再発流産における4種類の子宮内膜免疫細胞型の多重化蛍光免疫物質化学的染色
2021年8月4日
多重免疫体化学とマルチスペクトルイメージングの進歩にもかかわらず、子宮内膜における主要な免疫細胞の密度とクラスタリングを同時に特徴付けるのは依然として課題です。本論文では、子宮内膜における4種類の免疫細胞の同時局在化のための詳細な多重染色プロトコルとイメージングについて述べている。
本技術は、最大7つのマーカーを検出するために同じ種で育てられた抗体の使用を可能にする。手順を実証することは、研究室の技術者ルーシア・チャンです。ホルマリン固定パラフィン埋め込みガラススライドを組織サンプルに取り付けたスライドを準備し、スライドをオーブンに平らに置き、上向きの組織で摂氏60度で焼く。
1時間後、原稿に記載されているように、10分ごとにスライドを脱ワックスし、水分補給します。トリスバッファー塩水にスライドを沈め、次にメタノールで希釈したホルムアルデヒドの混合物で満たされたプラスチック製のスライドボックスに、サンプルを固定します。次に、滑り台を脱イオン水で2回2分間洗います。
pH 6.0でクエン酸バッファーを充填した耐熱ボックスにスライドのラックを配置することにより、エピトープ検索に進みます。次いで、箱をマイクロ波に入れ、スライドを100%の電力で50秒間加熱し、次いで20分を20%の電力で加熱し、同じ温度を維持する。スライドを蒸留水で洗い流し、TBSTで洗浄した後、過酸化阻止溶液を含む瓶にスライドを10分間浸します。
インキュベーションの後、蒸留水でスライドを洗い流し、TBSTで洗浄し、疎水性バリアペンを使用してスライド上の組織セクションの周りの境界をマークします。次に、TBSTでスライドをすすい、ブロッキングバッファーで組織切片を覆い、加湿チャンバーで15分間スライドをインキュベートします。ブロッキング試薬を除去するために、まず目的の一次抗体でスライドをインキュベートし、次にTBSTでスライドを3回洗浄して一次抗体を除去し、ポリマーワサビペルオキシダーゼ標識を用いてインキュベートする前に、二次抗体を標識する。
インキュベーションに続いて、TSA作業溶液用オパールフローラを塗布する前にスライドを洗浄し、次に抗原検索バッファーでスライドを洗い流します。マイクロ波安全容器で20分間、マイクロ波の安全容器で20%の電力を20秒間、マイクロ波で100%の電力で、抗原検索バッファー内のスライドをマイクロ波で加熱することにより、マイクロ波ベースのストリッピングを行います。サンプルを室温で15分間冷却した後、蒸留水とTBSTでスライドを洗い流し、後でダッピー溶液で5分間インキュベートします。
次に、適切な取り付け媒体で取り付ける前にスライドを空気乾燥させます。スライドのイメージングの前に、ワークステーションで適切なフィルタを事前に設定します。200倍の倍率で分析するために、最低10フィールドをキャプチャします。
セルをカウントするには、ステップバーのカウントオブジェクトボタンをクリックして、オブジェクトカウント設定パネルを表示します。組織がセグメント化されている場合は、対象物が見つかる組織カテゴリを選択します。次に、自動スケールまたは固定スケールから目的の信号スケーリングを選択します。
オブジェクトセグメンテーションの場合は、ドロップダウン リストからプライマリ コンポーネントを選択します。結合されたオブジェクトではなく、個別のオブジェクトとして他のオブジェクトに触れているオブジェクトを検出するには、[最大サイズとピクセル]ボックスをオンにして、分割を細かく選択します。次に、免疫細胞内のすべての間質細胞を別々にカウントし、各撮影画像の全体の間質細胞数に対する免疫細胞の割合としてデータを発現させる。
その後、最終的なセル数をすべてのフィールドの平均として報告します。ビュー エディターを使用して、結果のデータ テーブルを後処理で確認し、カウント データ テーブルをエクスポートします。代表的な分析では、子宮内膜サンプル内の4つの免疫細胞タイプが分化しています。
処理された画像は、上皮、および間質コンパートメントとしての組織のセグメンテーションを示しています。多重免疫染色は、肥沃な対照女性と原因不明の再発流産を有する女性からの子宮内膜生検に対して行われ、CD3、CD56、CD68、およびCD20を代表する私たちのための単一階が免疫染色で明らかになった。免疫音が特定されると、サイトカインの下でさらに染色することは、移植の成功のためのそれらの相互作用およびメカニズムに対処するのに役立ちます。
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概要
本研究では、マルチプレックス免疫組織化学およびマルチスペクトルイメージングを用いて、子宮内膜における主要な免疫細胞の密度とクラスター形成を同時に特性評価するという課題に取り組んでいます。子宮内膜における4種類の免疫細胞を同時に局在化させるための詳細な染色プロトコルについて記述します。
研究の主要構成要素
研究分野
- 免疫学
- 子宮内膜生物学
- マルチプレックスイメージング技術
背景
- 生殖生物学における免疫細胞特性解析の重要性
- 従来の染色法における課題
- イメージング技術の進歩
使用方法
- マルチプレックス免疫組織化学染色
- ホルマリン固定パラフィン包埋組織検体
- マルチスペクトルイメージング
主な結果
- 子宮内膜において、4種類の免疫細胞（CD3、CD56、CD68、CD20）の分化に成功した。
- 免疫細胞の分布およびクラスター化を可視化した。
- 今後の研究に向けたプロトコルの改良案を提示した。
結論
- 本研究では、子宮内膜における免疫細胞の解析のための信頼性の高い手法を提示しています。
- これは、生殖健康および着床の成功を理解する上で重要な意義を持ちます。
よくある質問
産業上の重要性
マルチプレックス蛍光免疫組織化学染色は、単一の組織切片内で複数の免疫細胞集団を同時に定量することを可能にし、生殖免疫学研究における重要な課題を解決します。このアプローチは、患者由来のサンプルから直接、空間的に分解されたマルチプレックス免疫プロファイリングデータを提供することで、子宮内膜微小環境に関する仮説のメカニズム的なリスク低減を支援します。本手法は、妊孕な状態と病的な状態との間で免疫細胞の密度とクラスター形成を直接比較することを可能にし、着床不全や反復流産に関連するターゲット検証における予測の信頼性を高めます。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： CD3、CD56、CD68、およびCD20マーカーを同時に検出することで、子宮内膜における免疫細胞相互作用に関する治療仮説の検証が可能になります。
- 運用の価値： 連続切片作成と染色の必要性を減らし、貴重な臨床検体を保存しながら、組織切片あたりのデータ密度を高めることができます。
- 予測の信頼性： 定量的で空間的に分解された免疫細胞指標を提供し、着床時の子宮内膜と免疫系のクロストークに関与するターゲットの生物学的リスク低減をサポートします。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- アッセイの準備状況：高コンテンツイメージングプラットフォームおよび自動画像解析ワークフローに適した、標準化され再現性のある蛍光読み取り値を生成します。
- 拡張性：ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）組織バイオバンクと互換性があり、バイオマーカー探索のための大規模コホートのレトロスペクティブ解析が可能です。
- マルチプレックスの最適化：連続的な染色およびストリッピングサイクルを通じて蛍光色素の干渉に対処し、各免疫細胞マーカーのシグナル特異性を確保します。
翻訳・前臨床研究
- 疾患関連システム：ヒトの子宮内膜生検組織に直接適用可能であり、習慣性流産における免疫調節不全を研究するための臨床的に意義のあるモデルを提供します。
- トランスレーショナルな連続性：サンプル間で一貫した免疫表現型解析を可能にすることで、発見段階の免疫プロファイリングと前臨床検証を橋渡しします。
- メカニズムのリスク低減：初期の細胞型同定後のサイトカインを介した免疫細胞相互作用の調査をサポートし、パスウェイレベルでのターゲット検証を促進します。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法はディスカバリー生物学の段階に適合し、特に生殖免疫学プログラムにおける免疫標的のバリデーションおよび表現型スクリーニングの取り組みを支援します。
- 探索生物学：着床 window 期間中の子宮内膜における免疫細胞組成および空間的組織化に関する仮説検証を可能にする。
- スクリーニング：定量的な免疫蛍光出力を生成し、実験条件間での免疫細胞密度およびクラスター形成パターンの比較を可能にする。
- 解析：免疫細胞のフェノタイプ判定および機能状態の推論に寄与する、マルチプレックス蛍光強度および共局在データを提供する。
- トランスレーショナルリサーチ：下流の機能アッセイに有効な免疫細胞マーカーを提供することで、ヒト試料の解析からメカニズム追究のための後続研究への継続性を支援する。
- 企業レベルの再利用：子宮内膜およびその他の組織における複数の免疫プロファイリング研究に適用可能な、再利用可能な免疫染色プラットフォームを確立する。
運用および企業への影響
- 科学的価値：疾患組織と対照組織における免疫細胞集団の直接的かつマルチプレックスな比較を可能にすることで、標的バリデーションにおける予測の信頼性を向上させます。
- 運用上の価値：単一のスライド上で最適化された連続染色およびストリッピングプロトコルを用いることで、試薬効率を向上させ、ばらつきを低減します。
- 戦略的価値：着床の成功または失敗に対する免疫微小環境の寄与を明確にすることで、生殖治療におけるgo/no-go判断の根拠を提供します。
- ポートフォリオへの影響：免疫細胞の密度、クラスター形成、および上皮または間質コンパートメントとの空間的相関に基づいた、リスク調整後の標的優先順位付けを可能にします。
実施上の考慮事項
- 正確なシグナルの検出および定量化には、免疫組織化学、蛍光顕微鏡、およびマルチスペクトル画像解析の専門知識が必要です。
- マイクロ波ベースの抗原賦活化システム、蛍光対応のスライドスキャナー、およびマルチプレックスサイクリング用の検証済みOpal蛍光色素キットへのアクセスに依存します。
- マルチプレックス結果の再現性を確保するためには、ラボ間でブロッキング、抗体インキュベーション、およびストリッピング条件の標準化が必要です。
- CD3、CD56、CD68、CD20以外の異なる組織型や免疫細胞マーカーに本手法を適用する場合、抗体パネルの最適化および検証ステップの適応が必要です。
- 実用上の制限として、蛍光色素のブリードスルーの可能性があり、イメージング時の慎重なスペクトル分離が必要となりますが、これは連続的なストリッピングと検証済みのフィルター設定によって対応されます。
