低層構造状態のタンパク質検出のための高圧NMR実験
2021年6月29日
高圧セルの組み立て、高圧NMR実験の設定と記録に必要なステップの詳細な説明を提供し、最後に圧力下でのピーク強度と化学シフトの両方の変化を分析します。これらの実験は、タンパク質の折りたたみ経路と構造安定性に関する貴重な洞察を提供することができます。
高圧は、タンパク質立体構造サンプルの相対集団を変化させる方法です。高エネルギーの立体構造状態を特定し、特徴付けるための非常に有用です。pHや温度などのすべての摂動方法と比較すると、圧力摂動は適用しやすく、完全に可逆的です。
また、主にガラスの空洞や空隙体積を有する領域に影響を与える局所的な摂動である。まず、ガラスピペットを使用してジルコニアチューブに窒素15標識サンプルを導入し、チューブの底部のサンプルシートを確認します。サンプルが透過液と混合するのを防ぐには、サンプルを200マイクロリットルの鉱物油で重ね、残りのチューブに透過液を充填します。
ジルコニアチューブの上に使い捨てのOリングを置き、ベースにチューブをスライドさせます。次に、チューブを高圧テザーラインに接続し、手でセルにベースを締めます。次に、14.7ニュートンメートルのトルクを適用して、低圧での漏れを防ぎます。
圧力セルアセンブリの完全性を確認するには、細胞支持体と格納容器を使用して、分光計の外に最大300本のバーを加圧します。15分後、圧力を1つのバーにリセットし、きれいな糸くずのない拭き取りで漏れをチェックします。テザーラインを慎重に導いて、無加圧チューブを分光器に挿入します。
チューブがサンプルの座っている位置に到達するまで、管を分光計に差し込む。プロチウムと窒素チャネルをロック、シム、マッチング、チューニングし、最適化されたシムを将来のために保存します。横方向緩和最適化分光法をヘテロ単一量子コヒーレント分光法で設定し、大気条件での基準実験の記録を進めます。
500本ごとに1つのバーから2.5キロバーまでの一連の2D実験を記録します。正確な折りたたみ速度または展開率がわかっている場合は、500 本のバーの増分を行った後、サンプルを 15 ~ 20 分間平衡させます。折り畳みまたは展開遷移の変曲点が到達したら、フィットの精度を向上させるために追加の実験を記録します。
このプロトコルは、RRM2の圧力依存性をプローブするために使用された、第2のRNA認識モチーフ不均一核リボヌクレオプロテインA1。横方向緩和最適化分光法ヘテロ単一量子コヒーレンス分光スペクトルを用いて、1つの棒、1.5キロバー、2キロバー、および2.5キロバーで収集した。RRM2は2.5キロバーの範囲内でほぼ完全に展開される。個々の圧力強度プロファイルは、ここで示す式に従って適合し、展開反応に関連する標準的なGibbs自由エネルギーおよび体積の対応する変化を得た。
ドメイン構造にマッピングすると、体積変化の大きさが最も大きい残基がドメイン構造コア内で見つかり、体積変化の最も大きさが小さいものは、主にベータ鎖とC端子ヘリクスとの間の接続ループに位置していた。折り畳まれた状態アンサンブルの圧縮性および立体構造の不均一性の程度を調査するために、プロチウム化学シフトを分析した。圧力の関数としてのプロチウム化学シフトの個々のプロファイルは、示された式を用いて適合し、部位特異的線形および非線形係数を抽出した。
非線形係数が最も大きい残基は主にドメインの構造コアに見られ、非線形係数が最も小さい残基は、異なる構造モチーフを結ぶループ内に位置していました。漏れを防ぐために、管を正しく設定する圧力として設定することが重要です。漏れが発生した場合、おそらく鉱物油の痕跡をクリーンアップするためにプローブを取り外す必要があります。
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概要
本記事では、高圧セルの組み立ておよび高圧NMR実験のセットアップについて詳細に解説します。圧力下におけるピーク強度および化学シフトの変化の解析に重点を置き、タンパク質の折り畳み経路と構造安定性に関する知見を提供します。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 生化学
- 構造生物学
背景
- 高圧はタンパク質の立体構造状態を変化させる。
- これは可逆的な摂動法である。
- 圧力は主に空隙体積を持つ領域に影響を及ぼす。
- 高エネルギーの立体構造状態を特性評価するのに有用である。
研究目的
- 高圧セルの組み立て手順について説明する。
- 高圧NMR実験のセットアップおよび測定を行う。
- タンパク質構造に対する圧力の影響を解析する。
使用方法
- ジルコニアチューブへの15N標識試料の導入。
- 試料の混合を防ぐため、ミネラルオイルで上層を覆う。
- チューブに透過液を満たす。
- 高圧下でのNMR実験の記録。
主要な結果
- 高圧NMRセットアップの詳細な手法。
- タンパク質折り畳み経路に関する知見。
- ピーク強度および化学シフト変化の解析。
- 圧力下における構造安定性の特性評価。
結論
- 高圧NMRは、タンパク質のダイナミクスの研究に有効である。
- タンパク質の配座状態に関する貴重な知見を提供する。
- 本手法は、さまざまなタンパク質研究に応用可能である。
よくある質問
産業界における重要性
高圧NMRを用いることで、バイオ医薬品開発チームは、タンパク質の折りたたみ、安定性、およびオリゴマー化を理解する上で極めて重要な、低集団で高エネルギーのコンフォメーション状態を解析することが可能になります。この機能により、標準的な摂動法ではアプローチできないメカニズムの詳細が明らかになり、ターゲット検証における予測の信頼性が向上し、初期段階の創薬におけるリスクを低減できます。圧力ベースのNMRを創薬ワークフローに統合することで、より根拠に基づいたポートフォリオの選別と、リスクを調整した開発推進の意思決定がサポートされます。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 機能的なターゲット検証に関連する希少なコンフォメーション状態の直接観察を可能にします。
- 部位特異的な安定性とフォールディング転移をマッピングすることで、メカニズム的なリスク低減をサポートします。
- タンパク質の局所的および全体的な安定性を定量化することで、ターゲット選択における予測の信頼性を向上させます。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- フォールディングおよびオリゴマー化平衡を特性評価することで、ダウンストリームスクリーニングに向けた検証済みタンパク質系の調製を容易にする。
- アッセイの標準化と再現性のための、定量的な部位解消読み取り値を提供する。
- 制御された摂動条件下で、タンパク質バリアントまたはリガンドの効果を堅牢に比較することを可能にする。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 適用可能な場合、構造安定性データを、疾患に関連するタンパク質のミスフォールディングまたは凝集メカニズムと整合させます。
- コンフォメーションの不均一性と圧縮性に関する情報を提供することで、創薬から前臨床検証までの連続性をサポートします。
- パイプラインの早期段階で生物物理学的なリスクを明確にすることで、トランスレーショナルリサーチへの移行に伴うリスクを低減します。
パイプラインおよびワークフローへの統合
高圧NMRは、タンパク質の特性評価のための可逆的かつ定量的な摂動プラットフォームを提供することで、創薬から前臨床に至る一連の流れに適合します。
- 探索生物学： 折り畳みメカニズムおよびオリゴマー化平衡に関する仮説検証をサポートします。
- スクリーニング： アッセイ開発に向けた、構造転移の再現性のある定量的な測定値を提供します。
- 分析： 構造状態を比較するための部位特異的な強度および化学シフトプロファイルを生成します。
- トランスレーショナルリサーチ： タンパク質系によって裏付けられた場合に、疾患モデルに関連する構造的な不均一性に関する情報を提供します。
- 企業的な再利用： 多様な標的タンパク質やメカニズムに関する疑問に対し、再利用可能な分析能力を提供します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：タンパク質標的のバリデーションにおける予測の信頼性を高め、メカニズム的な曖昧さを低減する。
- 運用的価値：再現性のあるデータ生成のために、標準化され、可逆的かつスケーラブルな摂動手段を提供する。
- 戦略的価値：構造的なリスクを早期に明確にすることで、より適切なgo/no-go判断と資本効率の向上を可能にする。
- ポートフォリオへの影響：堅牢な生物物理学的データに基づいた、リスク調整後のタンパク質標的の優先順位付けと推進をサポートする。
実施上の考慮事項
- NMR分光法および高圧計装に関する専門知識が必要です。
- 高圧セルや封じ込めシステムを含む専用のハードウェアが必要です。
- 厳格な試料調製および漏洩防止プロトコルが必須となります。
- 異なるタンパク質系や標識戦略に合わせて最適化が必要な場合があります。
- 運用上の制限として、正確な測定のための圧力範囲や平衡化時間が挙げられます。
