Name: 筋萎縮性側索硬化症のモデルにおけるシナプス機能のリアルタイム蛍光測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: 学ぶ シナプス機能のリアルタイム蛍光測定法を用いて、培養神経細胞におけるカルシウム動態とシナプス小胞放出を可視化する手法です。iPSC由来神経細胞や初代齧歯類皮質神経細胞を用いて、電気生理学的評価より短時間でシナプス機能の信頼性のある読み出しが可能となります。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ジェファーソン・ワインバーグALSセンターの現在および以前のメンバーの皆様には、これらの技術とその分析を最適化するための批判的なフィードバックと提案をお寄せいただき、誠にありがとうございます。この研究は、NIH(RF1-AG057882-01およびR21-NS0103118からD.T.まで)、NINDS(R56-NS092572およびR01-NS109150からP.P.まで)、筋ジストロフィー協会(D.T.)、ロバートパッカードALS研究センター(D.T.)、Family Strong 4 ALS財団、Farber Family Foundation(B.K.J.、K.K.、P.P.)からの資金提供によって支援されました。

著者らは、利益相反はないと宣言している。

記載されている両方の方法に共通する3つのステップは、実験の成功と定量化可能な結果にとって非常に重要です。まず、各実験ラウンドの前に新鮮なaCSFの調製が不可欠であり、添付の指示に従ってください。そうしないと、適切なニューロン脱分極を妨げる可能性があります。未処理の対照ニューロンのサンプルは、適切な細胞脱分極を確実にし、そのイメージングセッションで得られた肯定的な結果のベンチマークを提供するために、任意の実験群の刺激の前に絶えず試験されるべきである。第二に、特定のシナプス領域の蛍光を経時的に追跡することに成功するためには、モニタリングのために画像化パラメータおよびROIの領域を設定する際にも特別な注意が必要である。ベースライン期間記録は、直ちに刺激記録期間に移行するべきである。スチリル色素放出の単一崩壊ダイナミクスを捕捉するには、十分に速いフレームレート(2画像/秒)が必要です。最後に、実験の分析における重要なステップは、蛍光測定を最初にイメージングバックグラウンドに正規化し、次に事前刺激ベースラインに正規化することです。他の画像化プロトコルと同様に、ブランク画像化領域の減算は、KCl培地の添加によって導入され得るバックグラウンド自己蛍光...

実験室での筋萎縮性側索硬化症(ALS)のモデリングは、症例の80%以上が圧倒的に散発的な性質を持っている1と、疾患の原因であることが知られている膨大な数の遺伝子変異2のために、他に類を見ないほど困難になっています2。それにもかかわらず、ALSのすべての症例は、完全なニューロン変性の前に、シナプス前運動ニューロンとシナプス後筋細胞との間に機能不全のコミュニケーションがあるという統一的な特徴を共有しています3,4。臨床的には、患者が残りの上部および下部運動ニューロンの接続性を失うにつれて、それらは疾患全体にわたってニューロンの過興奮性および低興奮性の特徴を呈し5、6、7、8、9、これらのシナプスへの複雑な根底にある分子変化を反映しており、ALS研究者として理解しようとしている。
複数のトランスジェニックモデルが、SOD110、FUS11,12、C9orf7213、14、15、16、およびTDP4317,18,19を含むALS原因遺伝子変異の発現とともに神経筋接合部の劣化および解体が起こることを実証している。 シナプスブートン、脊椎密度、シナプス前/シナプス後組織の評価を含む形態学的評価を通じて。機構的には、1930年代にコール、ホジキン、ハクスリーの画期的な論文が発表されて以来、in vitro細胞培養または組織スライス調製物のいずれかにおいて、電気生理学的手法を通じてシナプス応答を評価することも可能であった20。これらの戦略を通じて、ALSの多くのモデルはシナプス伝達欠損を実証している。例えば、TDP43の変異変異体は、NSC-34(脊髄x神経芽腫ハイブリッド細胞株34)の運動ニューロン様細胞21において発火頻度を増強し、活動電位閾値を低下させる。この同じ変異はまた、マウスモデルにおける行動運動欠損の発症前に神経筋接合部(NMJ)で機能不全のシナプス伝達を引き起こす22。変異型FUS発現は、自発運動障害前のFUS-ALSのショウジョウバエモデルにおいてNMJにおけるシナプス伝達の減少をもたらすことが以前に示された11。C9orf72増殖キャリアに由来する誘導多能性幹細胞を用いた最近の報告は、シナプス小胞の容易に放出可能なプールの減少を明らかにした23。全体として、これらの研究や他の研究は、ALSの疾患関連モデルにおけるシナプスシグナル伝達の根底にあるメカニズムのより包括的な理解を構築することの重要性を強調しています。これは、ALSの病態生物学を理解し、患者のための潜在的な治療標的を開発する上で極めて重要である。
電流および電圧クランプ細胞の方法は、コンダクタンス、静止膜電位、および個々のシナプスの量子的含有量などの膜特性を決定する上で非常に貴重であった20,24。しかし、電気生理学の重大な限界の1つは、それが技術的に困難であり、一度に単一のニューロンからの洞察しか提供しないことです。生細胞共焦点顕微鏡は、特異的蛍光プローブと相まって、ニューロンのシナプス伝達を時空間的に調査する機会を提供する25,26,27。ニューロン興奮性の直接的な尺度ではないが、この蛍光アプローチは、シナプス機能の2つの分子相関、すなわちシナプス小胞放出およびシナプス末端におけるカルシウム過渡現象の相対的測定を提供することができる。
活動電位がニューロンのシナプス前終末領域に到達すると、カルシウム一過性が誘発され、電気信号から神経伝達物質放出の過程への移行が容易になる28。これらの領域に局在する電位依存性カルシウムチャネルは、カルシウムシグナル伝達を厳密に調節して、神経伝達物質放出の動態を調節する29。カルシウム過渡現象の最初に報告された蛍光ベースの記録は、二波長指示薬Fura-2 AMまたは単一波長色素Fluo-3 AM30、31、32のいずれかを使用して実施された。これらの色素は当時、大きな新しい洞察を提供していましたが、細胞内の非特異的な区画化、標識細胞からの能動的または受動的な色素損失、フォトブリーチング、長期間にわたって画像化された場合の毒性など、いくつかの制限に苦しんでいます33。過去10年間で、遺伝的にコードされたカルシウム指標は、様々な形態のニューロン活動を画像化するための主力製品となっている。これらの指標は、修飾蛍光タンパク質と、Ca2+イオンの結合後に蛍光強度を急速に切り替えるカルシウムキレートタンパク質とを組み合わせる34。これらの新しい指標の適用は広範であり、in vitroおよびin vivo設定の両方で細胞内カルシウム過渡現象の視覚化をはるかに容易にすることを可能にする。GCaMPとして知られるこれらの遺伝的にコードされたレポーターの1つのファミリーは、現在広く利用されている。これらの指標は、C末端カルモジュリンドメインを含み、続いて緑色蛍光タンパク質(GFP)を含み、N末端カルモジュリン結合領域によってキャップされている35、36。カルモジュリンドメインへのカルシウム結合は、カルモジュリン結合領域との相互作用を誘発し、タンパク質全体の構造における立体構造変化およびGFP部分の蛍光の実質的な増加をもたらす35,36。長年にわたり、このレポーターファミリーは、それぞれがわずかに異なる特性を有する特定の動態(低速、中速、および高速)を有する特定のカルシウム過渡現象について、異なる読み出しを可能にするために、いくつかの進化を遂げてきた37,38。ここで、レポーターGcaMP6の使用が強調されており、これは、インビボおよびインビトロの両方のニューロンにおける単一活動電位および樹状カルシウム一過性を検出することが以前に示されている37。
シナプス前領域のカルシウム一過性はシナプス小胞融合事象を誘発し、シナプスへの神経伝達物質放出を引き起こし、シナプス後細胞におけるシグナル伝達事象の開始を引き起こす28,39。シナプス小胞は、細胞が恒常的に安定した細胞膜表面積および容易に放出可能な融合可能な膜結合小胞のプールを維持するので、急速に放出され、リサイクルされる40。ここで使用されるスチリル色素は、脂質膜に対して親和性を有し、周囲の脂質環境の秩序に基づいてその発光特性を特異的に変化させる41、42。したがって、これは、シナプス小胞のリサイクルを標識し、ニューロン刺激後に後に放出されるこれらの小胞のその後の追跡のための理想的なツールである41,42。生成および最適化されたプロトコルは、Gaffieldらによって最初に記述された概念の適応であり、スチリル色素標識シナプス小胞穿刺を経時的に連続的に視覚化することを可能にする41。
ここでは、2つの関連する蛍光ベースの方法論が記載されており、シナプス伝達に関与する特定の細胞事象を確実に報告する。培養ニューロンにおける脱分極媒介シナプス前終末カルシウム流入およびシナプス小胞エキソサイトーシスのダイナミクスをプローブするためのプロトコルが定義されている。ここで、方法および代表的な結果は、これらの細胞型を用いた公表された研究があるように、インビトロモデル系として原発性げっ歯類皮質または運動ニューロンを使用することに焦点を当てている43,44。しかし、これらの方法は、分化したヒトi3皮質様ニューロン45にも適用可能であり、現在、当研究室で進行中の実験では、両方のプロトコルでも成功しています。一般的なプロトコルは、図1に示すステップワイズ線形形式で概説されています。要するに、神経突起におけるカルシウム動態を研究するために、成熟ニューロンをプラスミドDNAでトランスフェクトし、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター下で蛍光レポーターGCaMP6mを発現させる37、46。トランスフェクトされた細胞は、低レベルの基底緑色蛍光を有し、カルシウムの存在下で増加する。関心領域は、我々の操作全体を通して蛍光変化を監視するために指定される。これにより、カルシウムの高度に空間的および時間的に局在する変動を測定することができます37,46。シナプス小胞の融合と放出を評価するために、成熟ニューロンはシナプス前細胞で神経伝達物質でリサイクルされ、改質され、リロードされるにつれてシナプス小胞膜に取り込まれたスチリル色素をロードされる41,42,43,47,48。この目的のために使用されている現在の色素は、神経突起に沿ってシナプス小胞を標識し、Kraszewskiらによるスチリル色素とシナプトタグミンの共染色によって示されたように、ライブイメージング実験においてこれらの領域の代理として使用されている49。ここにも実施された同様の染色の代表的な画像が含まれる(図2A)。これまでの研究者らは、神経筋接合部および海馬ニューロンにおけるシナプス小胞ダイナミクスを報告するために、このような色素を広範囲に使用してきた48,49,50,51,52,53,54,55,56.色素を負荷した小胞の点状領域を選択し、小胞放出後の蛍光強度の低下をモニタリングすることにより、刺激後の機能的シナプス伝達能力および放出の時間的ダイナミクスを研究することができる43。両方の方法において、高濃度の塩化カリウムを含む培地が使用され、細胞を脱分極させてニューロン活性を模倣する。イメージングパラメータは、ベースライン正規化とそれに続く刺激キャプチャ期間にまたがる1秒未満の間隔をキャプチャするように指定されます。各時点での蛍光測定値が決定され、バックグラウンドに正規化され、実験期間にわたって定量化されます。カルシウム流入媒介性GCaMP6m蛍光増加または効果的なシナプス小胞エキソサイトーシスチリル色素放出蛍光減少は、この戦略を通して検出することができる。これら2つのプロトコルの詳細な方法論的セットアップとパラメータ、およびそれらの利点と制限事項に関する議論については、以下で説明します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62813/62813fig01.jpg"> 図 1: 一般的なプロトコル プロセス全体の視覚的レンダリング。 (1)初代げっ歯類ニューロンを単離し、選択した成熟時点まで インビトロで 培養する。(2)シナプス活性のレポーターとしてGCaMP DNAまたはスチリル色素を導入する。(3)ライブイメージング搭載共焦点顕微鏡と関連ソフトウェアを用いたイメージングパラダイムの設定ベースライン記録期間を開始します。(4)細胞がまだライブ画像キャプチャを受けている間、高いKCl浴灌流を介してニューロンを刺激する。(5)蛍光強度測定値を経時的に評価し、カルシウム過渡現象またはシナプス小胞融合を測定する。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62813/62813fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

<table><tbody><tr><td>20倍空気対物レンズ</td><td>ニコン</td><td></td><td>イメージング用</td></tr><tr><td>40倍油浸対物レンズ</td><td>ニコン</td><td></td> イメージング<td>用</td></tr><tr><td>B27サプリメント</td><td>Thermo Scientific</td><td>17504044</td><td>神経成長サプリメント</td></tr><tr><td>BD注射器(針なし)、50 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-689-8</td><td>重力灌流アセンブリの一部</td></tr><tr><td>バイオセーフティ 細胞培養フード</td><td>Baker</td><td>SterilGARD III SG403A</td><td>無敗症細胞の培養、トランスフェクション、および色素ローディング</td></tr><tr><td>b-メルカプトエタノール</td><td>ミリポアシグマ</td><td>M3148</td><td>神経細胞培養の培養と維持用</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>ミリポアシグマ</td><td>A9418</td><td>神経細胞培養物の調製用</td></tr><tr><td>塩化カルシウム二水和物</td><td>ミリポアシグマ</td><td>223506</td><td>aCSF溶液の成分</td></tr><tr><td>細胞培養 CO2 インキュベーター</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-998-123</td><td>ニューロンの培養と維持用</td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>エッペンドルフ</td><td>5810R</td><td>神経細胞培養準備用</td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>エクリプス Ti +A1R コア</td><td>蛍光イメージング用</td></tr><tr><td>CoolSNAP ES2&nbsp;CCDカメラ</td><td>フォトメトリクス</td><td></td><td>画像取得用</td></tr><tr><td>D-グルコース</td><td>ミリポアシグマ</td><td>G8270</td><td>aCSF溶液の成分</td></tr><tr><td>DNase</td><td>ミリポアシグマ</td><td>D5025</td><td>神経細胞培養用</td></tr><tr><td>調製用 女性、時限妊娠 スプレイグ・ドーリーラット</td><td>チャールズ川</td><td>400SASSD</td><td>胚性皮質および脊髄運動ニューロン培養の準備用</td></tr><tr><td>FITCフィルターキューブ</td><td>ニコン</td><td>77032509</td><td>イメージング用 Gcamp カルシウム過渡現象</td></tr><tr><td>FM4-64 スチリル色素</td><td>Invitrogen</td><td>T13320</td><td>イメージング用 シナプス小胞放出</td></tr><tr><td>ガラス底シャーレ (厚さ #1.5)</td><td>CellVis</td><td>D35-10-1.5-N</td><td>イメージング対応培養皿上のニューロンの成長用</td></tr><tr><td>ガラスパスツールピペット</td><td>グレインジャー</td><td>52NK56</td><td>ニューロン培養物の準備用</td></tr><tr><td>ハンクス平衡塩溶液(HBSS)</td><td>ミリポアシグマ</td><td>H6648</td><td>神経培養の準備用</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>ミリポアシグマ</td><td>H3375</td><td>aCSF溶液の成分</td></tr><tr><td>高KCl人工脳脊髄液(aCSF)</td><td></td><td></td><td>イメージング用。レシピをご覧ください*</td></tr><tr><td>馬の血清</td><td>ミリポアシグマ</td><td>H1138</td><td>ニューロンの培養と維持用</td></tr><tr><td>層流解剖フード</td><td>NUAIRE</td><td>NU-301-630</td><td>神経細胞培養物の調製用</td></tr><tr><td>ラミニン</td><td>Thermo Scientific</td><td>23017015</td><td>神経細胞培養物の調製用</td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15 Medium</td><td>Thermo Scientific</td><td>11415064</td><td>神経細胞培養物の調製</td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red</td><td>Thermo Scientific</td><td>21083027</td><td>神経細胞培養物の調製用</td></tr><tr><td>L-グルタミン (200 mM)</td><td>Thermo Scientific</td><td>25030149</td><td>神経培養サプリメント</td></tr><tr><td>リポフェクタミン 2000 トランスフェクション試薬</td><td>Thermo Scientific</td><td>11668019</td><td>神経細胞トランスフェクション用</td></tr><tr><td>低KCl人工脳脊髄流体(aCSF)</td><td></td><td></td><td>イメージング用。レシピをご覧ください*</td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td>ミリ<td>ポアシグマ</td><td>208337</td><td>aCSFソリューションのコンポーネント</td></tr>Microsoft <tr><td>Excel</td>データ分析<td>/正規化用</td><td>Microsoft</td><td></td>ソフトウェア</tr><tr><td>Nalgene&nbsp;フィルターユニット、0.2 & マイクロ;m PES</td><td>Thermo Scientific</td><td>565-0020</td><td>aCSF溶液用フィルターユニット</td></tr><tr><td>神経基礎培地</td><td>Thermo Scientific</td><td>21103049</td><td>神経細胞培養の培養と維持に</td></tr><tr><td>NIS-Elements Advanced Research</td><td>Nikon</td><td></td><td>画像キャプチャと分析用ソフトウェア</td></tr><tr><td>Nunc 15 mL コニカルチューブ</td><td>Thermo Scientific</td><td>339650</td><td>神経細胞の培養とバッファーの調製に溶液</td></tr><tr><td>Nunc 50 mL コニカルチューブ</td><td>Thermo Scientific</td><td>339652</td><td>神経細胞培養および緩衝液の調製用</td></tr><tr><td>Optiprep</td><td>Millipore Sigma</td><td>D1556</td><td>神経細胞培養物の調製用</td></tr><tr><td>Papain</td><td>Millipore Sigma</td><td>P4762</td><td>神経細胞培養の調製用</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL)</td><td>Thermo Scientific</td><td>15140122</td><td>神経培養物の細菌汚染を防ぐために</td></tr><tr><td>灌流システム</td><td>ワーナー・インスツルメンツ</td><td>SF-77B</td><td>aCSF</td></tr><tr><td>交換用 灌流チューブ</td><td>コール・パーマー</td><td>UX-30526-14</td><td>重力灌流アセンブリの一部</td></tr><tr><td>pGP-CMV-Gcamp6m プラスミド</td><td>Addgene</td><td>40754</td><td>イメージング用 カルシウム過渡現象</td></tr><tr><td>ポリ-D-リジン臭化水素酸</td><td>ミリポアシグマ</td><td>P7886</td><td>ガラス底シャーレ用コーティング剤</td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>ミリポアシグマ</td><td>P3911</td><td>aCSF液成分</td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>ミリポアシグマ</td><td>S5761</td><td>aCSF液成分</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>ミリポアシグマ</td><td>S9888</td><td>aCSF液成分</td></tr><tr><td>ステージトップインキュベータ</td>ー <td>東海ヒット</td><td></td><td>イメージング期間中の生きたニューロンのインキュベーション用</td></tr><tr><td>TRITC フィルターキューブ</td><td>ニコン</td><td>77032809</td><td>イメージング用 FM4-64</td></tr><tr><td>トリプシン阻害剤</td><td>ミリポアシグマ</td><td>T6414</td><td>神経細胞培養物調製用</td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA(0.25%)、フェノールレッド</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>25200056</td><td>神経細胞培養物調製用</td></tr><tr><td>防振テーブル</td><td>新港</td><td>VIP320X2430-135520</td><td>顕微鏡用テーブル・スタンド</td></tr></tbody></table>

筋萎縮性側索硬化症のモデルにおけるシナプス機能のリアルタイム蛍光測定

Real-Time Fluorescent Measurement of Synaptic Functions in Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

神経変性の前に、筋萎縮性側索硬化症(ALS)および/または前頭葉性認知症(FTLD)患者の運動および認知障害の原因は、ニューロンと運動ニューロンおよび筋肉との間のコミュニケーションの機能不全である。シナプス伝達の根底にあるプロセスは、膜脱分極依存性シナプス小胞融合およびシナプスへの神経伝達物質の放出を含む。このプロセスは、シナプス小胞が存在するシナプス前終末への局在的なカルシウム流入によって起こる。ここで、プロトコルは、培養ニューロンにおける脱分極媒介シナプス小胞エキソサイトーシスおよびシナプス前末端カルシウム流入ダイナミクスを確実に報告する蛍光ベースのライブイメージング方法論を記載する。
シナプス小胞膜に取り込まれたスチリル色素を用いて、シナプス小胞放出が解明される。一方、カルシウムの侵入を研究するために、遺伝子コードされた蛍光レポーターであるGcamp6mが使用される。我々は、ニューロン活性を模倣するために、高い塩化カリウム媒介性脱分極を採用している。シナプス小胞エキソサイトーシスを明確に定量するために、我々は、時間の関数として正規化されたスチリル色素蛍光の損失を測定する。同様の刺激条件下では、カルシウム流入の場合、Gcamp6m蛍光が増加する。この蛍光変化の正規化および定量化は、スチリル色素プロトコールと同様の方法で行われる。これらの方法は、蛍光標識された変異タンパク質のトランスフェクションベースの過剰発現と多重化することができる。これらのプロトコルは、初代げっ歯類皮質および運動ニューロンを利用して、 FUS−ALSおよび C9ORF72−ALSのモデルにおけるシナプス機能障害を研究するために広く使用されている。これらのプロトコルは、ニューロン通信を改善し得る化合物の迅速なスクリーニングを容易に可能にする。したがって、これらの方法は、ALSの研究だけでなく、神経変性および発達神経科学研究のすべての分野にとって貴重です。

上記のプロトコールの成功した実施に続いて、典型的なスチリル色素シナプス小胞放出実験について代表的な結果が示されている。培養ラット初代皮質ニューロンは、セクション6に記載の方法を用いて色素を負荷した。色素負荷の特異性は、シナプス小胞マーカーシナプトフィジンとの共標識によって決定した。陽性の点状穿刺のスチリル色素の大部分は、このマーカーに対して共陽性である(図2A)。スチリル色素イメージングに使用される設定がフォトブリーチングを引き起こすかどうかを判断するために、通常、未処理のウェルに色素をロードし、蛍光値が一定であることを確認するために刺激なしで長時間10分間画像化します。
さらに、 図2Aのようにシナプトフィジンとスチリル色素の共標識を用いた結果が再び示される。これらの蛍光色素は、TRITCスチリル色素イメージングのセクション6に示されたパラダイムを使用して共イメージングされ、さらにDAPIチャネル上の高強度レーザーパワーを使用してシナプトフィジン蛍光の二重捕捉が...

シナプス伝達に必要な細胞内事象を視覚化するために、2つの関連する方法が記載されている。これらのプロトコルは、 in vitro 培養ニューロンの生細胞イメージングを使用して、シナプス前カルシウム流入およびシナプス小胞膜融合のダイナミクスのリアルタイムモニタリングを可能にする。

Before neuronal degeneration, the cause of motor and cognitive deficits in patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and/or frontotemporal lobe ...

これらの方法は、実験的操作、疾患原因タンパク質、またはRNAがシナプスプロセスに影響を与えることができるかどうか、および治療用化合物が機能を回復できるかどうかについての迅速な評価を可能にする。これらの技術は、電気生理学と比較して比較的短期間にニューロンのグループからシナプス機能の信頼できる読み出しを提供する。このプロトコルは、ニューロンの発達または変性のあらゆる疾患に適用することができる。これは、初代げっ歯類ニューロン培養物、および誘導多能性幹細胞に由来するニューロンに対して良好に機能する。まず、共焦点イメージング取得ソフトウェアを使用して画像取得設定を最適化します。励起パワー露光時間、検出器ゲイン、フレームレートをすべてのサンプルで一定に保ちます。タイムラプスイメージングでは、染料の漂白を最小限に抑えるために、512 x 512のアスペクト比と1秒あたり2つの画像のフレームレートを選択します。次に、GCaMP6 M/GCaMP 3とフィッツィー、ステアロイル色素とTrixiの蛍光励起、二色性、発光フィルターの組み合わせを選択します。タイムラプスイメージング中のZドリフトを回避するには、共焦点イメージング集録ソフトウェアの完璧なフォーカス機能を使用してください。次に、画像取得パネルの時間タブを選択します。フェーズ 1 の場合は、間隔を 500 ミリ秒、期間を 3 ~ 5 分に設定します。フェーズ 2 では、間隔を 500 ミリ秒、期間を 5 分に設定します。次に、人工脳脊髄液またはACSF用の重力灌流装置を組み立てるために、装置の上部にある50ミリリットルのシリンジに高塩化カリウムACSF緩衝液をロードし、流量を毎分1ミリリットルに設定した。次に、ニューロンを含む35ミリリットルのガラス皿を、灌流チューブの端を皿の端に置いた共焦点イメージングステージにロードし、イメージング用のフィールドを選択します。トランスフェクション後48時間、初代皮質または運動ニューロンを低塩化カリウムACSF緩衝液中で摂氏37度で10分間インキュベートする。次いで、ピペットを用いて吸引して緩衝液を除去し、50ミリモルの塩化カリウムおよび10マイクロモルのスチリル色素を含むACSFで満たされたガラス底のシャーレ上に暗所でニューロンをロードする。5分後、ローディング溶液を除去し、ニューロンを摂氏37度の低塩化カリウムACSF緩衝液に10分間浴びせて、非特異的色素ローディングを除去した。次いで、ディッシュを倒立共焦点顕微鏡の撮像ステージ上に置き、20回の空気対物レンズまたは40回の油浸対物レンズの下で細胞を観察した。546ナノメートルのレーザーを使用してスチール染料を励起し、570〜620ナノメートルのバンドパスフィルターを使用して発光を収集します。イメージングフィールドを選択し、完璧な焦点を合わせた後、明視野、Trixi、蛍光マーカーチャンネルを含む単一の静止画を撮影して、ニューロン境界をマークします。次に、集録ソフトウェアでRun Nowを開始し、3~5分間基本記録を実行して色素強度の変動を除外します。フェーズ2への切り替えで、灌流システムのオンボタンをトリガーし、50ミリモルの塩化カリウムをニューロンに絶えず灌流して、色素のアンロードを容易にします。録音を5分間実行し、灌流システムのオフスイッチをトリガーします。後で共焦点ソフトウェアを使用してデータ分析のために実験を保存します。GCaMP6Mによるトランスフェクション後48時間、初代げっ歯類皮質ニューロンを低塩化カリウムACSFで15分間インキュベートする。次に、ディッシュをイメージングプラットフォームにマウントし、フィッツィーフィルターと20倍または40倍対物レンズを使用してGCaMP 6M蛍光を視覚化しました。イメージングフィールドを選択し、完璧なフォーカスを合わせた後、明視野、Fitzy、蛍光マーカーチャンネルを使用して単一の静止画を撮影し、ニューロン境界をマークします。次に、集録ソフトウェアでRun Nowを起動し、基本録音を3~5分間実行します。次に、以前に実証したように50ミリモルの塩化カリウムを含むACSFをニューロンに灌流し、5分間記録する。画像取得が止まったら、実験を保存し、共焦点ソフトによるデータ解析に進みます。画像解析では、共焦点ソフトウェアでタイムラプス画像を開き、「画像」をクリックして画像を整列させ、次に処理を行い、次に現在の文書を整列させてから、「最初のフレームに整列」を選択します。ROI選択ツールを使用して神経突起に沿った関心領域を選択し、バックグラウンド蛍光強度を表すROIもマークします。次に、時間測定パネルから測定機能を開始し、選択したROIの経時的な生蛍光を測定します。測定後、生の蛍光強度を表計算ソフトにエクスポートします。スチリル色素を負荷した培養ラット初代皮質ニューロンをここに示す。色素装填の特異性は、シナプス小胞マーカーシナプトフィジンによる共標識によって決定され、滅菌色素陽性穿刺の大部分はこのマーカーに対して共陽性である。イメージング期間全体にわたる生の強度値を解析したところ、シナプトフィジンと強度は一定のままであるが、スチリル色素の強度は刺激後に減少することが明らかになった。緑色蛍光タンパク質トランスフェクトされた対照ニューロンの場合、シナプス小胞放出の成功は、高い塩化カリウム脱分極時に色素蛍光の顕著な損失をもたらした。この代表的なビデオは、刺激に続いて新しい右領域にスチリル色素を選択的にアンロードするニューロンを示す。対照的に、GA50に色素ペプチド反復構築物に連結されたC9ORF72でトランスフェクトされたニューロンでは、シナプス伝達の障害は、高い塩化カリウム脱分極後でさえも保持された色素蛍光によって表される。塩化カリウム脱分極前後のGCaMP6Mでトランスフェクトされた皮質ニューロンの代表的な蛍光像をここに示す。蛍光値の増加およびGCaMP six Mでトランスフェクトされた皮質ニューロンは、塩化カリウム誘導脱分極後の神経突起へのカルシウム進入を示す。ベースライン記録期間の終わりに、ニューロンは低い蛍光でGCaMP6Mを発現した。その後、刺激の開始時に劇的な蛍光増加が観察される。スチリル色素およびGCaMPの蛍光ベースライン記録が安定していることを確認してください。画像のドリフトを避けるために、常に完璧なフォーカスを使用し、ポスト画像データの処理が困難になります。ニューロンのさらなる培養は、皿が氾濫中に空気にさらされるため、推奨されない。しかし、タンパク質またはRNAの免疫染色または抽出は、シナプス変化の潜在的な原因を評価することができる。

real-time-fluorescent-measurement-synaptic-functions-models

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

このビデオは、マウスの脳スライスの単一の皮質線条体シナプスにおけるグルタミン酸の放出とクリアランスの評価を示しています。電気刺激は、シナプスでのグルタミン酸の放出を促進します。放出されたグルタミン酸は、センサータンパク質の蛍光を変化させ、時間の経過とともに崩壊し、放出効率とクリアランス効率を示します。...

マウス脳スライスにおける単一ニューロンシナプスにおけるグルタミン酸放出とクリアランスの解析

出典:Krishnamurthy, K. et al. 筋萎縮性側索硬化症のモデルにおけるシナプス機能のリアルタイム蛍光測定。J. Vis. Exp.

筋萎縮性側索硬化症のIn Vitroモデルにおけるシナプスカルシウムダイナミクスの蛍光イメージング

神経筋接合部(NMJ)は、シナプス不全に至ることもあるさまざまな条件で変化します。本稿では、このような構造変化を定量化するための蛍光顕微鏡法について述べる。...

神経筋接合部：測定シナプスサイズ、断片化および共焦点蛍光顕微鏡を用いてシナプスタンパク質の密度の変化

ここでは、トニックおよび酵素結合微小電極アレイ（MEA）を使用して、in vivoで相性の細胞外グルタミン酸変化を測定の空間的及び時間的に正確な方法のセットアップ、ソフトウェアナビゲーション、およびデータ分析を記載しています。...

アルツハイマー病のマウスモデルにおけるトニックと相性グルタミン酸を測定するための酵素ベースのバイオセンサーを使用して

このプロトコルは、NLS-NES-GFPタンパク質の核内取り込みにおけるリアルタイム変化を定量化することにより、運動ニューロン様NSC-34細胞内の核細胞質輸送速度を敏感に測定する方法を記載する。...

運動ニューロン様NSC-34細胞内のリアルタイムでの核細胞質輸送を測定するアッセイ

我々は、単一のコルチコストリアタールグルタミン酸シナプスにおけるグルタミン酸放出とクリアランスのバランスを、成体マウスからの急性スライスにおける評価するプロトコルを提示する。このプロトコルは、グルタミン酸検出用の蛍光センサ...

正常マウスおよびハンチントンマウスからの急性脳スライスにおけるグルタミン酸放出および取り込みの単一シナプス指標

げっ歯類やヒト被験者の脳組織から 生き生きとした...

げっ歯類とヒト脳組織におけるアクチン重合状態評価のための時間効率の高い蛍光分光法ベースアッセイ

ここでは、蛍光相関分光法を用いて、細胞ライセートおよび生細胞におけるタンパク質オリゴマーおよび凝集を測定する手順を紹介する。...

蛍光相関分光法を用いたタンパク質凝集の検出

グルコース取り込みは、FRETベースの遺伝的にコードされたグルコースセンサーによって示されるように、TAR DNA結合タンパク質(TDP-43)タンパク質障害の影響を受ける ショウジョウバエ...

TDP-43蛋白症の ショウジョウバエ モデルにおけるグルコース取り込みの測定

トランスジェニック蛍光マウスを用いて、生きた動物における無傷の坐骨神経の運動軸索および感覚軸索内のシグナル伝達エンドソームおよびミトコンドリアの インビボ 軸索輸送を評価するための詳細なプロトコールが記載されている。...

軸索輸送の In Vivo イメージングのためのツールキットの拡張

ここでは、hSOD1G93Aラットモデルにおける筋萎縮性側索硬化症の病態生理に関する研究のために、細胞内Ca2+のタイムラプスビデオイメージングのために、ラット皮質からグリア細胞、アストロサイト、およびミクログリアの初代培養を調製する方法に関するプロトコルを紹介します。...

ラットアストロサイトおよびミクログリアの初代培養と筋萎縮性側索硬化症の研究におけるそれらの使用

学ぶ シナプス機能のリアルタイム蛍光測定法を用いて、培養神経細胞におけるカルシウム動態とシナプス小胞放出を可視化する手法です。iPSC由来神経細胞や初代齧歯類皮質神経細胞を用いて、電気生理学的評価より短時間でシナプス機能の信頼性のある読み出しが可能となります。

筋萎縮性側索硬化症のモデルにおけるシナプス機能のリアルタイム蛍光測定

さらに動画を探す