足骨造茎および前駆細胞株における短いヘアピンRNA媒介遺伝子ノックダウンによる樹状細胞の発達に関する研究
2022年3月7日
ここでは、shRNAのレンチウイルス伝達を用いて樹状細胞(DC)の開発に関与する潜在的な転写因子をスクリーニングするためのプロトコルを提供し、 インビトロ DC分化のための安定したノックダウン細胞株を得る。
樹状細胞、またはDCは、先天性および適応免疫系を結びつける重要な免疫細胞である。DCは異種ですが、この方法は、転写因子を含むどの遺伝子がDCの発達を調節するかを理解するのに役立ちます。この技術は、インビトロの前駆物質からDCの発達を制御する遺伝子を同定する簡単かつ迅速な方法を提供する。
まず、不死化造血幹細胞および前駆細胞またはiHSpcsを完全なRPMI 1640培地で維持し、FLT3リガンドの1ミリリットル当たり100ナノグラムおよび1マイクロモルベータエストラジオールを添加する。レンチウイルス伝達の場合、iHSPCsを12ウェルプレートに10~5番目の細胞の密度でプレートし、FLT3リガンド、ベータエストラジオール、ポリブレンを含む完全な培地を1ミリリットルずつプレートします。次いで、100の感染の多重度で各ウェルに短いヘアピンRNAを運ぶレンチウイルスを加える。
次に、プレートを1100倍gと37度で90分間回転させ、感染した細胞を摂氏37度で一晩インキュベートします。翌日、遠心分離で細胞を15ミリリットルのチューブに集めてポリブレンを取り除き、FLT3リガンドおよびβエストラジオールを含む新鮮な完全培地に培地を置き換える。さらに24時間後、ミズにピューロマイシン1ミリリットル当たり6マイクログラムを加えて、感染した細胞を選択します。
3日ごとに選択培地を交換し、少なくとも1週間は細胞を維持して安定して導入されたiHSPを拡大します。FLT3リガンドとベータエストラジオールを添加した完全培地で、LacZ、Tcf4、およびId2の安定したノックダウンiHSPCsを生成し維持します。インビトロ分化を開始するには、未分化iHSPを15ミリリットルのチューブに集め、遠心分離によって細胞をペレットにする。
遠心分離後、上清を捨て、10ミリリットルのPBSで細胞を2回洗います。2回目の洗浄後、FLT3リガンドのみを含む完全な培地で細胞を再懸濁し、1ミリリットル当たりの10分の2の密度で播種し、12ウェルプレートに入れます。3日後、FLT3リガンドを含む新鮮な完全培地を1ミリリットル加える。
さらに2日後、フローサイトメトリーによる分化細胞の分析に進みます。フローサイトメトリック解析では、細胞をプレート内で2〜3回上下し、細胞を1.5ミリリットルのチューブに集めます。チューブを遠心分離し、上清を捨ててから、50マイクロリットルのファックスバッファーで細胞を再懸濁させます。
次に、抗CD16を32ハイブリドーマ上清で50マイクロリットル加え、氷上で5~10分間インキュベートする。次に、蛍光色素共役抗体を細胞に直接加え、暗闇の中で氷上で15分間インキュベートします。インキュベーション後、1ミリリットルのファックスバッファーで細胞を洗浄し、サンプルを遠心分離します。
遠心分離後、100マイクロリットルのファクスバッファーで細胞を再懸濁し、フローサイトメトリーでサンプルを分析します。iHSPCSにおけるLacZ、Tcf4、およびId2の短いヘアピンRNA媒介性ノックダウンの後、RTQ-PCRによるノックダウン効率の確認は、LacZノックダウンiHSPCsのそれと比較してTcf4およびTcf4ノックダウンiHSPCsの発現が減少したことを示した。同様の結果は、Id2ノックダウンiHSPでId2発現について観察された。
LacZノックダウンiHSPを5日間培養した後、樹状細胞集団を表すCD11c陽性細胞の頻度は約95%であったが、Tcf4またはId2をノックダウンするとCD11c陽性樹状細胞の生成がわずかに減少した。LacZノックダウンiHSPに由来するCD11c陽性樹状細胞のさらなる分析により、従来の樹状細胞は70%、22%が血漿細胞系樹状細胞であったことが明らかになった。Tcf4ノックダウンiHSPCsは、LacZノックダウン制御する血漿細胞樹状細胞の有意に低い割合を生成した。
対照的に、Id2ノックダウンiHSPCsは、LacZノックダウンコントロールよりも従来の樹状細胞の有意に低い割合を生成したが、血漿細胞細胞樹状細胞の割合が高い。スピン感染は、レンチウイルスを運ぶshRNAをiHSPCsに伝達する効率を高める。この技術は、転写因子の役割に対処し、DCの発達に関与する可能性が高いサイトカインシグナル伝達または代謝における他の遺伝子の研究を容易にする。
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概要
本記事では、shRNAのレンチウイルス導入により、樹状細胞（DC）の分化に影響を与える転写因子をスクリーニングするためのプロトコルを紹介します。この手法により、DCのin vitro分化のための安定的なノックダウン細胞株の作製が可能になります。
研究の主要構成要素
科学分野
- 免疫学
- 細胞生物学
- 転写調節
背景
- 樹状細胞は、自然免疫と獲得免疫を繋ぐ重要な役割を担っています。
- 樹状細胞の分化過程を理解することで、免疫応答に関する知見を得ることができます。
- 本研究では、樹状細胞の分化を制御する遺伝子の同定に焦点を当てています。
- 本手法では、不死化した造血幹細胞および前駆細胞を利用します。
研究の目的
- DC分化における転写因子のスクリーニングプロトコルを開発すること。
- 機能研究のための安定的なノックダウン細胞株を作成すること。
- 前駆細胞からのDCのin vitro分化を促進すること。
使用した方法
- 完全RPMI 1640培地でのiHSPCの維持。
- FLT3リガンドおよびβ-エストラジオールの添加。
- shRNAを用いたiHSPCへのレンチウイルス導入。
- 導入効率を向上させるためのポリブレンの使用。
主な結果
- 安定的なノックダウン細胞株の作製に成功。
- DC（樹状細胞）の分化に関与する転写因子の特定。
- in vitroにおける分化能の実証。
- 免疫細胞の分化における遺伝子制御に関する知見。
結論
- 本プロトコルは、DC分化を研究するための信頼性の高い手法を提供します。
- 免疫学における主要な調節遺伝子の同定に利用可能です。
- このアプローチにより、免疫応答への理解が深まる可能性があります。
よくある質問
業界における重要性
本手法により、樹状細胞の系譜決定における転写因子の機能を体系的に解析することが可能となり、免疫学に特化した創薬探索プログラムにおけるターゲットバリデーションを支援します。再現性のあるin vitroシステムを用いて遺伝的摂動と表現型出力を結びつけることで、初期段階のターゲット仮説におけるメカニズム的なリスク低減を実現します。このアプローチは、リソースを大量に消費するリード化合物同定に取り掛かる前に、免疫調節ターゲットの優先順位付けにおける予測精度を向上させます。
バイオ製薬R&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲット検証
- 科学的価値： 樹状細胞分化における潜在的な治療標的としての転写因子の機能解析を可能にする。
- 運用的価値： 不死化造血前駆細胞において、レンチウイルスshRNA導入を用いたノックダウンスクリーニングのためのスケーラブルなプラットフォームを提供する。
- 予測的価値： 標的の調節と樹状細胞サブセットの産出を関連付け、系統分化の偏向データに基づいたGo/No-Go判断を支援する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値：転写因子のノックダウン後におけるCD11c陽性細胞の定量的なフローサイトメトリー読み取り値およびサブセット分布（cDC対pDC）を算出する。
- 運用的価値：定義されたサイトカイン条件（FLT3リガンド、β-エストラジオール）およびピューロマイシンによる選択を用いた、標準化された分化アッセイを確立する。
- アッセイの準備状況：化合物スクリーニングやパスウェイ調節研究での繰り返し使用に適した、安定的なノックダウン細胞株を作製する。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 翻訳的価値：前駆細胞からの初期樹状細胞分化をモデル化し、転写因子ネットワークに関連したバイオマーカー戦略に知見を提供する。
- メカニズムによるリスク低減：常在性樹状細胞への運命決定を促進するId2の役割と、プラズマサイトイド樹状細胞の発生を支持するTcf4の役割を明確にする。
- 前臨床的整合性：ワクチンアジュバントや自己免疫疾患プログラムに関連する、免疫細胞分化に影響を与える標的の評価を支援する。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法はディスカバリー生物学の段階に適合し、リード同定のためのアッセイ開発に先立つ標的仮説の検証を可能にし、得られたデータは免疫調節における前臨床候補の選定に寄与します。
- 発見生物学：造血前駆細胞から樹状細胞への系統決定を制御する転写調節因子のメカニズム解析を支援します。
- アッセイ開発：分化効率およびサブセット分布をモニタリングするための、再現性と定量性のある免疫蛍光染色およびフローサイトメトリーのエンドポイントを構築します。
- 分析：ノックダウン条件下での比較を可能にし、標的の影響を統計的に評価するための定量的な読み取り値（CD11c+、cDC、pDCの割合）を提供します。
- トランスレーショナルリサーチ：初期前駆細胞の分化と下流の免疫機能を結びつけ、感染または免疫寛容における反応のモデリングに寄与します。
- エンタープライズ再利用：樹状細胞の発生に影響を与えるサイトカインシグナル伝達、代謝、または転写ネットワークに関わる追加遺伝子のスクリーニングに利用可能なプラットフォームを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：転写因子のノックダウンを樹状細胞サブセット生成の測定可能な変化に結び付けることで、ターゲットバリデーションの信頼性を向上させます。
- 運用上の価値：定義された培地条件と選択マーカーを通じて、研究室間での分化およびリードアウトプロトコルの標準化を可能にします。
- 戦略的価値：リネージ特異的な影響に関する早期の機能的根拠を提供することで、免疫調節ターゲット選択における生物学的リスクを低減します。
- ポートフォリオへの影響：樹状細胞の運命決定への影響に基づいた、リスク調整後のターゲット優先順位付けに情報を提供し、効率的なリソース配分を支援します。
実施上の検討事項
- レンチウイルス導入、造血細胞培養、およびフローサイトメトリーに関する専門知識が必要です。
- レンチウイルスshRNAライブラリ、ピューロマイシン選別、およびサイトカイン添加培地（FLT3リガンド、βエストラジオール）へのアクセスが必要です。
- 安定的なノックダウンを生成するために、導入効率（例：スピン感染による）および選別期間の標準化が必要です。
- フローサイトメトリーによる正確な樹状細胞サブセットの同定のため、分化タイミングおよび抗体パネルの最適化が必要です。
- in vitroモデルに限定されており、トランスレーショナルな妥当性を得るには、ヒトまたはマウスのプライマリーシステムでの検証が必要です。
バイオファーマFAQ
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:43
Preparation of Immortalized HematopoieticStem and Progenitor Cell (iHSPC) Lines and Lentiviral Transduction
2:08
In Vitro Differentiation of the Stable Knockdown iHSPC Cell Lines
3:05
Flow Cytometric Analysis of the Differentiated Dendritic Cells
4:01
Results: Dendritic Cell Differentiation Following Short Hairpin RNA-Mediated Tcf4 and Id2 Knockdown
5:33
Conclusion
