出芽酵母サッカロミセスセレビシエにおけるサブソキアドタンパク質の局在化の評価
2021年7月19日
最近の進歩にもかかわらず、多くの酵母ミトコンドリアタンパク質は依然としてその機能が全く知られていません。このプロトコルは、タンパク質の分子機能の解明の基礎であったタンパク質の局所的な局在を決定するための、シンプルで信頼性の高い方法を提供します。
このプロトコルは、ミトコンドリアタンパク質機能解明の基本的なステップと考えられている酵母ミトコンドリアタンパク質のサブシリンダライゼーションを決定するように設計されています。プロトコルは異なった成長条件で維持される私達の酵母株のために適している。ミトコンドリア研究として研究のための強力なツールを表します。
まず、グリセロールストックから80Cに貯蔵されたストリーク細胞は、YPD寒天プレート上に、目的の株から単一コロニーを単一のコロニーを単離する。30°Cでプレートを2〜3日間インキュベートする。10〜30mlのYPGal培地を含む100mlのエルレンマイヤーフラスコにYPD寒天プレートから2〜3個のコロニーを接種してスターター培養を調製する。
フラスコを30°Cで24時間インキュベートし、180~200rpmで激しく揺れます。スターター培養液を新鮮なYPGal培地の1 Lに希釈し、600 nmで0.1未満の光学密度にします。光密度が1〜1.5に達するまで、180〜200rpmで180〜200rpmで激しく揺れ、30°Cで細胞を培養します。
テキストに記載されているように、高度に精製されたミトコンドリアの分離を行う。そして、高精製ミトコンドリア製剤のタンパク質濃度を決定し、ブラッドフォードアッセイを使用して、製造業者の指示に従う。氷冷SEMバッファーでタンパク質濃度を10 mg/mlに調整します。
高度に精製されたミトコンドリア40 lを4つの1.5 mlの予冷および標識されたマイクロ遠心分離管に移す。第1および第2の管にSEMバッファーの360 lを加える。そして3及び第4の管におけるEM緩衝液の360 lと。
ピペット化スキームを用いて、テキストに従って、第2および第4のチューブに4Lの新しく調製したプロテイナーゼKを加える。すべてのチューブを穏やかに混合した後、時折混合して30分間氷の上でインキュベートします。プロテナーゼK活性を停止するには、4つのチューブすべてに4Lの200 mM PMSFを加える。
4 C.で30分間チューブを20,000 x g遠心分離し、ペレットを邪魔することなく上清を新しい1.5mlの事前冷蔵ラベル付きマイクロ遠心チューブに集めます。次に、ペレットを氷冷SEMバッファーの400 lに再懸濁する。プロテイナーゼKの可能な痕跡を不活性化するには、収集した上清を沈殿させ、トリクロロ酢酸でペレットを10%氷上のチューブを10分間インキュベートする最終濃度に再懸濁します。
トリクロロ酢酸処理サンプルを4Cで12,000 x gで10分間遠心分離し、上清を除去した後、ペレットを200lのサンプルバッファーに再懸濁させる。ブロモフェノールブルーが黄色に変わったら、1 Mトリスベースの1〜5 lを加え、青色になるまで追加します。すべてのチューブに200 mM PMSFの4 lを追加します。
SDS-PAGEとウェスタンブロットによるさらなる分析まで、サンプルを80°Cで保管してください。高度に精製されたミトコンドリアの200 lを1.5mlの予冷したマイクロ遠心分離管に移す。ミトコンドリアを氷冷SEMバッファーで1倍希釈します。
少量と互換性のあるソニケーターを使用して、氷の上で30秒間ミトコンドリアを3回超音波処理します。サンプルを4°Cで30分間遠心し、新しい1.5mlのプレチルドマイクロ遠心分離チューブに上清を集めます。可溶性タンパク質画分のS"としてチューブを標識した後、氷の上にチューブを保持します。
前のステップからペレットを氷冷SEMバッファーの400 lに再懸濁します。再懸濁されたペレットの100 lを新しい1.5mlの予冷したマイクロ遠心分離管に移す。サブセクション粒子の分画の場合は、チューブに「SMP」というラベルを付け、チューブを氷の上に置きます。
残りの300lの再懸濁ペレットを、作りたての200mM炭酸ナトリウムで1倍に希釈します。希釈したサンプルを氷の上で30分間インキュベートします。次いで、サンプルを4 Cで100,000 x gで30分間遠心分離し、上清を新しい1.5mlのプレチルされたマイクロ遠心分離管に集める。
炭酸塩上清分の分率の場合はサンプルを「CS」とラベル付けし、チューブを氷の上に置きます。前のステップからペレットを氷冷SEMバッファーの400 lに再懸濁します。そして、炭酸塩析出画分のCP"としてサンプルに名前を付けます。
すべてのサンプルをトリクロロ酢酸で沈殿し、最終濃度の10%にし、氷上のチューブを10分間インキュベートします。次いで、4Cで12,000xgで10分間サンプルを遠心分離し、上清を除去した後、サンプルバッファー内の各ペレットを再懸濁する。サンプルバッファーが黄色になった場合は、1 M トリス ベースの 1 ~ 5 l を青色になるまで追加します。
200 mM PMSF の 1 l をすべてのチューブに加え、SDS-PAGE とウェスタンブロットによる分析が行なくなるまで 80°C で保管します。粗ミトコンドリア画分をスクロース密度勾配遠心分離で精製し、他の細胞汚染物質の減少が観察された。ミトコンドリアからミトプラストへの変換は、ペレット中の膜間空間タンパク質シトクロムb2の消失によって監視された。
上清に併せる外観で。膜間タンパク質Sco1のタンパク質K媒介分解は、浸透衝撃による外膜破壊のために観察された。外側ミトコンドリア膜の完全性は、ペレット画分におけるプロテナーゼK分解に対するシトクロムb2およびSco1の保護によって確認された。
同様に、マトリックス可溶性タンパク質KGDの保護は、内ミトコンドリア膜完全性を確認した。Prx1ウェスタンブロットプロファイルは、膜間空間およびマトリックスにおける二重ミトコンドリア局在化を示唆した。ミトコンドリアは、超音波処理と炭酸塩抽出を行い、膜タンパク質のトポロジーを調査した。
含分膜タンパク質はペレット画分に残った。上清画分でKGDが検出された。ペレット中のKGDタンパク質の検出は、SMPの形成に影響を与える超音波処理パラメータの変動によるものである。
炭酸ナトリウム処理後、KGDおよびSMP画分を可溶化し、上清画分中に見つかった。Prx1ウェスタンブロットプロファイルは、膜周辺との関連を示唆した。サブセクオンドリア分画プロトコルの成功のためには、PMSFをサンプルに添加することによって低血圧腫脹後のプロテアーゼK活性を停止することが重要である。
サイトは、サブソキアドリアルタンパク質の局在に関する情報を提供します。このプロトコルは、ミトコンドリアサブコンパートメントのプロテオーム研究中に基本的であるミトコンドリア製剤の完全性をチェックするためにも使用できます。
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概要
このプロトコルは、酵母ミトコンドリアタンパク質の亜ミトコンドリア局在を決定するように設計されており、これはそれらの分子機能を解明するための基本的なステップです。様々な成長条件下で維持される酵母株に適しています。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 分子生物学
背景
- 多くの酵母ミトコンドリアタンパク質の機能は未知です。
- タンパク質の局在を理解することは機能解明に重要です。
- このプロトコルはミトコンドリアタンパク質の研究を助けます。
- 酵母はミトコンドリア研究のモデル生物として機能します。
研究の目的
- タンパク質の局在を決定する信頼できる方法を提供すること。
- ミトコンドリアタンパク質機能の理解を促進すること。
- ミトコンドリア生物学の研究をサポートすること。
使用される方法
- グリセロール株からYPDアガープレートに細胞を塗布すること。
- プレートを30°Cで2〜3日間インキュベートすること。
- YPGal培地でスターター培養を準備すること。
- さらなる分析のために単一コロニーを分離すること。
主要な結果
- タンパク質局在研究のための酵母コロニーの成功的な分離。
- 亜ミトコンドリア局在のための信頼できるプロトコルの確立。
- ミトコンドリアタンパク質機能のさらなる研究の促進。
- 異なる成長条件でのプロトコルの適用可能性の証明。
結論
- このプロトコルはミトコンドリア研究のための強力なツールです。
- タンパク質の局在を理解することは機能解明に不可欠です。
- これはミトコンドリアタンパク質に関する将来の研究の道を開きます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Accurate submitochondrial protein localization in Saccharomyces cerevisiae is critical for de-risking mitochondrial target validation and clarifying protein function in early discovery. This robust protocol enables precise mapping of protein topology, supporting predictive confidence in mitochondrial biology and facilitating risk-adjusted portfolio decisions. The method's reproducibility and quantitative outputs position it as a foundational capability for mitochondrial proteome characterization in biopharma R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional deconvolution of mitochondrial proteins by resolving suborganellar localization.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing matrix, intermembrane space, and membrane-associated proteins.
- Facilitates hypothesis-driven interrogation of mitochondrial pathways relevant to disease models.
- Provides a reference framework for comparative studies across yeast strains and growth conditions.
Screening & Assay Development
- Delivers validated mitochondrial preparations for downstream biochemical and proteomic assays.
- Standardizes subfractionation and protease protection workflows for reproducible localization data.
- Enables quantitative western blot readouts for assay calibration and benchmarking.
- Prepares robust input material for compound screening targeting mitochondrial compartments.
Translational & Preclinical Research
- Aligns yeast mitochondrial protein localization with translational biomarker discovery when disease relevance is established.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling cross-species localization comparisons.
- Reduces biological ambiguity in mitochondrial target selection for preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates at the interface of early discovery and lead identification, providing foundational data for target validation and mechanistic studies in mitochondrial biology.
- Discovery Biology: Resolves protein localization and topology, informing pathway mapping and functional annotation.
- Screening: Supplies reproducible, quantitative localization data to support assay development and screening readiness.
- Analytics: Generates SDS-PAGE and western blot outputs for comparative analysis of protein distribution across mitochondrial subcompartments.
- Translational Research: Enables alignment of yeast mitochondrial protein data with higher-order models when relevant.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized workflow adaptable to diverse yeast strains and experimental conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in mitochondrial target validation and reduces mechanistic uncertainty.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible subfractionation and localization workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital allocation by clarifying mitochondrial protein function.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of mitochondrial targets and supports cross-program comparability.
Implementation Considerations
- Requires expertise in yeast mitochondrial isolation, subfractionation, and western blot analysis.
- Demands access to centrifugation, sonication, and proteomic instrumentation.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of sample preparation and analytical protocols.
- Adaptable to various yeast strains and growth conditions with protocol optimization.
- Dependent on effective protease inhibition and fraction integrity for reliable localization data.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:33
Yeast Cells Growth
1:37
Isolation of Highly Purified Mitochondria
2:03
Sub-Mitochondrial Fractionation: Hypotonic Swelling Using Proteinase K
4:01
Sub-Mitochondrial Fractionation: Sonication and Carbonate Extraction
6:31
Results: Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae
8:14
Conclusion
