Name: 大型動物モデルにおける前臨床試験のための細胞スタックにおけるアデノ関連ウイルスベクターの生成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: 学ぼう、HEK293細胞を用いた高純度・高力価AAVベクター製造法。接着性細胞培養チャンバーを活用した効率的な遺伝子治療用ウイルスベクター生産プロトコルで、前臨床大型動物モデル研究に貢献します。

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アミラ・D・Rghei,ブレナ・A・Y・スティーブンス,シルビア・P・トーマス,ジェイコブ・G・E・イェーツは,オンタリオ獣医大学学生奨学金とオンタリオ州大学院奨学金の受給者でした。アミラ・D・ルガイは、学生シップを加速するミタクの受領者でした。この研究は、カナダ保健研究所(CIHR)プロジェクトグラント(#66009)とSKWへの共同健康研究プロジェクト(NSERC提携)助成金(#433339)によって資金提供されました。

<ol><li>Hastie, E., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+at+50%3A+A+golden+anniversary+of+discovery%2C+research%2C+and+gene+therapy+success-a+personal+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus at 50: A golden anniversary of discovery, research, and gene therapy success-a personal perspective.</a> Human Gene Therapy. 26 (5), 257-265 (2015).</li>
<li>Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+vector+as+a+platform+for+gene+therapy+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).</li>
<li>Nathwani, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+safety+and+efficacy+of+factor+IX+gene+therapy+in+hemophilia+B%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Long-term safety and efficacy of factor IX gene therapy in hemophilia B.</a> The New England Journal of Medicine. 371 (21), 1994-2004 (2014).</li>
<li>Kuzmin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+landscape+for+AAV+gene+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">The clinical landscape for AAV gene therapies.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 20 (3), 173-174 (2021).</li>
<li>Ylä-Herttuala, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endgame%3A+glybera+finally+recommended+for+approval+as+the+first+gene+therapy+drug+in+the+European+union%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%3A+The+Journal+of+the+American+Society+of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Endgame: glybera finally recommended for approval as the first gene therapy drug in the European union.</a> Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 20 (10), 1831-1832 (2012).</li>
<li>FDA approves novel gene therapy to treat patients with a rare form of inherited vision loss. FDA News Release. FDA. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-novel-gene-therapy-treat-patients-rare-form-inherited-vision-loss">https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-novel-gene-therapy-treat-patients-rare-form-inherited-vision-loss</a> (2020).</li>
<li>FDA approves innovative gene therapy to treat pediatric patients with spinal muscular atrophy, a rare disease and leading genetic cause of infant mortality. FDA News Release. FDA. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-innovative-gene-therapy-treat-pediatric-patients-spinal-muscular-atrophy-rare-disease">https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-innovative-gene-therapy-treat-pediatric-patients-spinal-muscular-atrophy-rare-disease</a> (2020).</li>
<li>Statement from FDA Commissioner Scott Gottlieb, MD and Peter Marks, MD Ph.D., Director of the Center for Biologics Evaluation and Research on new policies to advance development of safe and effective cell and gene therapies. FDA. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/statement-fda-commissioner-scott-gottlieb-md-and-peter-marks-md-phd-director-center-biologics">https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/statement-fda-commissioner-scott-gottlieb-md-and-peter-marks-md-phd-director-center-biologics</a> (2020).</li>
<li>Asokan, A., Schaffer, D. V., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+AAV+vector+toolkit%3A+poised+at+the+clinical+crossroads%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%3A+The+Journal+of+the+American+Society+of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">The AAV vector toolkit: poised at the clinical crossroads.</a> Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 20 (4), 699-708 (2012).</li>
<li>Rose, J. A., Hoggan, M. D., Shatkin, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+from+an+adeno-associated+virus%3A+chemical+and+physical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid from an adeno-associated virus: chemical and physical studies.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 56 (1), 86-92 (1966).</li>
<li>Lusby, E., Fife, K. H., Berns, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+sequence+of+the+inverted+terminal+repetition+in+adeno-associated+virus+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Nucleotide sequence of the inverted terminal repetition in adeno-associated virus DNA.</a> Journal of Virology. 34 (2), 402-409 (1980).</li>
<li>Masat, E., Pavani, G., Mingozzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humoral+immunity+to+AAV+vectors+in+gene+therapy%3A+challenges+and+potential+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Discovery+Medicine%22%5BJournal%5D)">Humoral immunity to AAV vectors in gene therapy: challenges and potential solutions.</a> Discovery Medicine. 15 (85), 379-389 (2013).</li>
<li>Ling, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Transgene+Expression+from+Recombinant+Single-Stranded+D-Sequence-Substituted+Adeno-Associated+Virus+Vectors+in+Human+Cell+Lines+In+Vitro+and+in+Murine+Hepatocytes+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Enhanced Transgene Expression from Recombinant Single-Stranded D-Sequence-Substituted Adeno-Associated Virus Vectors in Human Cell Lines In Vitro and in Murine Hepatocytes In Vivo.</a> Journal of Virology. 89 (2), 952-961 (2014).</li>
<li>Cathomen, T., Stracker, T. H., Gilbert, L. B., Weitzman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+screen+identifies+a+cellular+regulator+of+adeno-associated+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A genetic screen identifies a cellular regulator of adeno-associated virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (26), 14991-14996 (2001).</li>
<li>McCarty, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-complementary+AAV+vectors%3B+advances+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Self-complementary AAV vectors; advances and applications.</a> Molecular Therapy. 16 (10), 1648-1656 (2008).</li>
<li>Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+transduction+efficiency%2C+tropism+and+axonal+transport+of+aav+serotypes+1%2C+2%2C+5%2C+6%2C+8+and+9+in+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of aav serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the mouse brain.</a> PLOS One. 8 (9), 76310(2013).</li>
<li>Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+AAV+serotypes+1-9+mediated+gene+expression+and+tropism+in+mice+after+systemic+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection.</a> Molecular Therapy. 16 (6), 1073-1080 (2008).</li>
<li>Pillay, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+%28AAV%29+serotypes+have+distinctive+interactions+with+domains+of+the+cellular+AAV+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus (AAV) serotypes have distinctive interactions with domains of the cellular AAV receptor.</a> Journal of Virology. 91 (18), (2017).</li>
<li>Merkel, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trafficking+of+adeno-associated+virus+vectors+across+a+model+of+the+blood-brain+barrier%3B+a+comparative+study+of+transcytosis+and+transduction+using+primary+human+brain+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Trafficking of adeno-associated virus vectors across a model of the blood-brain barrier; a comparative study of transcytosis and transduction using primary human brain endothelial cells.</a> Journal of Neurochemistry. 140 (2), 216-230 (2017).</li>
<li>van Lieshout, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+triple-mutant+AAV6+capsid+induces+rapid+and+potent+transgene+expression+in+the+muscle+and+respiratory+tract+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy.+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">A novel triple-mutant AAV6 capsid induces rapid and potent transgene expression in the muscle and respiratory tract of mice.</a> Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 9, 323-329 (2018).</li>
<li>Wu, Z., Asokan, A., Grieger, J. C., Govindasamy, L., Agbandje-McKenna, M., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((single+amino+acid+changes+can+influence+titer%2C+heparin+binding%2C+and+tissue+tropism+in+different+adeno-associated+virus+serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">single amino acid changes can influence titer, heparin binding, and tissue tropism in different adeno-associated virus serotypes.</a> Journal of Virology. 80 (22), 11393-11397 (2006).</li>
<li>Liu, J., Moon, Y. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+purification+of+adeno-associated+virus-DJ+for+liver-specific+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Yonsei+Medical+Journal%22%5BJournal%5D)">Simple purification of adeno-associated virus-DJ for liver-specific gene expression.</a> Yonsei Medical Journal. 57 (3), 790-794 (2016).</li>
<li>Grimm, D., Kern, A., Rittner, K., Kleinschmidt, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+tools+for+production+and+purification+of+recombinant+adeno-associated+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Novel tools for production and purification of recombinant adeno-associated virus vectors.</a> Human Gene Therapy. 9 (18), 2745-2760 (1998).</li>
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<li>Aurnhammer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+real-time+PCR+for+the+detection+and+quantification+of+adeno-associated+virus+serotype+2-derived+inverted+terminal+repeat+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy+Methods%22%5BJournal%5D)">Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences.</a> Human Gene Therapy Methods. 23 (1), 18-28 (2012).</li>
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 <a target="_blank" href="http://www.thermofisher.com/ca/en/home/brands/thermo-scientific/molecular-biology/molecular-biology-learning-center/molecular-biology-resource-library/thermo-scientific-web-tools/qpcr-efficiency-calculator.html">http://www.thermofisher.com/ca/en/home/brands/thermo-scientific/molecular-biology/molecular-biology-learning-center/molecular-biology-resource-library/thermo-scientific-web-tools/qpcr-efficiency-calculator.html</a> (2021).</li>
<li>Lamb, R. A., Kolakofsky, D. Paramyxoviridae: The viruses and their replication. Fields Virology. , Available from: 
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<li>Boussif, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+vector+for+gene+and+oligonucleotide+transfer+into+cells+in+culture+and+in+vivo%3A+polyethylenimine%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (16), 7297-7301 (1995).</li>
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<li>Burnham, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+ultracentrifugation+as+an+approach+to+characterize+recombinant+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy+Methods%22%5BJournal%5D)">Analytical ultracentrifugation as an approach to characterize recombinant adeno-associated viral vectors.</a> Human Gene Therapy Methods. 26 (6), 228-242 (2015).</li>
<li>Dobnik, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+quantification+and+characterization+of+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Accurate quantification and characterization of adeno-associated viral vectors.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1570(2019).</li>
<li>Backovic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capsid+protein+expression+and+adeno-associated+virus+like+particles+assembly+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Capsid protein expression and adeno-associated virus like particles assembly in Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbial Cell Factories. 11, 124(2012).</li>
</ol>

サラ・K・ウートンは、AAV6.2FFキャプシドの米国特許US10806802B2の発明者です。

本論文で説明する組換えAAV(rAAV)ベクターの製造は、分子生物学の研究室や施設の大部分に見られる一般的な材料、試薬、および装置を使用しています。本論文は、高品質 のインビトロ および インビボ グレードrAAVを読者が生産することを可能にする。とりわけ、rAAV製造のためのこのプロトコルは、塩化セシウム精製を含むより退屈なプロトコルと比較して、効率的であり、超遠心分離の使用を回避する。HEK293細胞がトランスフェクションされると、精製されたAAVは5営業日以内に使用する準備ができています。
rAAVの製造および精製プロセスの間に、多くのステップは、ベクターの純度および最終力剤に影響を与えることができます。最初の最も重要なステップは、HEK293細胞の健康であり、これはベクター力素に直接影響を及ぼします。HEK293細胞のような他の細胞タイプまたはシステムとは対照的にHEK293細胞を使用することは、HEK293細胞が絶え間ない細胞増殖のための堅牢な細胞ネットワークを作り出すプレートおよび細胞のプラスチックコーティングに付着する能力が高い点で...

アデノ関連ウイルス(AAV)ベクターを利用した遺伝子治療は、過去30年間で大きく進歩した1,2.先天性失明、血友病、および筋骨格系および中枢神経系の疾患を含む多様な遺伝性疾患の改善を実証し、AAV遺伝子治療を臨床研究の最前線に持ち込んだ3,4。2012年、欧州医薬品庁(EMA)は、LPL欠損症の治療のためにリポタンパク質リパーゼ(LPL)を発現するAAV1ベクターであるグリベラを承認し、欧州または米国のいずれかで遺伝子治療のための最初のマーケティング承認を受けました。それ以来、2つのAAV遺伝子治療、Luxturna6とZolgensma7は、FDAの承認を受けており、市場は2025年までに10〜20の遺伝子治療が予想され、今後5年間で急速に拡大すると予想されています 8.利用可能な臨床データは、AAV遺伝子治療が安全で、十分に許容され、有効性のあるモダリティであり、最も有望なウイルスベクターの1つであり、244以上の臨床試験が ClinicalTrials.gov に登録されていることを示しています。AAVベクターを含む臨床応用への関心の高まりは、大規模な動物モデルにおけるAAV療法の評価を容易にするために、堅牢でスケーラブルな生産方法を必要とします。
AAVベクターの生産の場合、2つの主な要件は、AAVゲノムとキャプシドです。野生型(wt)-AAVのゲノムは、長さ約4.7kbの一本鎖DNAである。wt-AAVゲノムは、ゲノムの両端に見られる反転末端反復(ITR)を含み、これは、包装にとって重要であり、repおよびcap遺伝子11とを含む。Repおよびcap遺伝子は、ゲノム複製に必要な、ウイルスキャプシドの組み立て、およびゲノムをウイルスキャプシドにカプセル化し、ウイルスゲノムから除去され、AAVベクター産生12のためのトランスで提供される。ウイルスゲノムからこれらの遺伝子を除去することにより、治療的トランス遺伝子およびプロモーターおよびポリAシグナルを含むすべての必要な調節要素の余地を提供する。ITRは、適切なゲノム複製およびウイルスカプセル化13、14を確実にするために、ベクターゲノムに残る。遺伝子導入発現の動態を改善するために、AAVベクターゲノムは自己相補的に設計することができ、AAVゲノム複製中の一本鎖から二本鎖DNA変換への変換の必要性を軽減するが、コーディング能力は〜2.4kb15に低下する。
AAVゲノム設計を超えて、カプシド血清型選択は、生体内2におけるAAVベクターの組織および細胞のトロピズムを決定する。組織トロピズムに加えて、異なるAAV血清型が異なる遺伝子発現動態16を示すことを示している。例えば、ジンガレッリら17は、異なるAAV血清型を低発現血清型(AAV2、3、4、5)に分類し、中程度の発現血清型(AAV1、6、8)、および高発現血清型(AAV7および9)を分類する。また、AAV血清型を遅発式(AAV2、3、4、5)または急速発症発現(AAV1、6、7、8、および9)に分類した。これらの異なる対流動性および遺伝子発現動態は、カプシドタンパク質におけるアミノ酸の変化、カプシドタンパク質形成、および宿主細胞受容体/共受容体18との相互作用によるものである。一部のAAVカプシドは、血管内投与後に血液脳関門を越える能力(AAV9)または持続性トランスジーン発現用の長生き筋細胞(AAV6、6.2FF、8、および9)19、20などの付加的な有益な特徴を有する。
本論文は、前臨床前の大型動物モデルで使用するための高純度、高力価、研究グレードのAAVベクターを製造するための費用対効果の高い方法を詳述することを目的とする。このプロトコルを用いたAAVの生産は、細胞スタックで増殖した接着ヒト胚性腎臓(HEK)293細胞へのデュアルプラスミドトランスフェクションを使用して達成される。さらに、この研究は、ヘパリン硫酸親和性クロマトグラフィー精製のプロトコルを記述し、AAV2、3、6、6.2FF、13、およびDJ21、22を含むヘパリン結合ドメインを含むAAV血清型に使用することができる。
AAV ベクターの製造には、多数のパッケージング システムが用意されています。これらの中で、RepおよびCap遺伝子およびアドヘルパー遺伝子(E1A、E1B55K、E2A、E4orf6、およびVA RNA)が1つのプラスミド(pHelper)内に含まれる2プラスミド共トランスフェクションシステムの使用は、一般的な3種プラスミド(トリプル)トランスフェクション方法よりも実用的な利点を有する24000年2400年の産生に対するコストの削減を含む。.遺伝子導入発現カセット(pTransgene)を含むAAVゲノムプラスミドは、ITRによって横にされ、かつ、〜4.7kbの長さを超えてはなりません。ベクター力差および純度は、トランスフェクション中の細胞傷害作用の可能性に起因するトランスジーンの影響を受ける可能性がある。ベクター純度の評価は、本明細書に記載される。この方法を用いて産生されたベクターは、それぞれ1x10 13 vg/mLを生み出し、マウス、ハムスター、およびオビン動物モデルで評価した。
表1: 必要なソリューションの構成プロトコル全体でさまざまなソリューションに必要なコンポーネントの割合やボリュームなどの必要な情報。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62727/Table%201-%2062727_R2.xlsx" target="_blank">このテーブルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

<table><tbody><tr><td>0.22 以上 μ;mフィルター</td><td>ミリポアシグマ</td><td>S2GPU05RE</td><td></td></tr><tr><td>0.25%トリプシン</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>SM2001C</td><td></td></tr><tr><td>1-ブタノール</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A399-4</td><td>注意。層流フードの下で使用します。手袋を着用してください</td></tr><tr><td>10チャンバーセルスタック</td><td>Corning</td><td>3271</td><td></td></tr><tr><td>1L PETGボトル</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>2019-1000</td><td></td></tr><tr><td>30%アクリルアミド/ビス溶液</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1610158</td><td></td></tr><tr><td>96ウェルスカートプレート</td><td>FroggaBio</td><td>FS-96</td><td></td></tr><tr><td>粘着プレートシール</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>08-408-240</td><td></td></tr><tr><td>過硫酸アンモニウム (APS)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0700</td><td>注意.層流フードの下で使用します。手袋を着用</td></tr>してください <tr><td>血液と組織クリーンアップキットQiagen</td><td></td><td>69506</td> プロトコルブロモフェノールブルーフィッシャーサイエンティフィックB392-5注意<td>のセクション4.6でDNAクリーンアップに使用します</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>。層流フードの下で使用します。手袋を着用してください</td></tr><tr><td>細胞培養皿</td><td>Greiner bio-one</td><td>7000232</td><td>15 cm プレート</td></tr><tr><td>培養コニカルチューブ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>339650</td><td>15 mL コニカルチューブ</td></tr><tr><td>培養コニカルチューブ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14955240</td><td>50 mL コニカルチューブ</td></tr><tr><td>ダルベッコのモディファイドイーグルミディアム (DMEM) with 1000 mg/L D-グルコース、L-グルタミン</td><td>Cytiva ライフサイエンス</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>ECL Western Blotting Substrate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>32209</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>グリーンフィールド</td><td>P016EA95</td><td>希エチルアルコール(95% vol) をセクション 3.7.4 で 20%、セクション 6.1.1.1 で 70%</td></tr> ウ<tr><td>シ胎児血清 (FBS)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>氷酢酸</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A38-500</td><td>注意。層流フードの下で使用します。手袋を着用してください</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>グリシン</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>BP381-500</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (Mg2+ および Ca2+</td>サー<td>モフィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>SH302268.02</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (Mg2+ および Ca2+</td>サー<td>モフィッシャーサイエンティフィック</td><td>SH30588.02</td><td></td></tr><tr><td>HEK293細胞</td><td>アメリカ組織培養コレクション</td><td>CRL-1573</td><td>受領後、メーカーに記載されているように細胞と培養を解凍しますのプロトコル。細胞の継代が最小限に抑えられ、順調に成長したら、将来のためにサブフラクションをアリコートで凍結し、液体窒素で保存します。常に継代番号30より下のセルを使用してください。培養細胞を30回以上継代した後は、保存されているアリコート</td></tr><tr><td>HEK293宿主細胞タンパク質ELISAキット</td>から培養を再開することをお勧めします <td>Cygnus Technologies</td><td>F650S</td><td>メーカーのs instructions</td></tr><tr><td>ヘパリン硫酸塩カラム</td><td>Cytiva Life Sciences</td><td>17040703</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>KC34120</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;L-グルタミン (200 mM)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>SH30034.02</td><td></td></tr><tr><td>大容量遠心分離チューブ サポートクッション</td><td>コーニング</td><td>CLS431124</td><td>サポートクッションは、遠心分離機ローターが適切なVボトムクッションを持っている場合を除き、大容量遠心チューブで使用する必要があります</td></tr><tr><td>大容量遠心チューブ</td><td>コーニング</td><td>CLS431123-6EA</td><td>500 mL 遠心分離チューブ</td></tr><tr><td>MgCl2&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>7791-18-6</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ遠心チューブ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>05-408-129</td><td>1.5 mL マイクロ遠心チューブ、使用前に滅菌</td></tr><tr><td>モレキュラーグレード ウォーター</td><td>Cytiva ライフサイエンス</td><td>SH30538.03</td><td></td></tr><tr><td>N-ラウロイルサルコシンナトリウム塩</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>L5125</td><td>注意。手袋を着用する</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>BP35810</td><td></td></tr><tr><td>オプティメム、減量血清中</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>パスツールピペット</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>13-678-20D</td><td>使用前に滅菌</td></tr><tr><td>する PBS(10x)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>70011044</td><td>細胞に使用するために1倍に希釈します</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン溶液</td><td>Cytiva Life Sciences</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>pHelper プラスミド</td><td>De novo 設計またはプラスミドリポジトリから取得</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>ピペット盆地</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>13-681-502</td><td>滅菌ピペット盆地を購入</td></tr><tr><td>ポリエチレングリコール tert-オクチルフェニルエーテル (トリトン X-100)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>9002-93-1</td><td>注意。手袋を着用する</td></tr><tr><td>ポリエチレンイミン(PEI)</td><td>Polyscience</td><td>24765-1</td>メーカー<td>をフォローしてください'1L溶液を生成するための指示。0.22&mu;mフィルターと4°Cで保存します。C</td></tr><tr><td>ポリプロピレンセミスカートPCRプレート</td><td>FroggaBio</td><td>WS-96</td><td></td></tr><tr><td>ポリソルベート 20 (Tween 20)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP337-100</td><td>注意。手袋を着用する</td></tr><tr><td>ポリフッ化ビニリデン(PVDF)膜</td><td>Cytiva Life Sciences</td><td>10600023</td><td>鉗子を使用して操作します。手袋を着用してください。</td></tr><tr><td>一次抗体</td><td>Progen</td><td>65158</td><td></td></tr><tr><td>Protein Ladder</td><td>FroggaBio</td><td>PM008-0500</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM2546</td><td></td></tr><tr><td>pTrangene プラスミド</td><td>De novo デザインまたはプラスミドリポジトリから取得</td><td>NA</td> セクション<td>5.0のAAV滴定と互換性があるためには、ゲノムにSV40 polyAが含まれている必要があります</td></tr><tr><td>ポンプチューブ</td><td>コールパーマー</td><td>RK-96440-14</td><td>チューブの長さを最適化し、フラクションE1-E5</td></tr><tr><td>RQ1 Dnase 10 反応バッファー</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td>セクション4.0</td></tr><tr><td>RQ1 RnaseフリーDnase</td><td></td><td>Promega M6101</td><td></td></tr><tr><td>サンプル希釈剤</td><td>Cygnus Technologies</td><td>I700</td><td>HEK293ホスト細胞タンパク質ELISAキット</td></tr><tr><td>で使用するために別途購入する必要があります二次抗体、HRP</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>G-21040</td><td></td></tr><tr><td>スキムミルク</td> オ<td>キソイド</td><td>LP0033B</td><td></td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>28312</td><td>注意。層流フードの下で使用します。手袋を着用してください</td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム(NaOH)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>SS266-4</td><td></td></tr><tr><td>SV40 polyAプライマープローブ</td><td>IDT</td><td></td><td>表Xの配列を使用して、合成のためにIDTから引用します</td></tr><tr><td>テトラメチルエチレンジアミン(TEMED)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15524010</td><td>注意。層流フードの下で使用します。手袋を着用してください</td></tr><tr><td>トリスベース</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>トリパンブルー</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1450021</td><td></td></tr><tr><td>ウルトラフィルター</td><td>ミリポア シグマ</td><td>UFC810024</td><td>ウルトラ4 遠心 10K デバイスは、</td></tr><tr><td>細胞溶解用の分子量カットオフ ユニバーサルヌクレアーゼ</td>を備えているため、使用する必要があります <td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>88702</td><td></td></tr><tr><td>ユニバーサル qPCR マスターミックス</td><td>NEB</td><td>M3003L</td><td></td></tr><tr><td>Whatman ペーパー</td><td>ミリポア シグマ</td><td>WHA1001325</td><td></td></tr><tr><td>&β;-メルカプトエタノール</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>21985023</td><td>注意。層流フードの下で使用します。手袋を着用</td></tr>してください<tr><td>注意:&nbsp;危険な化学物質の使用に関するガイドラインについては、材料表を参照してください。</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

大型動物モデルにおける前臨床試験のための細胞スタックにおけるアデノ関連ウイルスベクターの生成

Production of Adeno-Associated Virus Vectors in Cell Stacks for Preclinical Studies in Large Animal Models

アデノ関連ウイルス(AAV)ベクターは、ヒトに対して承認された3つのAAV遺伝子治療を有する、最も臨床的に進行した遺伝子治療ベクターの一つです。AAVの新しいアプリケーションの臨床進歩は、マウスなどの小さな動物モデルから、犬、羊、非ヒト霊長類を含むより大きな動物モデルへの移行を伴う。AAVを大型動物に投与する際の制限の1つは、大量の高い抗長ウイルスの要件である。懸濁細胞培養はAAVベクター産生のためのスケーラブルな方法であるが、いくつかの研究ラボは、装置(例えば、バイオリアクター)を有するか、またはこの方法でAAVを生成する方法を知っている。また、AAV価は、接着性HEK293細胞と比較して、HEK293細胞の懸濁液で産生される場合に有意に低いことが多い。ここで説明する、セルスタックを用いて大量の高力素AAVを製造する方法を説明する。AAV を引き起す詳細なプロトコルと、ベクター純度を検証する方法についても説明します。最後に、羊モデルにおけるAAV媒介トランスジーン発現の代表結果を提示する。この最適化されたAAVベクターを接着細胞で大規模に生産するためのプロトコルは、分子生物学の研究室が、より大きな動物モデルにおける新しいAAV療法の試験を進めることを可能にする。

小さなげっ歯類モデルから大型動物モデルへの翻訳と最終的な臨床応用は、大きな動物をトランスデュースし、治療効果を達成するために必要な大量のAAVに大きな課題を提示します。合理的に設計されたAAV6.2FFキャプシドの導入効率を比較するために、以前はAAV63と比較してマウス筋細胞における導入効率の101倍の増加を実証し、マウス、ハムスター、および子羊はすべてヒトモノクローナル抗体(hIgG)を発現するAAV6.2FFを投与した。AAV6.2FF-hIgG発現ベクターには、CASIプロモーター4、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素(WPRE)、およびSV40ポリA配列が含まれていた。6週齢の雌BALB/c(n=4)マウスを40μLでAAV6.2FF-hIgGの1 x 10 11vgを1 x10 11vg投与し、hIgGモニタリングのためのAAV投与後0日目、7日、14日、21日、28日目に血液を採取した。生後4週間のシリアのハムスター(女性2人と男性2人)は、40μLでAAV6.2FF-hIgGの1 x10 ...

ここでは、細胞スタックで増殖した付着HEK 293細胞とアフィニティークロマトグラフィー精製を用いた研究用AAVベクターの大規模生産に関する詳細な手順を提供する。このプロトコルは一貫して>1 x 1013 のベクターゲノム/mLを生成し、大規模な動物実験に適したベクター量を提供する。

Adeno-associated virus (AAV) vectors are among the most clinically advanced gene therapy vectors, with three AAV gene therapies approved for humans. ...

AAVウイルスベクターの生産のためのこのプロトコルは、費用対効果が高く、前臨床、大規模な動物モデルでの使用のための高純度、高価価物、研究グレードAAVをもたらす。この技術は、細胞培養チャンバーに付着性HEK293細胞を使用し、時間効率が良く、実践的に少なく、細胞への破壊を減らすことを可能にする。このプロトコルは、遺伝子治療の分野のためのウイルスベクター産生に大いに役立ち、またヘパラン硫酸に結合する他のAAV血清型の産生に使用することができる。開始するには、80%合流に達したときに培養液からHEK293細胞を採取する。PBSを3ミリリットルで細胞培養板を静かに洗浄する前に培地を吸引する。その後、PBSを吸引し、トリプシンの3ミリリットルを追加します。プレートを摂氏37度で2分間インキュベートします。インキュベーション後、トリプシンを中和し、プレートに完全DMEMの7ミリリットルを加え、50ミリリットル円錐形チューブに上清を集める。細胞が均質であることを確認するために、チューブを穏やかに反転させます。細胞密度を決定するには、細胞サンプルの10マイクロリットルを10マイクロリットルのトリパンブルーと混合します。そして、セルカウンターで分析するためにセルカウントスライドに混合物を追加します。培養チャンバーを見るために、予め温めた完全なDMEMの1リットルと細胞懸濁液を混合する。チャンバーをそっと回転させて細胞を均等に分配します。5%の二酸化炭素で37°Cでチャンバーをインキュベートします。細胞培養チャンバーに加えて、培養細胞は10〜4センチメートルの培養細胞を合流性の基準として15センチメートルのプレートに2乗した。65時間のインキュベーション後、細胞が80〜90%コンフルエントである場合、ポリエチレンイミン-DNAとDMEM混合物を細胞培養チャンバーポートにゆっくりと加える。液体を摂氏37度でインキュベートする前にすべての列に均等に分配し、72時間の二酸化炭素を5%ずつ分配します。インキュベーション後、細胞培養チャンバーを激しく振って、媒体が濁って見えるまで細胞を外し、4または500ミリリットルの遠心分離管に注ぎます。細胞を摂氏4度で30分間18,000倍Gで遠心分離してペレットする。明確化した上清を1リットルのPETGボトルに注ぎ、500ミリリットル遠心分離管で50ミリリットルの認可されたバッファーで細胞ペレットを再懸濁します。37°Cで60分間チューブをインキュベートします。インキュベーション後、チューブを18,000倍Gで30分間遠心し、上清を同じ1リットルPETGボトルに移します。マイナス80度で保管してください。粗いライセートを一晩摂氏4度で解凍します。解凍したら、0.22ミクロンフィルタを使用してフィルタリングします。精製ステップの直前に、使用されている各ヘパリン-セファローズカラムに4ミリリットルのフィルター前処理バッファーを加えて遠心濃縮器をパッシベーションします。チューブを蠕動ポンプに入れる。ソリューションとメディアを順次実行します。5ミリリットルのヘパリン-セファローズカラムをチューブに取り付け、カラムを通して25ミリリットルのBazell DMEMを実行してクロマトグラフィーの準備をします。その後、濾過された粗いライセートの0.2マイクロモルを1秒あたり1〜2滴の流量でカラムに積み込みます。カラムを順次洗浄して、塩化ナトリウムHBSSの300ミリモル、マグネシウム、カルシウムで5ミリリットルを5回溶出し、5つの溶出物をE1〜E5とラベル付けします。準備ができたら、前処理バッファーを含む遠心濃縮器を 900 回 G で 2 分間回転させます。フロースルーを破棄します。遠心濃縮器フィルターを4ミリリットルのHBSSでマグネシウムとカルシウムで洗浄し、Gを1000倍2分間回転させます。次に、遠心濃縮器に溶出E2を加え、Gの1000倍で5分間回転します。フロースルーを破棄します。同様に、溶出E3を遠心濃縮器に回し、濃縮ウイルスが約1ミリリットルになるまで回転させる。P200フィルターチップを使用して遠心濃縮器から濃縮ウイルスを除去し、滅菌1.5ミリリットル遠心分離管に集める。ウイルスの採取後、遠心濃縮器を200マイクロリットルのHBSSでマグネシウムとカルシウムで洗浄します。ピペットは、膜に付着したウイルスを取り除くために30秒間激しく上下し、同じ1.5ミリリットル遠心管に濃縮ウイルスを集める。チューブをよく混ぜます。カラムを洗い、摂氏4度で保存する前に20%エタノールで飽和させます。ポンプチューブを1モル水酸化ナトリウムに保管します。AAV6.2FFカプシドの導入効率を、筋肉内投与時に28日間マウス、ハムスター、およびラムで比較した。マウスは、AAV6.2FFヒトIgGの1キログラム当たり12番目のベクターゲノムに10回10回投与し、血清中のヒトIgGのミリリットル当たり171〜237マイクログラムの間で発現した。ハムスターは、AAV6.2FFヒトIgGの1キログラム当たり13番目のベクターゲノムの2倍10〜13番目のベクターゲノムで投与され、マウスよりもヒトIgGのレベルがはるかに高く発現した。一方、大型動物モデルは、血漿中のヒトIgGレベルの1ミリリットル当たり平均35マイクログラムを発現することができた。大型動物モデルは、In vivoにおけるAAVトランスジーンの発現を決定し、そして、トランス遺伝子が目的の障害または疾患に対して治療効果を有するかどうかを決定することができる。この研究は、骨格筋における新しいAAV 6血清型ベクターであるAAV6.2FFの偉大な形質導入能力と、生体内でのAAVウイルスベクターの低免疫原性を示した。

production-adeno-associated-virus-vectors-cell-stacks-for-preclinical

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

組換えアデノ随伴ウイルス（rAAVs）ベクトルはのためにますます貴重になってきています...

組換えアデノ随伴ウイルスベクターの産生と力価測定

我々は分子DNAファミリーシャフリングを介して合成アデノ随伴ウイルス（AAV）の遺伝子治療ベクターを設計し、進化するための基本的なテクニックを示しています。さらに、一般的なガイドラインや文化やマウスの標的細胞上の強化されたプロパティを持つ個々のキメラキャプシドの選択と分析のための代表的な例を提供しています。...

シャッフルDNAファミリーを経由して合成アデノ随伴ウイルス（AAV）遺伝子治療ベクターのエンジニアリングと進化

Source: Ehrke-Schulz, E., et al. Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the large-scale amplification of high-capacity adenoviral vectors in suspension-adapted human embryonic kidney cells expressing Cre recombinase for use in gene delivery applications requiring high-titer, helper-free vector preparations.

Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors 

ここでは、生成する効率的かつ再現性のある戦略、力価、およびアデノ随伴ウイルスベクターの品質管理バッチについて述べる。それは高価にベクトル準備を取得するユーザーをことができます (1013ベクトル ゲノム/mL x ≥ 1)...

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本稿では、マウスの眼組織に対する有効なベクター送達法として、輸液/離脱シリンジポンプと気密着式シリンジとマイクロインジェクション針を組み合わせた注射システムを用いて結膜下注射を実証しています。この注射システムは、他の眼内投与経路にも適応可能である。...

小動物モデルにおけるアデノ随伴ウイルスベクターの結膜下投与

ここでは、懸濁液HEK293細胞ベースのAAV生産プロトコルを提示し、その結果、商用ベンダーから研究目的で入手可能なコンポーネントを使用してベクターを生産するために必要な時間と労力を削減します。...

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遺伝子治療の分野が進化し続ける中、これらの課題に対処できる革新的な方法の必要性が高まっています。ここでは、細胞工場プラットフォームを使用して高収量で高純度のAAVベクターを生成するプロセスを効率化し、 in vivo...

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海洋および淡水系におけるウイルスの離職率は低下し、再発の手法によって推定することができる。データは、研究者は、水系におけるウイルス媒介微生物の死亡率を推測することができます。...

水系でのウイルス産生率を予測

実験用ラットとマウスにおけるエクト - とEndoparasitesの診断

学ぼう、HEK293細胞を用いた高純度・高力価AAVベクター製造法。接着性細胞培養チャンバーを活用した効率的な遺伝子治療用ウイルスベクター生産プロトコルで、前臨床大型動物モデル研究に貢献します。

大型動物モデルにおける前臨床試験のための細胞スタックにおけるアデノ関連ウイルスベクターの生成

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