silva, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hypothesis+to+reconcile+the+physical+and+chemical+unfolding+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+The+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A hypothesis to reconcile the physical and chemical unfolding of proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of The United States of America. 112, 2775-2784 (2015).</li>
<li>Nguyen, L. M., Roche, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-pressure+NMR+techniques+for+the+study+of+protein+dynamics%2C+folding+and+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Magnetic+Resonance%22%5BJournal%5D)">High-pressure NMR techniques for the study of protein dynamics, folding and aggregation.</a> Journal of Magnetic Resonance. 277, 179-185 (2017).</li>
</ol>

すべての著者は原稿を読んで承認しました。彼らは利益相反を宣言しません。

この研究では、圧力摂動に対するタンパク質構造および熱力学応答をプローブするために実装されたプロトコルを詳述する。ここでRRM2に記録された高圧実験は、非完全に協力的な展開を示すΔVU値の大きな変動が、比較的小さな単一ドメインタンパク質に見つけることができることを示しています。同様の画像は、圧力下での1H化学シフト変化の分析から浮かび上がる。なお、カルビッツァーと同僚は、化学シフト変化のより詳細な分析を行うことができることを実証した方が、非線形係数と線形係数(B2/B1)と圧縮率と体積の変化の比率(Δβ/ΔV)23との間の比率をリンクすることができる。これらの結果は、局所熱力学的安定性と展開に関連する体積変化に基づいて、個々の構造モチーフおよびサブドメインを不安定にする高静水圧の能力を強調する。単純な圧力滴定実験を記録することで、タンパク質の折りたたみ機構とサブドメインアーキテクチャに関する貴重な情報を提供できます。
全体の圧力システム(ポンプおよび...

タンパク質およびタンパク質複合体の高エネルギー、まばらな立体構造状態が、多くの生物学的経路1、2、3において重要な役割を果たすことが長い間認識されてきた。Carr-パーセル-Meiboom-Gill (CPMG)4、化学交換飽和伝達(CEST)5、および暗い状態交換飽和伝達(DEST)6パルス配列(とりわけ)に基づく実験のおかげで、溶液NMR分光法は、一過性の立体状態を特徴付けるための選択肢として出現した7。これらの実験に加えて、温度、pH、または化学変性物質などの摂動を導入して、より高いエネルギー立体構造サブステイトの相対的集団を増加させることができる。同様に、タンパク質平衡は、高い静水圧を加えることによっても摂動することができる。対応する立体構造変化に伴う体積変化の大きさに応じて、数百から数千のバーの圧力の増加は、より高いエネルギー状態を有意に安定させ、またはタンパク質が8、9、10を完全に展開する原因となる。タンパク質NMRスペクトルは、通常、静水圧で2種類の変化を表示する:(i)化学シフト変化および(ii)ピーク強度変化。化学シフトの変化は、タンパク質表面水界面における変化および/またはタンパク質構造の局所圧縮を速い時間スケール(NMR時間スケールに対する)11に反映する。大きな非線形化学シフト圧力依存性を示すクロスピークは、より高いエネルギー立体構造状態12,13の存在を示すことができる。一方、ピーク強度の変化は、折り畳まれた状態/展開された状態の人口の変化など、遅い時間スケールでの主要な立体構造遷移を指します。フォールディング中間体または高いエネルギー状態の存在は、所与のタンパク質14、15、16、17の異なる残基について測定された展開時の体積変化の大きさの大きな変動から検出することができる。我々の経験に基づいて、通常2状態フォルダとして分類される小さなタンパク質でさえ、圧力に対する不均一な応答を示し、局所的な折りたたみの安定性に関する有用な情報を提供します。ここで説明するアミドピーク強度および1H化学シフト圧力依存の取得及び分析のためのプロトコルは、異種核リボヌクレオプロテインA1(hnRNPA1)の単離されたRNA認識モチーフ2(RRM2)をモデルタンパク質として用いる。

<table><tbody><tr><td>Bruker NMR Cell 2.5 Kbar</td><td>Daedalus Innovations LLC</td><td>NMRCELL-B</td><td></td></tr><tr><td>Sparky3</td><td>カリフォルニア大学サンフランシスコ校、カリフォルニア州</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Xtreme-60 シリンジポンプ</td><td>Daedalus Innovations LLC</td><td>XTREME-60</td><td></td></tr></tbody></table>

低層構造状態のタンパク質検出のための高圧nmr実験

High-Pressure NMR Experiments for Detecting Protein Low-Lying Conformational States

高圧は、球状タンパク質を不安定化させ、タンパク質複合体を可逆的に解化するために使用できる、よく知られた摂動法です。静水圧は、熱力学的平衡を、より低いモル体積の状態に向かって駆動します。圧力の上昇は、したがって、球状タンパク質の安定性とタンパク質複合体のオリゴマー化平衡を細かく調整する機会を提供します。高圧NMR実験は、NMR分光法の溶液によって提供される圧力摂動の微細な安定性調整能力と部位分解能を組み合わせることにより、球状タンパク質の安定性、その折りたたみ機構、およびオリゴマー化メカニズムを支配する因子の詳細な特徴付けが可能になります。ここでは、1バーから2.5kbarまで記録された2D 1H-15N実験のセットを介してタンパク質の局所的な折りたたみ安定性をプローブするプロトコルを提示する。このような実験の取得および分析に必要なステップは、hnRNPA1のRRM2ドメイン上で取得したデータと共に示されている。

ここで説明するプロトコルは、2.5kbar範囲(&gt;90%)内でほぼ完全に展開されたhnRNPA1(残基95〜106)の第2RNA認識モチーフであるRRM2の圧力依存性をプローブするために使用した。1H-15Nスペクトルは、1バー、500バー、750バー、1 kbar、1.5 kbar、2 kbar、および2.5kbarで収集した(図2)。2.5 kbarのノイズレベルより上に現れたクロスピークはどれも見えなかったので、対応するすべての残基は、この圧力で0の強度値を帰属させた(図3A)。式1(Eq. 1)に従って合計45個の個別圧力強度プロファイルを取り付け、展開反応に関連する標準的なGibbs自由エネルギー(ΔGU0)および体積(ΔVU)の対応する変化を得た(図3A)。計算されたΔVU値は、-41から-88 mL/mol、Δ...

高圧セルの組み立て、高圧NMR実験の設定と記録に必要なステップの詳細な説明を提供し、最後に圧力下でのピーク強度と化学シフトの両方の変化を分析します。これらの実験は、タンパク質の折りたたみ経路と構造安定性に関する貴重な洞察を提供することができます。

低層構造状態のタンパク質検出のための高圧NMR実験

High-pressure is a well-known perturbation method that can be used to destabilize globular proteins and dissociate protein complexes in a reversible ...

高圧は、タンパク質立体構造サンプルの相対集団を変化させる方法です。高エネルギーの立体構造状態を特定し、特徴付けるための非常に有用です。pHや温度などのすべての摂動方法と比較すると、圧力摂動は適用しやすく、完全に可逆的です。また、主にガラスの空洞や空隙体積を有する領域に影響を与える局所的な摂動である。まず、ガラスピペットを使用してジルコニアチューブに窒素15標識サンプルを導入し、チューブの底部のサンプルシートを確認します。サンプルが透過液と混合するのを防ぐには、サンプルを200マイクロリットルの鉱物油で重ね、残りのチューブに透過液を充填します。ジルコニアチューブの上に使い捨てのOリングを置き、ベースにチューブをスライドさせます。次に、チューブを高圧テザーラインに接続し、手でセルにベースを締めます。次に、14.7ニュートンメートルのトルクを適用して、低圧での漏れを防ぎます。圧力セルアセンブリの完全性を確認するには、細胞支持体と格納容器を使用して、分光計の外に最大300本のバーを加圧します。15分後、圧力を1つのバーにリセットし、きれいな糸くずのない拭き取りで漏れをチェックします。テザーラインを慎重に導いて、無加圧チューブを分光器に挿入します。チューブがサンプルの座っている位置に到達するまで、管を分光計に差し込む。プロチウムと窒素チャネルをロック、シム、マッチング、チューニングし、最適化されたシムを将来のために保存します。横方向緩和最適化分光法をヘテロ単一量子コヒーレント分光法で設定し、大気条件での基準実験の記録を進めます。500本ごとに1つのバーから2.5キロバーまでの一連の2D実験を記録します。正確な折りたたみ速度または展開率がわかっている場合は、500 本のバーの増分を行った後、サンプルを 15 ~ 20 分間平衡させます。折り畳みまたは展開遷移の変曲点が到達したら、フィットの精度を向上させるために追加の実験を記録します。このプロトコルは、RRM2の圧力依存性をプローブするために使用された、第2のRNA認識モチーフ不均一核リボヌクレオプロテインA1。横方向緩和最適化分光法ヘテロ単一量子コヒーレンス分光スペクトルを用いて、1つの棒、1.5キロバー、2キロバー、および2.5キロバーで収集した。RRM2は2.5キロバーの範囲内でほぼ完全に展開される。個々の圧力強度プロファイルは、ここで示す式に従って適合し、展開反応に関連する標準的なGibbs自由エネルギーおよび体積の対応する変化を得た。ドメイン構造にマッピングすると、体積変化の大きさが最も大きい残基がドメイン構造コア内で見つかり、体積変化の最も大きさが小さいものは、主にベータ鎖とC端子ヘリクスとの間の接続ループに位置していた。折り畳まれた状態アンサンブルの圧縮性および立体構造の不均一性の程度を調査するために、プロチウム化学シフトを分析した。圧力の関数としてのプロチウム化学シフトの個々のプロファイルは、示された式を用いて適合し、部位特異的線形および非線形係数を抽出した。非線形係数が最も大きい残基は主にドメインの構造コアに見られ、非線形係数が最も小さい残基は、異なる構造モチーフを結ぶループ内に位置していました。漏れを防ぐために、管を正しく設定する圧力として設定することが重要です。漏れが発生した場合、おそらく鉱物油の痕跡をクリーンアップするためにプローブを取り外す必要があります。

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JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

このビデオでは、15のN標識野生型および変異型エンボプラキンタンパク質と非標識ビメンチンタンパク質との間のタンパク質間相互作用を研究するための核磁気共鳴分光法の技術について説明しています。野生型エンボプラキンとビメンチンとの相互作用が成功すると、NMRスペクトルでは広範な線幅が広がり、ピークが消失しますが、変異したエンボプラキンとビメンチンとの間に相互作用がないと、NMRスペクトルではピークが十分に分解されます。...

原子レベルのタンパク質間相互作用を研究するための核磁気共鳴

核磁気共鳴は最も重要な分光ツールの一つです。ここでは、現在最大10.1...

極限条件下で凝縮系の電子·化学的性質を探るための新しいツール：ギガパスカルの圧力で高感度核磁気共鳴

原子分解能で分子タンパク質複合体の構造は、多様な生命現象で重要な役割のため関連性が高いです。ここで、マジック角回転固体核磁気共鳴分光法 (MAS SSNMR) による不溶性と非晶質高分子タンパク質複合体の高分解能構造解析を実行するためのプロトコルを提案する.

固体核磁気共鳴分光法による高分子アセンブリの原子スケール構造の研究

ここでは、NMR分光法による溶液NMRの緩和分散プロファイルを...

15μs-ms タイムスケールにおけるタンパク質コンフォメーションダイナミクスの研究のためのN CPMG緩和分散

天然変性タンパク質の弱く一過性の分子間および分子内相互作用を検出するための常磁性緩和増強NMR分光法の適用のためのプロトコルが提示されています。...

天然的に無秩序なタンパク質の自己会合の検出と特性評価のための常磁性緩和増強

ここでは、溶液中のタンパク質-糖鎖相互作用の特性評価を目的とした一連のNMR実験の取得、処理、および分析を詳述したプロトコールを紹介します。最も一般的なリガンドベースおよびタンパク質ベースの方法論が概説されており、構造糖鎖生物学および分子認識研究の分野に貢献していることは間違いありません。...

糖鎖-タンパク質相互作用の解きほぐし:核磁気共鳴(NMR)による解決

核磁気共鳴(NMR)分光法は、構造タンパク質のダイナミクスを残留物特異的な方法で特徴付けることができます。私たちは、ピコ秒からナノ秒の時間スケールに敏感なNMR 15N R1 およびR2...

タンパク質のピコ秒からナノ秒の構造ダイナミクスを調べるためのNMR 15N緩和実験

このNMRベースのプロトコルは、シアノビリン-NおよびD-マンノースを使用して弱いタンパク質-糖鎖相互作用を調査します。リガンドとタンパク質の検出方法を組み合わせて、結合部位をマッピングし、アロステリック効果を検出し、遭遇複合体を同定します。このアプローチは、サンプル前処理とデータ分析の概要を示し、糖鎖特異的診断と認識メカニズムに役立つ構造的および動的な洞察を提供します。...

タンパク質と糖鎖の相互作用の探索:核磁気共鳴の進歩

この論文は、脂質近位環境におけるin vitroでの内在性膜タンパク質とさまざまなパートナー因子との相互作用と集合を評価する方法を説明しています。...

足場リポソームを使用することにより、脂質近位タンパク質 - タンパク質相互作用を再構成しますインビトロ

このプロトコルは、低解像度第一原理計算モデルと洗剤のコントラストが一致する中性子小角散乱法を用いたソリューションの洗剤可溶化膜蛋白質の構造の詳細を取得する方法を示します。...

膜蛋白質の構造解析および経験的モデリング中性子小角散乱実験でコントラストに一致する洗剤

学ぶ高圧NMR実験の手法でタンパク質の低エネルギー構造状態を解析する方法です。窒素15標識サンプルをジルコニア管に導入し、ピーク強度と化学シフト変化を測定してタンパク質の折りたたみ経路と構造安定性を評価します。

低層構造状態のタンパク質検出のための高圧NMR実験

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